Soutenance mémoire
Le genre Enterococcus
Le premier entérocoque a été observé de manière informelle par Escherich en 1886. Il nomme alors cette bactérie Micrococcus ovalis (Flahaut et al., 1997). En 1989, deux équipes réalisent les premières descriptions des entérocoques. Thiercelin décrit une bactérie d’origine intestinale qu’il nomme Enterococcus, tandis que McCallum et Hasting isolent une bactérie d’une endocardite infectieuse, qu’ils identifient initialement comme Micrococcus zymogenes. Cette dernière sera renommée ultérieurement Enterococcus faecalis (Arias and Murray, 2012; Flahaut et al., 1997). La classification et la phylogénie des entérocoques ont été fortement modifiées par l’évolution des techniques d’identification et de nombreux arrangements taxonomiques se sont produits pour distinguer ce genre. À l’exception de quelques espèces, les entérocoques sont classés dans le groupe D des streptocoques de Lancefield (Foulquié Moreno et al., 2006). Néanmoins, des études basées sur l’hybridation ADN-ADN et ADN-ARNr, sur l’analyse des ARN ribosomiques et sur l’analyse immunologique de certaines enzymes, comme l’aldolase, ont permis de différencier le genre Enterococcus du genre Streptococcus, avec lequel il a été confondu jusqu’en 1984, ainsi que des lactocoques et autres coques à Gram positif (Devriese et al., 2006; Flahaut et al., 1997; Schleifer and Kilpper-Balz, 1984; Selleck et al., 2019). Le genre Enterococcus comprend 49 espèces partageant de nombreux caractères communs (Selleck et al., 2019; Zhong et al., 2017).
Caractéristiques générales des entérocoques
Les entérocoques sont des coques à Gram-positif de forme sphérique ou ovoïde d’une taille comprise entre 0,6 à 2,5 µm . Ils sont aéro-anaérobie facultatifs, chimioorganotrophes, non-mobiles, à catalase négative et oxydase négative, non sporulants, et forment des chaînettes de taille variable (Arias and Murray, 2012; Devriese et al., 2006; Flahaut et al., 1997; Foulquié Moreno et al., 2006). Ils possèdent un ADN avec un pourcentage en GC faible, entre 37 à 45%, et riche en éléments mobiles (Devriese et al., 2006; Flahaut et al., 1997). Ils se caractérisent notamment par leur faculté à croître dans des conditions hostiles et ainsi se développent en présence de 6,5% de chlorure de sodium, de 40% de sels biliaires, à des pH de 4,1 à 9,6, ou encore sur une grande gamme de température de 10°C à 45°C, avec une température optimale de croissance à 35°C (Arias and Murray, 2012; Deibel et al., 1963; Devriese et al., 2006; Foulquié Moreno et al., 2006; Selleck et al., 2019). La majorité des entérocoques peut résister à une congélation prolongée et à une pasteurisation basse de 30 min à 60°C (Flahaut et al., 1997; Foulquié Moreno et al., 2006).
Les entérocoques sont des micro-organismes ubiquitaires de l’environnement et de la flore intestinale de nombreux animaux, en particulier de l’homme et autres mammifères (Devriese et al., 2006; Flahaut et al., 1997). La présence de certaines espèces dans l’environnement, comme E. faecalis et E. faecium, est considérée comme le signe d’une contamination fécale (Devriese et al., 2006; Wheeler et al., 2002). L’abondance et la nature des espèces d’entérocoques présentes au sein du tractus gastro-intestinal diffèrent en fonction des animaux (Devriese et al., 2006). Chez l’homme, E. faecalis et E. faecium sont les entérocoques majoritairement présents et leurs proportions dans l’intestin varient en fonction de nombreux facteurs, tels que le compartiment intestinal, l’âge et l’alimentation (Devriese et al., 2006; Flahaut et al., 1997). Chez un individu sain, ils représentent une petite portion du microbiote intestinal (<0,1%) (Arias and Murray, 2012; Devriese et al., 2006; Lebreton et al., 2014). Enfin, certaines souches sont utilisées comme probiotiques ou dans l’élaboration de produits alimentaires, mais le potentiel pathogène des entérocoques remet en cause leurs applications pharmaceutiques et industrielles (Foulquié Moreno et al., 2006; Franz et al., 2003; Wang et al., 2020).
Pathogénicité des entérocoques
Bien que les entérocoques soient des organismes commensaux de l’homme, ils s’avèrent également être des pathogènes opportunistes hors du compartiment intestinal, touchant principalement des personnes sensibles, comme les nourrissons, les personnes immunodéprimées et les porteurs de matériels médicaux invasifs comme les cathéters (Devriese et al., 2006; Flahaut et al., 1997; Murray, 1990). Ainsi, en sus de leur faculté à traverser la barrière intestinale (Wells et al., 1990), les entérocoques possèdent différents facteurs de pathogénicité leur permettant notamment d’adhérer aux cellules de l’hôte et aux matériels inertes, de résister aux protocoles de désinfections et de coloniser efficacement de nouveaux hôtes. De plus, ils peuvent former des biofilms augmentant ainsi leur résistance, notamment aux antibiotiques et à la phagocytose (Arias and Murray, 2012; García Solache and Rice, 2019; Van Tyne and Gilmore, 2014). Une des clés de leur pouvoir infectieux repose sur une impressionnante adaptabilité à leur environnement, leur permettant de survivre dans des conditions hostiles, notamment dans le milieu hospitalier. Cette persistance dans l’environnement leur permet de se hisser comme pathogène de première envergure dans les infections associées aux soins liées également en grande partie à leurs résistances intrinsèques et acquises à de nombreux antibiotiques fréquemment utilisés en clinique (Arias and Murray, 2012; Devriese et al., 2006; García-Solache and Rice, 2019; Gilmore et al., 2013; Jett et al., 1994; Selleck et al., 2019).
Infections à entérocoques et antibiorésistance
Le genre Enterococcus représente le 2ème genre pathogène le plus recensé dans les infections associées aux soins (IAS) entre 2015 et 2017 aux Etats-Unis (14,8% des IAS) . Les espèces majoritairement responsables sont E. faecalis (7,9% des IAS) et E. faecium (3,8% des IAS) (Weiner-Lastinger et al., 2019). En Europe, E. faecalis et E. faecium représentent respectivement les 4ème (6,8%) et 7ème (4,5%) espèces bactériennes les plus fréquemment signalées au EARS-Net (ECDC, 2020). En effet, ces deux espèces représentent à elles seules 90 à 95% des infections à entérocoques (Arias and Murray, 2012; Gordon et al., 1992; Jones et al., 1997). Ces pathologies se manifestent principalement par des infections intra-abdominales et du tractus urinaire, des endocardites et des bactériémies (Devriese et al., 2006; Flahaut et al., 1997; Murray, 1990). Deux facteurs de risque principaux sont à l’origine de ces infections. D’une part, le port de matériels médicaux invasifs est à risque car ceux-ci peuvent être colonisés par des microorganismes. D’autre part, un traitement antibiotique, en particulier pour les antibiotiques inefficaces sur les entérocoques, favorise la sélection de ces pathogènes opportunistes et prédispose donc à ces infections (Devriese et al., 2006; Murray, 1990).
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Table des matières
INTRODUCTION
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
CONTEXTE
CHAPITRE I : MODÈLES D’ÉTUDES
I.1 Le genre Enterococcus
I.1.1 Caractéristiques générales des entérocoques
I.1.2 Pathogénicité des entérocoques
I.1.3 Infections à entérocoques et antibiorésistance
I.1.4 Traitements des infections à entérocoques : vers une impasse thérapeutique
I.2 L’espèce Staphylococcus aureus
I.2.1 Caractères généraux de S. aureus
I.2.2 Pathogénicité et infections à S. aureus
I.2.3 Résistances aux antibiotiques et traitements de S. aureus
CHAPITRE II : LA RÉSISTANCE AUX ΒÊTA-LACTAMINES CHEZ LES BACTÉRIES À GRAM POSITIF
II.1 Structure et classification des β-lactamines
II.2 Les PBPs : cibles des β-lactamines
II.2.1 Nature et rôles des PBPs
II.2.2 Diversité des PBPs
II.3 Mode d’action des β-lactamines
II.4 Mécanismes de résistance aux β-lactamines
II.4.1 La résistance enzymatique
II.4.2 La résistance par modification de cible
CHAPITRE III : LA D-ALANYLATION DES ACIDES TÉICHOÏQUES COMME CIBLE THÉRAPEUTIQUE
III.1 Les acides téichoïques
III.1.1 Les acides téichoïques liés à la paroi (WTA)
III.1.2 Les acides lipotéichoïques (LTA)
III.1.3 La modification des acides téichoïques
III.2 La D-alanylation des acides téichoïques
III.2.1 Mécanisme de la D-alanylation : l’opéron dlt
III.2.2 Importance de la D-alanylation chez les bactéries à Gram positif
III.2.2.1 Conservation et distribution de l’opéron dlt
III.2.2.2 Effets pléiotropes de la D-alanylation
III.3 La D-alanylation : une cible prometteuse
III.3.1 Lien entre la D-alanylation des TAs et la résistance aux molécules antimicrobiennes
III.3.2 Les inhibiteurs de la D-alanylation des TAs
OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THÈSE
MATÉRIELS ET MÉTHODES
CHAPITRE I : MATÉRIELS BIOLOGIQUES ET CHIMIQUES UTILISÉS
I.1 Souches bactériennes et plasmides
I.2 Milieux de culture
I.3 Réactifs
CHAPITRE II : TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE ET DE BIOCHIMIE
II.1 Transformation par électroporation
II.1.1 Préparation de cellules électrocompétentes et transformation d’E. coli
II.1.2 Préparation de cellules électrocompétentes et transformation d’entérocoques
II.1.3 Préparation de cellules électrocompétentes et transformation de S. aureus
II.2 Solubilisation du pMADΔdltA et extraction de plasmides
II.3 Réactions de polymérisation en chaîne (PCR)
II.4 Construction des mutants dltA chez S. aureus
II.5 Séquençages
II.6 Trans-complémentation par le plasmide pRB473-dlt
II.7 Quantification des esters de D-alanine des acides téichoïques
CHAPITRE III : TECHNIQUES D’ANALYSES PHYSIOLOGIQUES
III.1 Détermination et analyse des concentrations minimales inhibitrices
III.1.1 Détermination de la concentration minimale inhibitrice
III.1.2 Analyse statistique
III.2 Détermination de la survie bactérienne
III.3 Étude de l’inhibition et de l’éradication de biofilm par la méthode du cristal violet
III.3.1 Préparation des biofilms
III.3.2 Coloration du biofilm par le cristal violet
III.3.3 Quantification du biofilm
CHAPITRE IV : ÉTUDES DANS L’HÔTE GALLERIA MELLONELLA
IV.1 Infection et traitement dans le modèle G. mellonella
IV.1.1 Préparation de l’inoculum
IV.1.2 Infection bactérienne
IV.1.3 Traitement post-infection
IV.2 Analyse statistique
RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
CHAPITRE I : INACTIVER LA D-ALANYLATION DES ACIDES TÉICHOÏQUES POUR SENSIBILISER LES ENTÉROCOQUES D’INTÉRÊT CLINIQUE AUX β-LACTAMINES
I.1 Résumé de la publication
I.2 Publication publiée au Journal of Antimicrobial Chemotherapy
I.3 Données supplémentaires de la publication
CHAPITRE II : UN INHIBITEUR DE LA D-ALANYLATION DES ACIDES TÉICHOÏQUES COMME ADJUVANT ANTI-RÉSISTANCE ET ANTI-BIOFILM POUR POTENTIALISER L’EFFET DES ΒÊTA-LACTAMINES CONTRE S. AUREUS RÉSISTANT À LA MÉTICILLINE
II.1 Résumé de la publication
II.2 Publication en cours de préparation
II.3 Données supplémentaires de la publication
CHAPITRE III : DISCUSSION GÉNÉRALE
CONCLUSION
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE
