CARACTERISTIQUES DE LA METHODE D’ANALYSE PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE

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LES DIFFERENTS MODES DE SEPARATION EN EC

Electrophorèse capillaire de zone (CZE)

C’est le procédé d’électrophorèse le plus courant. Le capillaire est parcouru par l’électrolyte constitué soit par un milieu tampon qui, selon l’application, est acide (phosphate ou citrate) ou basique (borate), soit par un ampholyte (molécule possédant une fonction acide et une fonction basique). Le flux électro-osmotique croît avec le pH de la phase liquide. Il peut être rendu nul. Ce procédé est encore appelé électrophorèse en solution libre par opposition à l’électrophorèse capillaire sur gel (ROUESSAC et coll., 2009).

Electrophorèse capillaire électrocinétique micellaire (MEKC)

Dans cette variante au procédé de base décrit précédemment, on ajoute dans la phase mobile un composé cationique ou anionique, tel le dodécylsulfate de sodium (SDS), pour former des micelles dont le caractère ionique les rend porteuses de charges. Ces microgouttelettes, qui ne sont pas miscibles à la solution, emprisonnent les composés neutres, plus ou moins efficacement, par affinité du type hydrophile/hydrophobe. Ce type d’électrophorèse est donc utile pour les composés qui ont tendance à migrer sans séparation. En ajoutant des cyclodextrines modifiées, on peut déterminer la pureté optique des composés. Il se forme alors des complexes d’inclusion de stabilité différente avec les couples d’énantiomères (ROUESSAC et coll., 2009).

Electrophorèse capillaire sur gel

C’est la transposition de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) ou d’agarose. Le capillaire est rempli avec un électrolyte contenant un gel. Celui-ci produit un effet de filtration qui ralentit les grosses molécules et minimise les phénomènes de convection ou de diffusion. Les oligonucléotides, peu fragiles, peuvent être ainsi séparés. Le flux électroosmotique reste faible. Dans l’électrophorèse sur plaque, le support sur lequel se produit la migration peut contenir un gel (amidon ou mieux polyacrylamide) imprégné de l’électrolyte. Si ce dernier contient du SDS, on désigne cette forme d’électrophorèse sur gel par son sigle anglais SDS PAGE. La séparation se trouve améliorée par un phénomène de filtration sur gel qui se superpose aux forces électroniques. Ces techniques sont surtout utilisées pour les trois grandes catégories de biomolécules : les polypeptides (protéines) ; les oligonucléotides (fragment d’ADN ou d’ARN) et les mono et polysaccharides (hydrates de carbone).

Electrophorèse à focalisation isoélectrique

Cette technique également connue en électrophorèse sur support, consiste à créer un gradient de pH linéaire dans un capillaire à paroi traitée contenant un ampholyte. Le capillaire plonge dans du H3PO4 à l’anode et dans du NaOH à la cathode. Chaque composé migre et se focalise au pH qui a même valeur que son potentiel isoélectrique (au pHi, sa charge nette est nulle). Ensuite, sous l’effet d’une pression hydrostatique et en maintenant le champ électrique, on déplace les espèces séparées vers le détecteur. Les résolutions élevées obtenues avec ce procédé, permettent notamment de séparer des peptides dont le pHi ne différent que de 0,02 unité pH (ROUESSAC et coll., 2009).

CARACTERISTIQUES DE LA METHODE D’ANALYSE PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE

Avantages

Durée de l’analyse : Elle dure de 5 à 20 min. La méthode est plus rapide que les séparations chromatographiques dont la mise en œuvre nécessite un temps non négligeable pour que les équilibres de matière et de température soient atteints ;
Faible volume injecté : Comme en CPG, le volume d’échantillon injecté est faible, entre 1 et 10 μl et même parfois de l’ordre du nano litre, ce qui nécessite l’emploi d’un étalon interne. Le volume injecté ne dépasse pas, en général, 1 % du volume du capillaire ;
Séparation à température ambiante : Le travail à température ambiante est intéressant pour les molécules thermolabiles. Mais le contrôle de la température est plus important en électrophorèse capillaire qu’en CLHP ; Faible coût d’utilisation : L’absence de solvant organique diminue les coûts d’utilisation par rapport aux méthodes chromatographiques.

Limites

Sensibilité : L’EC est moins sensible que la CLHP, bien que l’usage de solvant aqueux autorise l’utilisation de faibles longueurs d’onde (λ = 190 nm) avec les détecteurs spectrophotométriques ; Précision : La précision de l’électrophorèse capillaire en matière de déterminations quantitatives est inférieure à celle des méthodes chromatographiques (CLHP et CPG) en raison du faible volume injecté et malgré l’emploi systématique d’un étalon interne. La difficulté d’obtention d’un flux électroosmotique reproductible surtout en mode micellaire contribue au manque de précision.

Techniques pour l’amélioration du seuil de quantification

Quelques stratégies peuvent être envisageables pour pallier aux problèmes de sensibilité associés à l’EC. Des systèmes de détection plus sensibles, tels que la spectrométrie de masse (SM) (BOUCHARA, 2009) ou la fluorescence induite par laser (LIF), peuvent être utilisés dans le but d’obtenir des seuils de détection très faibles.
Ces deux systèmes sont susceptibles de détecter des composés présents à l’état de traces. Toutefois, la mise en œuvre de tels détecteurs s’avère plus onéreuse et plus fastidieuse.

QUALITE

Définition

Selon l’Agence Française de Normalisation (AFNOR) : « la qualité est l’aptitude d’un produit à satisfaire ses utilisateurs » (CORPET, 2014). Selon la norme ISO 9000 :2000 la qualité est « l’aptitude d’un ensemble de caractéristiques intrinsèques à satisfaire des besoins »(AFNOR, 2000). Et Joseph Moses Juran (statisticien, auteur et consultant très influent dans le domaine de la qualité) de surenchérir : « la qualité d’un produit est son aptitude à l’usage pour lequel il est destiné (fitness for use) » (JURAN et coll., 1988). La qualité, pour le client est synonyme de satisfaction parce qu’il doit être satisfait de la marchandise et des services offerts alors que pour l’entreprise la qualité implique par exemple la rapide disponibilité des produits à des coûts avantageux . L’association des fabricants de produits pharmaceutiques américains a donné la définition suivante de la qualité en tant que concept applicable aux produits pharmaceutiques. « La qualité d’un médicament ou d’un produit assimilé est la somme de tous les facteurs qui contribuent directement ou indirectement à la sécurité, à l’activité et à l’acceptabilité du produit » (ANDRIOLLO et coll., 1997).

Contrôle qualité des médicaments

Il permet de protéger la santé des populations en s’assurant que les patients reçoivent des médicaments sûrs, efficaces et de qualité conformément aux normes qu’exige l’autorisation de mise sur le marché (WHO, 2006).
Ainsi, le médicament doit répondre aux principaux critères de qualité que: sont l’identité, la pureté, le dosage, l’uniformité et la biodisponibilité (OMS, 2004). Les analyses de contrôle de qualité consistent en général à faire des analyses répétitives d’échantillons de médicaments comparés à des références de qualité reconnue (OMS, 2014).
Le contrôle porte sur :
l’identité de l’ingrédient pharmaceutique actif ; le dosage (quantité d’ingrédient actif) ;
les excipients ;
le délitement /la dissolution => biodisponibilité ; la pureté ;
le conditionnement et l’étiquetage …
Ce contrôle peut intervenir à différents niveaux, notamment lors :
du processus de fabrication du médicament ; d’une demande d’AMM ;
d’un appel d’offres ouvert : dans ce cas, le contrôle va permettre de vérifier la conformité des échantillons à l’égard des spécifications qui figurent dans le cahier de charge et d’éliminer les produits « non-conformes » ;
de la surveillance de routine dans le marché ;
de l’assurance qualité au niveau périphérique de la distribution (WHO, 2008).

Importance du contrôle de la qualité des médicaments

Le contrôle permet de savoir si le produit contrôlé est conforme ou non à ses spécifications ou exigences préétablies et incluant ainsi une décision d’acceptation, de rejet ou de retouche. Le contrôle de la qualité des médicaments permet de protéger la santé des populations. En effet, la mauvaise qualité d’un médicament peut entraîner une absence d’effet thérapeutique et provoquer des réactions indésirables ou toxiques, qui à leur tour nuisent à la santé du patient soit en prolongeant la maladie initiale, soit en provoquant une nouvelle maladie (maladie iatrogénique), et constituent un gaspillage de ressources. Le contrôle de la qualité des médicaments permet donc de s’assurer que les patients reçoivent des médicaments sûrs, efficaces et de qualité conforme aux normes des pharmacopées.

Critères de qualité d’un médicament

Les critères de qualité d’un médicament sont entre autres la pureté, le dosage, la sécurité, l’uniformité de la forme pharmaceutique, la biodisponibilité et la stabilité (OMS, 2003 ; OMS, 2014). Tous ces aspects peuvent être influencés par le procédé de fabrication, le conditionnement, le stockage et d’autres facteurs.

Identité

Le principe actif correct doit être présent dans le produit. Cette caractéristique est généralement la plus facile à garantir.
Dans la plupart des cas, quand les analyses révèlent la présence d’un principe actif différent de celui qui est associé au médicament, il s’agit d’une erreur de conditionnement ou d’étiquetage.

Pureté

La majorité des médicaments contiennent des principes actifs et des adjuvants qui sont ajoutés pour améliorer une propriété telle que la consistance ou la couleur. Il est essentiel que ces adjuvants soient exempts de contaminants nocifs, de bactéries et d’autres micro-organismes qui peuvent nuire à la santé du malade.

Sécurité

Le médicament pris dans les conditions normales est inoffensif. La sécurité, ou innocuité, d’un médicament est déterminée par des études de toxicité (carcinogenèse, tératogenèse) et de pharmacocinétique.

Dosage

Le médicament doit contenir la quantité exacte de principe actif indiquée. La majorité des pharmacopées acceptent qu’un médicament donné contienne entre 90 et 110% de la quantité de principe actif inscrite sur l’étiquette. Cette quantité doit être stable jusqu’à la date de péremption du médicament.

Uniformité

La consistance, la couleur, la forme et la taille d’un médicament donné (qu’il soit sous la forme d’un comprimé, d’une crème ou d’un liquide) ne doivent pas varier d’une dose à la suivante. L’absence d’uniformité peut provenir de problèmes au niveau de l’identité, de la pureté ou de l’activité.

Biodisponibilité

La biodisponibilité est la vitesse et l’intensité de mise à disposition du principe actif ou de sa fraction  thérapeutique destinée à devenir disponible au niveau des sites d’action.

Stabilité

C’est l’aptitude d’un médicament à conserver ses propriétés chimiques, physiques, bactériologiques et biopharmaceutiques dans les limites spécifiées ; pendant toute sa durée de validité.
Cette stabilité dépend de paramètres extrinsèques (température, humidité, lumière etc.) et intrinsèques qui sont liés aux matières premières, à la forme pharmaceutique et au conditionnement. Elle peut être déterminée, selon les conditions de température et d’humidité choisies, par une étude de dégradation accélérée ou par une étude de stabilité en temps réel.

Assurance qualité

L’assurance de la qualité est un large concept qui couvre tout ce qui peut, individuellement ou collectivement, influencer la qualité d’un produit. Elle représente l’ensemble des mesures qui doivent être prises pour s’assurer que les médicaments fabriqués sont de la qualité requise pour l’usage auquel ils sont destinés (OMS, 1995).
Les normes de la famille ISO 9000 ont été conçues pour donner un langage commun au management de la qualité. Elles constituent une référence essentielle. Il convient de noter que ces normes évoluent et de nouvelles versions apparaissent.
Les normes de la famille ISO 9000 comprennent :
– la norme ISO 9000 version 2000 qui décrit les principes essentiels de management de la qualité et en spécifie la terminologie ;
– la norme ISO 9001 version 2000 qui est relative aux exigences des systèmes de management de la qualité. Elle concerne essentiellement le management de la qualité pour des installations réalisant de la production ou assurant des services, y compris des analyses chimiques.
– La norme ISO 9001 version 2000 met en avant le rôle et l’implication de la direction de l’entreprise dans la mise en place et le suivi du système de management de la qualité tout en renforçant la prévalence du client. En effet, elle porte sur l’aptitude du système de management de la qualité à satisfaire les exigences du client. La conformité aux exigences de cette norme peut faire l’objet d’une certification par un organisme extérieur.
– la norme ISO 9004 version 2000 qui est relative aux lignes directives pour l’amélioration des performances. Elle est recommandée comme guide pour les organismes dont la direction souhaite aller au-delà de l’ISO 9001, c’est-à-dire à la recherche de l’amélioration continue des performances.
Toutefois, la norme ISO 9004 version 2000 n’est pas destinée à des fins de certification ou contractuelles.
L’assurance de la qualité comprend : les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF), les Bonnes Pratiques de Distribution (BPD), les Autorisations de Mise sur le Marché (AMM), l’inspection, le contrôle technique et la pharmacovigilance.
L’industrie pharmaceutique se situe à un niveau élevé d’assurance de la qualité. Elle atteint ses objectifs en appliquant les BPF pour mettre au point des produits pharmaceutiques dont les essais ou les expérimentations sont réalisés sous certaines conditions et dont la commercialisation est subordonnée à autorisation. Cette démarche permet de s’assurer que les produits pharmaceutiques mis sur le marché possèdent la qualité requise.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR L’ELECTROPHORESE CAPILLAIRE ET LE CONTROLE DE QUALITE DES MEDICAMENTS
I. L’ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
I.1. Appareillage
I.2. Migration électro phorétique
I.3. Mobilité électrophorétique
I.4. Mobilité électroosmotique
I.5. Mobilité apparente
II. LES DIFFERENTS MODES DE SEPARATION EN EC
II.1. Electrophorèse capillaire de zone (CZE)
II.2. Electrophorèse capillaire électrocinétique micellaire (MEKC)
II.3. Electrophorèse capillaire sur gel
II.4. Electrophorèse à focalisation isoélectrique
III. CARACTERISTIQUES DE LA METHODE D’ANALYSE PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
III.1. Avantages
III.2. Limites
III.3. Techniques pour l’amélioration du seuil de quantification
IV. QUALITE
IV.1. Définition
IV.2. Contrôle qualité des médicaments
IV.3. Importance du contrôle de la qualité des médicaments
IV.4. Critères de qualité d’un médicament
IV.4.1. Identité
IV.4.2. Pureté
IV.4.3. Sécurité
IV.4.4. Dosage
IV.4.5. Uniformité
IV.4.6. Biodisponibilité
IV.4.7. Stabilité
IV.4.8. Assurance qualité
DEUXIEME PARTIE : REVUE DES RESULTATS DE CONTROLE DE QUALITE DE MEDICAMENTES
I. OBJECTIFS
I.1. Objectif général
I.2. Objectifs spécifiques
II. CADRE DE L’ETUDE
III. TYPE D’ETUDE
IV. METHODOLOGIE
V. RESULTATS
V.1. Résultats de l’échantillonnage
V.1.1. Cas du diclofenac
V.1.2. Cas de la quinine
V.1.3. Cas du furosémide
V.1.4. Cas du phénobarbital
V.1.5. Cas du sulfaméthoxazole et du triméthoprime
V.1.6. Cas du paracétamol :
V.1.7. Cas du métronidazole
V.1.8. Cas de l’amoxicilline
V.2. Résultats du dosage
V.2.1. Cas du diclofenac
V.2.2. Cas de la quinine
V.2.3. Cas du furosémide
V.2.4. Cas du phénobarbital
V.2.5. Cas de l’association de sulfaméthoxazole triméthoprime
V.2.6. Cas du paracétamol
V.2.7. Cas de l’amoxicilline et du métronidazole
VI. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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