CARACTERISTIQUES DES EAUX USEES PARAMETRES BACTERIOLOGIQUES

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Les bactéries Sulfito-réductrices

Les Clostridium sulfito-réducteurs sont souvent considérés comme des témoins de pollution fécale. La forme spore, beaucoup plus résistante que les formes végétatives des Coliformes fécaux et des Streptocoques fécaux, permettrait ainsi de déceler une pollution fécale ancienne ou intermittente. Sans débattre de l‟intérêt réel d‟une telle indication concernant la date de pollution, il faut cependant considérer que si les Clostridium sulfito-reductreurs peuvent certes être des germes fécaux, ce sont également des germes telluriques et que, de ce fait, aucune spécificité d‟origine fécale ne peut être attribuée à leur mise en évidence.
Dans une telle optique d‟interprétation, il y a intérêt à ne rechercher que les espèces les plus susceptibles d‟être d‟origine fécale : c‟est le cas en particulier de Clostridium perfringens. (Rodier, 2005).
Selon Rejsek (2002), les spores des bactéries anaérobies Sulfito-réductrices et celles de Clostridium perfringens peuvent être intéressantes en tant qu‟indicateurs de traitement. Ainsi, elles peuvent montrer l‟efficacité d‟un traitement de filtration, où elles se comportent comme des kystes de parasites, aussi bien au niveau d‟une station de traitement qu‟au niveau du sol : signe d‟efficacité de la filtration naturelle. De plus, Clostridium perfringens, sous sa forme sporulée, est très résistant à la chloration et va donc se comporter comme les microorganismes plus difficiles à mettre en évidence. La nomenclature sulfito-réducteurs est attribuée à ces germes car ils ont comme point commun de réduire le sulfite de sodium en sulfure selon la réaction suivante :
SO3-2 +6H+ +6e-→S2- +3H2O

PROBLEMES LIEES A L’EAU

Les eaux douces et côtières polluées par des matières fécales humaines et animales transportent divers microorganismes pathogènes pour l’homme, notamment des bactéries, des virus et des protozoaires. Ceux-ci sont le plus souvent transmis par voie féco-orale, et la contamination de l’homme se réalise alors soit par consommation d’eau de boisson, soit par consommation d’aliments contaminés par l’eau, soit encore lors d’un bain ou d’un contact avec des eaux à usage récréatif. La contamination des eaux de surface par des microorganismes d’origine fécale existe depuis longtemps, dès que l’eau a été utilisée comme vecteur d’élimination des déchets (George & Seravis, 2002). Les pathogènes transmis par l’eau sont aujourd’hui responsables d’affections. Ces affections sont principalement gastro-intestinales et leurs symptômes incluent des nausées, vomissements, diarrhées, fièvres et maux d’estomac. Les microorganismes pathogènes les plus fréquemment rencontrés dans les eaux de surface ainsi que les pathologies dont ils sont responsables et salées sont repris dans le Tableau 1.
A l‟opposé de la situation dans les pays industrialisés, les chiffres publiés par l‟Organisation Mondiale de la Santé (OMS, 2004) révèlent que, dans les pays en voie de développement, chaque année 1,8 million de personnes dont 90% d‟enfants de moins de cinq ans meurent de maladies diarrhéiques et à l‟échelle mondiale, près de 90% des maladies diarrhéiques sont imputables à la mauvaise qualité de l‟eau de boisson et à un assainissement insuffisant des eaux usées (Nash, 1993).L‟eau est devenue aujourd‟hui un enjeu stratégique mondial dont la gestion doit impérativement s’intégrer dans une perspective politique de développement durable.

PRESENTATION DE L’INSTITUT PASTEUR DE MADAGASCAR (IPM)

L‟Institut Pasteur de Madagascar est une organisation scientifique privé Malagasy. Installé à Madagascar en 1898, il est régi par la convention de 1961 liant l‟Institut Pasteur à Paris avec Ministère de la Santé de Madagascar.

PRINCIPALES MISSIONS

L‟Institut Pasteur se focalise sur quatre missions principales :
•Recherches scientifiques : ses travaux permettent, non seulement de mieux comprendre les maladies qui touchent la population Malagasy, mais aussi d‟explorer les domaines très vastes et variés : microbiologie et maladies infectieuses, immunologie, épidémiologie, entomologie, socio-anthropologie.
•Formation : l‟Institut Pasteur de Madagascar offre chaque année à plus de 250 étudiants, personnels médicaux, scientifiques et techniciens (nationaux et internationaux) une formation et plus d‟une quarantaine de bourses de thèse, DEA ou de Master, en partenariat avec l‟université tutelle des étudiants. En collaboration avec le réseau international des Instituts Pasteurs, des cours internationaux sont également dispensés par l‟IPM.
•Santé publique : l‟Institut Pasteur de Madagascar intervienne sur plusieurs types d‟épidémie. Grace à son réseau sentinelle, il est capable d‟alerter les autorités compétentes
•Services : Centre de Biologie clinique, Centre International de Vaccination, Dispensaire anti rabique et Laboratoire d‟hygiène des aliments et de l‟environnement Ses activités s‟étendent tant à Madagascar qu‟au niveau régional et international.

ORGANISATION DE L’IPM

L‟Institut Pasteur de Madagascar est actuellement dirigé par Docteur André SPIEGEL, assistée par des chefs de laboratoire et responsables techniques dans les différents services. L‟ensemble des unités de recherche et services sont réparti dans le campus de l‟Institut. Ils sont installés dans plusieurs bâtiments répartis dans le parc de l‟IPM.
• Pavillon André DODIN abritant le Laboratoire d‟Hygiène des Aliments et de l‟Environnement (LHAE) où j‟ai passé mon stage, le Plateforme d‟Epidémio-
• Pavillon GIRARD : où se trouve le Centre de Biologie Clinique (CBC), l‟unité de la
• Pavillon LAVARAN : il comprend l‟unité de Paludisme et de l‟Immunologie.
• Pavillon THIROUX : il comporte les unités Entomologies Médicales et de Virologies.
• Pavillon MONOD : il constitue la direction, l‟unité de parasitologie.
•Pavillon RADAODY-RALAROSY : il comporte le centre international de Vaccination (CIV) et le centre de traitement antirabique.
Ce stage de fin de mémoire a été réalisé au sein du Laboratoire d‟Hygiène des Aliments et Environnement (LHAE).

LABORATOIRE D’HYGIENE DES ALIMENTS ET DE L’ENVIRONNEMENT

Historique

Le Laboratoire d‟Hygiène des Aliments et de l‟Environnement (LHAE) est créé pour succéder au laboratoire de bactériologie alimentaire (BACTAL) qui fut créé à l‟IPM en 1987 pour des analyses microbiologiques des eaux et des aliments. La construction du LHAE s‟est terminée en Août 2003 et il est inaugurée officiellement par son Excellence Monsieur le Président de la République Marc Ravalomanana le 04 juin 2004.

Présentation du « LHAE »

Le Laboratoire d‟Hygiène des Aliments et de l‟Environnement (LHAE) est un laboratoire d‟analyse microbiologique et physico-chimique de l‟Institut Pasteur de Madagascar, il se focalise sur l‟hygiène alimentaire et sur la lutte des risques liés à l‟environnement pour assurer la surveillance des risques sanitaires liés à l‟alimentation, à l‟environnement de production (air et surface), aux eaux de consommations, de soins et de loisirs. Ce laboratoire est accrédité par le COFRAC. Il permet notamment, le contrôle microbiologique des produits agro-alimentaires malagasy destinés à l‟exportation, et contribue ainsi au développement économique et social du pays. Reconnu par le Ministère chargé de la Pêche et chargé de l‟Elevage, c‟est le laboratoire officiel pour le contrôle bactériologique des produits halieutiques et assure le plan national de surveillance des vibrions sur les produits de la mer. LHAE collabore avec des professionnels de l‟agro-alimentaire pour un renforcement des capacités analytiques au plan national, notamment par des formations organisées auprès des laboratoires d‟autocontrôles. Le laboratoire continue à développer une expertise locale dans le domaine de la sécurité sanitaire 5 des eaux et des aliments. Il participe ainsi à la surveillance et au contrôle des principales maladies entériques infectieuses liées à l‟alimentation ou d‟origines hydriques. Le laboratoire d‟hygiène des Aliments et de l‟Environnement est dirigé par Madame Alexandra BASTAUD-CELESTIN et se compose de quatre plateaux techniques :
•Une unité semi automatisée de fabrication des milieux de culture ;
• Un laboratoire d‟analyse microbiologique des aliments, des eaux et de l‟environnement ;
• Un laboratoire d‟analyse physico-chimique ;
• Une Plateforme d‟Epidémio-Surveillance en santé animale

MATERIEL ET METHODES

SITE DE L’ETUDE

Le Marais Masay est un ancien marécage transformé en bassin tampon qui recueille les eaux pluviales et les eaux usées des zones aux alentours pour éviter l‟inondation des quartiers bas mais a également un rôle épurateur des eaux de certains rejets urbains. Il possède les caractéristiques d‟un milieu fragile car entouré de zones urbanisées. La répartition de sa faune en particulier des oiseaux et des poissons est assez particulière. Il est entouré de zones d‟habitations et quelques entreprises (textiles, torréfaction du café, commerces…)
Le plan d‟aménagement du Marais Masay est délimité au Nord par la route d‟Alarobia et celle d‟Analamahitsy, au Sud par le «petit boulevard», à l‟Ouest par le canal d‟Andriantany ainsi que la route des hydrocarbures et à l‟Est par la RN3 reliant Antananarivo-Anjozorobe. Le lac s‟etend sur une surface plus de 100 hectares, sa profondeur est environ 0,5 m en saison séche et 1,5m en saison de pluie. La photo 1 suivant nous montre la vue sattellitaire de ce lac.

MATERIELS D’ETUDES

MATERIELS BIOLOGIQUES D’ETUDE

Type d’eau à étudier

Dans le cadre de cette étude, l‟eau qui a fait l‟objet d‟analyse est constituée par de l‟eau usée urbaine provenant d‟un lac Marais Masay, au niveau des trois sites (entrée, lac, sortie).

Site d’étude

Les prélèvements d‟eaux et stratégie d‟échantillonnage ont été définis et effectuées par l‟équipe de Laboratoire d‟Hygiène des Aliments et de l‟Environnement (LHAE) de l‟Institut Pasteur de Madagascar (IPM), les prélèvements ont été effectués sur le lac de Marais Masay, sur une période de 5 mois. Au total, 36 échantillons ont été prélevés à raison de 12 échantillons pour chaque site. Trois sites ont été choisis pour faire de prélèvement dont l‟une de l‟entrée d‟eau du lac, la sortie et dans le lac.

MILIEU D’ETUDE

Milieux pour la recherche et dénombrement des germes dans l’eau usée

Milieu Gélose Lactosé au TTC et au Tergitol 7

C‟est un milieu sélectif et différentiel qui permet la détection et l‟énumération des Coliformes et d‟Escherichia coli dans l‟échantillon d‟eau.

Milieu Slanetz et Bartley

C‟est un milieu solide sélectif permettant l‟isolement et l‟énumération de Streptocoques fécaux ou Entérocoques intestinaux par la méthode de filtration par membrane.

Milieu TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar)

C‟est un milieu sélectif et différentiel pour le dénombrement et identification présomptive de Clostridium perfringens.

Milieux d’enrichissement

Bouillons RVS et MKTTn

Ce sont des milieux nutritifs liquides dépourvus d‟agar. Ces milieux sont utilisés pour revivifier les souches de Salmonelles.

Bouillon EPSA (Eau Peptonnée Saline Alcaline)

Même pour les précédents mais spécifiquement pour les souches de Vibrios.

Milieux pour la purification des souches à tester

Milieu gélose nutritif

La gélose nutritive est un milieu habituellement employé pour la culture et l‟isolement des microorganismes, elle permet aussi de détecter la pureté des souches.

Milieu gélose nutritif salé

Même utilisation que le précèdent, mais spécifiquement pour les souches de Vibrios.

II-2-2-4- Milieu pour le test antibiogramme

Milieu Muëller Hinton
C‟est un milieu de culture solide utilisé pour mettre en évidence l‟activité des souches bactériennes isolées vis-à-vis des germes pathogènes.
La composition de chaque milieu est donnée dans l‟annexe II.

METHODE D’ANALYSE

Les analyses microbiologiques ont été effectuées au Laboratoire d‟Hygiène des Aliments et de l‟Environnement(LHAE) de l‟Institut Pasteur de Madagascar selon les méthodes AFNOR.

PREPARATION DES DILUTIONS

Le nombre de flacons stériles correspondant au nombre de dilutions choisies a été préparé sur une paillasse. L‟eau distillée stérile de 90ml a été introduit dans chacun d‟eux. Puis, l‟échantillon a agité afin d‟obtenir une répartition homogène des microorganismes. Cet échantillon homogénéisé a été transféré à l‟aide d‟une pipette stérile 10 ml dans le premier flacon contenant 90ml d‟eau distillée. Cette dilution représentation 10-1.Ensuite, 10 ml de cette dilution a été transféré dans le deuxième flacon stérile (dilution 10-2) et ainsi de suite.

GERMES RECHERCHES

L‟analyse bactériologique vise à la recherche et le dénombrement des germes suivants :
-Les germes indicateurs de contamination, dans 100ml d‟eau, comme les Coliformes totaux Escherichia coli, et les Streptocoques fécaux ou Entérocoques intestinaux puisque ces germes sont spécifiques de la flore intestinale et ne sont pas nécessairement pathogènes. En plus de leur rôle d‟appréciation du risque d‟une contamination par des matières fécales pouvant véhiculer des organismes pathogènes, permettent également d‟évaluer d‟un traitement de désinfection de l‟eau (Rodier, 1996).
-Les Spores Anaérobies Sulfito-réductrices en tant qu‟il appartient à la famille des Bacillaceae formant des spores Sulfito-réducteurs plus résistants que les bactéries végétatives et formant ainsi une indication de pollution fécale ancienne.
-Les germes pathogènes comme le Salmonellaet le Vibriocar la plupart de ceux qui sont ingérés font courir un risque sérieux de maladies dès qu‟ils sont présents dans l‟eau et leur élimination doit être prioritaire.
-Les autres germes présents dans les échantillons d‟eau pour évaluer le niveau de contamination microbienne de ce lac.

PROTOCOLE D’ANALYSE

Il existe deux méthodes pour déterminer la présence de ces germes dans l‟eau :
-la méthode par filtration
-la méthode du nombre le plus probable ou NPP.

Méthode par filtration sur membrane

Principe
Avec la pince stérile, une membrane est saisie par son bord extérieur puis déposée sur la face poreuse de l‟appareil. Cent (100) ml d‟eau à analyser est versée dans l‟entonnoir réservoir et sous l‟action du vide s‟écoule lentement.
Dès qu‟elle parait sèche, la membrane est saisie par son extrême bord puis placée sur le milieu de culture choisi (Rodier, 1996). Cette méthode est analogue pour la recherche des Coliformes totaux, Escherichia coli, Entérocoques intestinaux et les spores ASR, seuls les milieux de culture différente.
Recherche et dénombrement des Coliformes totaux et d’Escherichia coli : NF EN ISO 9308-1 Mode opératoire :
Une boîte de gélose TTC est préparé en prenant soin de marquer le numéro de l‟échantillon
.Un volume d‟eau dilué à 10-4de 100ml est filtré. La membrane filtrante est placée sur la gélose TTC. Les boîtes sont incubées à 36±2°C pendant 21±3h.Les colonies typiques présentent une coloration jaune sous la membrane. Dix (10) colonies typiques sont repiquées sur une gélose non sélective (TCS) qui sera incubé à 36±2°C pendant 21±3h et dans le bouillon Tryptophane qui sera incubé à 44±1°C pendant 21±3h. Sur la gélose non sélective, les colonies présentes sont soumises à un test oxydase. La réaction est positive s‟il y a virage de couleur au bleu violet dans 30 secondes. Dans le milieu tryptophane, la présence d‟indole est vérifiée par ajout de réactif Kovacs de 0,2ml ou 0,3ml. La réaction est positive si la coloration est rouge à la surface du bouillon. Les colonies «oxydase -» et «indole +» sont considérés comme E. coli(Bourgeois et al., 1991).
Dénombrement
• Cas de Coliformes
Soit a, le nombre de colonies confirmées oxydase négatif ;
Soit n, le nombre total de colonies typiques dénombrées ;
Soit A, le nombre des colonies repiquées pour confirmation ;
Soit = × , le nombre de coliformes présents dans l‟échantillon.

Table des matières

INTRODUCTION
I-SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I-1- GENERALITES SUR LE LAC
I-1-1- DEFINITION
I-1-2- ORIGINE DU LAC
I-1-3- CARACTERES GENERAUX DES LACS
I-1-4- PRINCIPES DE FONCTIONNEMENTS
I-2- GENERALITES SUR LES EAUX USEES
I-2-1- DEFINITION
I-2-2- ORIGINE DES EAUX USEES
I-2-2-1- Origine industrielle
I-2-2-2- Origine domestique
I-2-2-3- Origine agricole
I-2-3- DIFFERENTS TYPES DES EAUX USEES
I-2-4- DIFFERENTES TYPES DE POLLUTION DE L‟EAU
I-2-4-1- Pollution chimique :
I-2-4-2- Pollution physique :
I-2-4-3- Pollution biologique :
I-2-4-4- Pollution organique :
I-2-4-5- Pollution radioactive :
I-2-5- CARACTERISTIQUES DES EAUX USEES PARAMETRES BACTERIOLOGIQUES
a) Les Coliformes
b) Les Streptocoques fécaux et Enterococcus
c) Les bactéries Sulfito-réductrices
I-3- PROBLEMES LIEES A L‟EAU
I-4- CRITERES : NORMES ET CLASSIFICATIONS
I-5- ETUDE DE QUELQUES TRAVAUX SIMILAIRE A L‟AUTRE TRAVAIL RECENT
I-6- PRESENTATION DE L‟INSTITUT PASTEUR DE MADAGASCAR (IPM)
I-6-1- PRINCIPALES MISSIONS
I-6-2- ORGANISATION DE L‟IPM
I-6-3- LABORATOIRE D‟HYGIENE DES ALIMENTS ET DE L‟ENVIRONNEMENT
I-6-3-1- Historique
I-6-3-2- Présentation du « LHAE »
II-MATERIEL ET METHODES
II-1- SITE DE L‟ETUDE
II-2- MATERIELS D‟ETUDES
II-2-1- MATERIELS BIOLOGIQUES D‟ETUDE
II-2-1-1- Type d‟eau à étudier
II-2-1-2- Site d‟étude
Caractéristiques des sites de prélèvements
II-2-1-3- Echantillonnage
II-2-2- MILIEU D‟ETUDE
II-2-2-1- Milieux pour la recherche et dénombrement des germes dans l‟eau usée
a) Milieu Gélose Lactosé au TTC et au Tergitol 7
b) Milieu Slanetz et Bartley
c) Milieu TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar)
II-2-2-2- Milieux d‟enrichissement
a) Bouillons RVS et MKTTn
b) Bouillon EPSA (Eau Peptonnée Saline Alcaline)
II-2-2-3- Milieux pour la purification des souches à tester
a) Milieu gélose nutritif
b) Milieu gélose nutritif salé
II-2-2-4- Milieu pour le test antibiogramme
Milieu Muëller Hinton
II-3- METHODE D‟ANALYSE
II-3-1- PREPARATION DES DILUTIONS
II-3-2- GERMES RECHERCHES
II-3-3- PROTOCOLE D‟ANALYSE
II-3-3-1- Méthode par filtration sur membrane
Principe
Recherche et dénombrement des Coliformes totaux et d‟Escherichia coli : NF EN ISO 9308-1
Recherche et dénombrement des Streptocoques Fécaux ou Entérocoques Intestinaux : NF EN ISO 7899-2
Recherche et dénombrements des Anaérobies Sulfito-réductrices (ASR) : NF EN ISO 26461-2 t90-417
II-3-3-2- Méthode par le nombre le plus probable ou NPP
Principe :
Recherche et dénombrement des Coliformes totaux et d‟Escherichia coli: NF EN ISO 9308-1
Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux ou Entérocoques intestinaux: NF EN ISO 7899-2
II-3-3-3- Recherche des Salmonelles : NF EN ISO 6579
a) Principe
b) Enrichissement sélectif
c) Isolement
d) Confirmation des colonies
MALDI TOF
e) Confirmation sérologique : SEROTYPAGE (Leyral et al., 2002)
f) Diagramme récapitulatif de recherche de Salmonella
II-3-3-4- Recherche de Vibrio
a) Principe :
b) Isolement :
c) Confirmation :
d) Diagramme récapitulatif de recherche de Vibrio
II-3-3-5- Recherches des autres germes
a) Principe :
b) Isolement :
c)Confirmation des colonies :
d) Diagramme récapitulatif de recherche des autres germes :
II-3-3-6- Test antibiogramme
II-3-3-7- Conservation des souches isolées
III -RESULTATS ET DISCUSSIONS
III-1- RESULTATS D‟ANALYSES
III-1-1- GERMES D‟ALTERATION ET IDENTIFICATEURS D‟HYGIENE
III-1-1-1- Coliformes totaux
a) Méthode par filtration :
b ) Méthode par Nombre le Plus Probable :
c) Dénombrement
III-1-1-2- Escherichia coli
a) Méthode par filtration :
b) Méthode par Nombre le Plus Probable :
c) Dénombrement
III-1-1-3- Entérocoques Intestinaux
a) Méthode par filtration :
b) Méthode par Nombre le Plus Probable :
c) Dénombrement
III-1-1-4- Spores des ASR
a) Méthode par filtration
b) Dénombrement
III-1-2- GERMES PATHOGENES ISOLEES
III-1-2-1- Salmonella
a) Identification des souches Salmonelles :
b) Sérotypage
III-1-2-2- Vibrio
a) Confirmation :
III-1-2-3- Autres germes
III-1-3- RESULTATS DE L‟ANTIBIOGRAMME
III-2- DISCUSSION
III-3- ETUDE COMPARATIVE AVEC LA LITERATURE
CONCLUSION
REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES

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