CARACTÉRISTIQUES DES AGENTS PATHOGÈNES ASSOCIÉS AUX TORTUES

LES TORTUES TERRESTRES ENDÉMIQUES

Les tortues terrestres endémiques de Madagascar proviennent des zones côtières de l’Ile : Astrochelys radiata se trouve dans la partie Sud ; Astrochelys yniphora, principalement, dans la savane de la partie Nord-Ouest ; Pyxis arachnoides dans la partie Sud-Ouest et Pyxis planicauda dans la zone sèche et dans les forêts tropicales à feuilles caduques de la partie Ouest (Caccone et al., 1999) (Annexe 2). Cinq espèces de tortues terrestres appartenant à la famille des Testudinidae sont présentes à Madagascar dont quatre sont endémiques telles que : Astrochelys radiata, Astrochelys yniphora, Pyxis arachnoides et Pyxis planicauda ; Kinixys belliana étant originaire d’Afrique a été introduite à Madagascar (Gandar et al., 2015). Ces reptiles sont parmi les espèces les plus protégées sur l’Ile (Annexe 3). Ces tortues endémiques sont classées parmi les espèces rares et menacées (Caccone et al., 1999). En effet, la plupart des habitants, surtout dans la partie Sud de Madagascar, font de ces tortues une source de nourriture à cause de la famine. De plus, ces tortues terrestres endémiques sont exposées à des exportations illégales (Orozco-terWengel et al., 2013). Le trafic illicite des tortues terrestres endémiques de Madagascar vers l’extérieur domine l’actualité des exportations illégales. Face à ces problèmes, des programmes de protection de tortues terrestres et endémiques sont installés pour une sensibilisation de la population locale et une lutte contre le trafic illicite. Ainsi, l’ONG DWCT œuvre pour la protection de ces tortues capturées.

CARACTÉRISTIQUES DES AGENTS PATHOGÈNES ASSOCIÉS AUX TORTUES

Herpesvirus

Classification
Le virus du genre Herpesvirus appartient à l’ordre des Herpesvirales et à la famille des Herpesviridae. La famille des Herpesviridae est subdivisée en trois sousfamilles: Alphaherpesvirinae, Bétaherpesvirinae et Gammaherpesvirinae. En général, le nom d’espèces du genre Herpesvirus retrouvés chez différentes espèces hôtes est désigné soit à partir de leur hôte (Testudinid Herpesvirus : Herpesvirus trouvé chez les Testudines), soit de la pathologie cellulaire engendrée (Cytomegalovirus impliquant les monocytes, les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les cellules glandulaires), ou soit en portant le nom de la personne qui a découvert le virus (Epstein-Barr virus : virus découvert par Epstein en 1964) (Roizman, 1982). Les espèces du genre Herpesvirus identifiées chez les tortues terrestres appartiennent à l’ordre des Herpesvirales, à la famille des Herpesviridae et à la sous-famille des Alphaherpesvirinae (Murakami et al., 2001) (Tableau 1). Chelonivirus, Testudinid Herpesvirus, Terrapene Herpesvirus et Tortoise Herpesvirus sont les espèces d’Herpesvirus retrouvées chez les tortues terrestres (https : //www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser). Des études précédentes ont montré que les espèces d’Herpesvirus trouvés chez les tortues sont propres à chaque espèce (Johnson et al., 2005 ; Marschang et al., 2006). Cependant, Testudinid Herpesvirus type 3 (TeHV3) est l’espèce d’Herpesvirus qui peut toucher plusieurs espèces de tortues (Gandar et al., 2015).

Structure des Herpesvirus

Herpesvirus est un virus enveloppé, constitué d’ADN double brin et linéaire avec 120 à 180 kb de nucléotides. Le virion se présente sous une forme sphérique de 120 à 200 nm et comporte de quatre parties (Figure 1) :
✦ enveloppe entourant le tégument.
✦ tégument entourant la capside : il est constitué de matériels globulaires asymétriques.
✦ capside (100 – 110 nm) icosaédrique avec 5 capsomères sur chaque bord, contenant 150 capsomères hexamériques et 12 capsomères pentamériques.
✦ core du virus dans lequel l’ADN est localisé (Figure 2) (https://viralzone.expasy.org/176).

Le génome des Herpesvirus est constitué de séquences unique longue et de séquences unique courte. Les séquences répétées sont présentes dans la partie interne du génome séparant les séquences uniques longue et courte et sur l’extrémité du génome .

Réplication virale des Alphaherpesvirinae

La réplication virale des Alphaherpesvirinae se déroule comme suit :
✦ Adsorption du virus au récepteur de l’hôte : les glycoprotéines virales se fixent sur le récepteur de la cellule de l’hôte pour ensuite amorcer un phénomène d’endocytose.
✦ Fusion de l’enveloppe virale et de la membrane cellulaire : la capside du virion est libérée dans le cytoplasme de la cellule de l’hôte.
✦ Réplication virale : l’ADN viral libéré se réplique dans le noyau de la cellule infectée. L’ADN viral est ensuite transcrit en ARN messager (ARNm), l’ARNm transcrit est transféré dans le cytoplasme puis traduit en protéines. La réplication virale dans la cellule de l’hôte est favorisée par les éléments de la cellule.
✦ Maturation : après l’assemblage des particules dans le noyau, la capside et l’enveloppe du virus se forment, respectivement, à partir de la membrane nucléaire et de la membrane plasmique de la cellule lors du bourgeonnement (https : //viralzone.expasy.org/15).

Mycoplasma 

Classification 

Mycoplasma est une bactérie appartenant à la division des Tenericutes, à la classe des Mollicutes, à l’ordre Mycoplasmatales, à la famille des Mycoplasmataceae, au genre Mycoplasma (Tableau 2). Mycoplasma agassizii et Mycoplasma testudinis ont été les premières espèces de Mycoplasma identifiées et étudiées chez les tortues, cette dernière étant non pathogène (Brown et al., 1995). Mycoplasma agassizii a été isolé dans les choanes d’une espèce de tortue, Xerobates agassizii, atteinte d’une maladie respiratoire (Brown et al., 1994). Cette espèce de Mycoplasma a été identifiée responsable de la maladie respiratoire grave chez les tortues (Brown et al., 1999 ; Brown et al., 2001 ; Germano et al., 2014 ; Jacobson et al., 2014). Une autre espèce, Mycoplasma testudineum, a été identifiée plus tardivement comme responsable de maladies respiratoires (Brown et al., 2004).

Tropisme cellulaire et transmission d’Herpesvirus et de Mycoplasma

Les tortues infectées par Herpesvirus et Mycoplasma peuvent être porteuses de ces agents pathogènes pendant plusieurs années sans présenter de signes cliniques (Dickinson et al., 2005). Herpesvirus et Mycoplasma infectent les cellules des muqueuses buccales, nasales et bronchiques et les cellules de l’épithélium. Ces agents pathogènes sont transmis par contact direct par la salive, les sécrétions nasales et le mucus. Ces agents pathogènes peuvent parfois être transmis par les fèces. Le combat des individus mâles et l’accouplement favorisent la transmission intraspécifique (entreespèce) de ces agents (Soares et al., 2004).

Signes cliniques de l’infection d’Herpesvirus et de Mycoplasma

L’apparition des signes cliniques associés à l’infection par Herpesvirus et par Mycoplasma chez les tortues dépend de plusieurs facteurs, notamment, des espèces touchées, de la saison de l’infection, et de l’environnement des tortues (Gandar et al., 2015). Le symptôme principal de l’infection de ces agents est l’écoulement nasal abondant. Des infections buccales et oculaires, une rhinite, une œsophagite, une glossite, une conjonctivite, un œdème palpébral, une trachéite, une pharyngite, une encéphalite, ou une hépatite peuvent aussi se présenter (Hervás et al., 2002 ; Dickinson et al., 2005 ; Salinas et al., 2011 ; Gandar et al., 2015). Mycoplasma agassizii entraîne, particulièrement, des infections nasales et une dégénérescence des cellules épithéliales des tortues (Brown et al., 1995).

Maladies causées par Herpesvirus et Mycoplasma 

L’Upper Respiratory Tract Disease (URTD) ou maladie de la voie respiratoire supérieure est la cause majeure du déclin de la population des tortues dans le monde (Brown et al., 1994 ; Salinas et al., 2011). Cette maladie respiratoire est due à la présence des espèces d’Herpesvirus et/ou de l’espèce bactérienne, Mycoplasma agassizii, dans les muqueuses du tractus respiratoire des tortues (Johnson et al., 2005 ; Jacobson et al., 2014). L’évolution de la maladie peut provoquer des maladies graves telles que l’anorexie, la cachexie, la léthargie, l’émaciation et l’atteinte du système nerveux comme la tête circulante et inclinée (Johnson et al., 2005). Les stades avancés de ces maladies entraînent la mort des espèces (Gandar et al., 2015).

Immunité des tortues face aux agents pathogènes
La réponse immunitaire des tortues face aux agents pathogènes sont non spécifiques par l’intermédiaire des interférons, des compléments, des lysozymes et par le phénomène de phagocytose. L’immunité spécifique a été aussi mise en évidence par la production des immunoglobulines (Ig) M et G (Reme, 1980).

Contrôles positifs d’ADN d’Herpesvirus et de Mycoplasma

Un contrôle positif est indispensable pour mettre en place une technique. La mise au point des techniques moléculaires pour détecter Herpesvirus et Mycoplasma a été réalisée en utilisant comme contrôles positifs de l’ADN fixé sur papier buvard et de l’ADN en solution de ces deux agents pathogènes. Pour le cas d’Herpesvirus, de l’ADN de Chelonid Herpesvirus fixé sur papier buvard (10 mm de longueur et 6 mm de largeur) et une solution d’ADN de Testudinid Herpesvirus type 3 (TeHV3) ont été utilisés. Pour le cas de Mycoplasma, les contrôles positifs utilisés ont été de l’ADN de Mycoplasma agassizii fixé sur deux papiers buvards (10 mm de long et 6 mm de large chacun) et une solution d’ADN de cette même espèce. Ces contrôles positifs ont été fournis par l’ONG DWCT.

Échantillons de lavage nasal de tortues

Les échantillons testés pendant cette étude ont été des échantillons de lavage nasal de tortues de volume entre 0,8 – 1.8 ml. Ces individus, au nombre de 275, appartiennent à l’espèce Astrochelys yniphora (182) et Pyxis planicauda (93). Ces espèces de tortues ont été mises en quarantaine dans les sites de DWCT depuis plusieurs années suite à la capture et à la tentative d’exportation illégale de ces tortues.

Table des matières

I – Introduction
II – Généralités
II – 1 L’organisation « Durrell Wildlife Conservation Trust »
II – 2 Les tortues terrestres endémiques de madagascar
II – 3 Caractéristiques des agents pathogènes associés aux tortues
II – 3 – 1 Herpesvirus
II – 3 – 1 – 1 Classification
II – 3 – 1 – 2 Structure des Herpesvirus
II – 3 – 1 – 3 Réplication virale des Alphaherpesvirinae
II – 3 – 2 Mycoplasma
II – 3 – 2 – 1 Classification
II – 3 – 2 – 2 Structure
II – 3 – 3 Tropisme cellulaire et transmission d’Herpesvirus et de Mycoplasma
II – 3 – 4 Signes cliniques de l’infection d’Herpesvirus et de Mycoplasma
II – 3 – 5 Maladies causées par Herpesvirus et Mycoplasma
II – 3 – 6 Immunité des tortues face aux agents pathogènes
III – Matériels et méthodes
III – 1 Matériels
III – 1 – 1 Contrôles positifs d’ADN d’Herpesvirus et de Mycoplasma
III – 1 – 2 Échantillons de lavage nasal de tortues
III – 2 Méthodes
III – 2 – 1 Élution d’ADN de Chelonid Herpesvirus et de Mycoplasma agassizii fixés sur papier buvard
III – 2 – 1 – 1 Principe
III – 2 – 1 – 2 Mode opératoire
III – 2 – 2 Analyse moléculaire par Polymerase Chain Reaction (PCR)
III – 2 – 2 – 1 Principe général de la PCR
III – 2 – 2 – 2 Optimisation de la PCR pour la détection d’Herpesvirus
III – 2 – 2 – 3 Optimisation de la PCR pour la détection de Mycoplasma
III – 2 – 3 Extraction d’ADN à partir des échantillons de lavage nasal de tortues
III – 2 – 3 – 1 Extraction d’ADN sans purification à partir de quatre échantillons
III – 2 – 3 – 2 Extraction d’ADN avec purification à partir de quatre échantillons
III – 2 – 4 Analyse de la présence du gène de la β – actine (gène de ménage) dans les extraits d’ADN
III – 2 – 5 Analyse de la présence d’Herpesvirus et de Mycoplasma dans les extraits d’ADN
III – 2 – 6 Dosage de l’ADN dans les extraits obtenus
III – 2 – 7 Électrophorèse sur gel d’agarose
III – 2 – 8 Séquençage des produits d’amplification
IV – Résultats et interprétations
IV – 1 Optimisation de techniques moléculaires
IV – 1 – 1 Concentration d’ADN dans les contrôles positifs d’Herpesvirus et de Mycoplasma
IV – 1 – 2 Mise au point des PCR pour la détection d’Herpesvirus et de Mycoplasma
IV – 1 – 2 – 1 Détection d’Herpesvirus
IV – 1 – 2 – 2 Détection de Mycoplasma
IV – 1 – 3 Optimisation de l’extraction d’ADN des échantillons de lavage nasal de tortues
IV – 1 – 4 Détection des gènes de ménage de tortues dans quatre extraits d’ADN purifiés et non purifiés
IV – 1 – 5 Résultats du séquençage des produits d’amplification
IV – 1 – 5 – 1 Confirmation de la détection du gène de Testudinid Herpesvirus après séquençage
IV – 1 – 5 – 2 Confirmation de la détection du gène de Mycoplasma agassizii après séquençage
IV – 1 – 5 – 3 Confirmation de la détection du gène de la β – actine après séquençage
IV – 2 Analyse des échantillons de lavage nasal de tortues à partir des techniques optimisées
IV – 2 – 1 Extraction et purification d’ADN à partir des échantillons de lavage nasal de tortues
IV – 2 – 2 Recherche du gène de la β – actine (gène de ménage) dans les extraits d’ADN purifiés de tortues
IV – 2 – 3 Recherche du gène de l’ADN polymérase d’Herpesvirus (région conservée) dans les extraits d’ADN purifiés de tortues
IV – 2 – 4 Recherche du gène 12S rRNA de Mycoplasma dans les extraits d’ADN purifiés de tortues
V – Discussion
VI – Conclusion

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