Caractérisations spectroscopiques et physicochimiques

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Stratégie et mise en œuvre

Ligation

Comme nous le verrons par la suite, nous avons envisagé une approche convergente pour la synthèse des sondes en assemblant plusieurs fragments apportant chacun une propriété différente. Par exemple il est possible de développer des sondes pour la pénétration cellulaire en assemblant trois fragments distincts : un premier avec un complexe de lanthanide pour permettre l’émission, un deuxième incorporant une antenne pour assurer l’excitation et un troisième avec une séquence de pénétration dans le but de passer la membrane. Cette stratégie de « légo » permet de faire varier facilement les fragments et ainsi d’obtenir un panel de sondes important. Pour concevoir de telles architectures, il est nécessaire de contrôler spécifiquement les différentes voies d’assemblage des fragments. Ces assemblages se font par des réactions de ligation chimiosélectives. Une des solutions possible est l’utilisation d’une seule ligation chimiosélective de façon itérative. Une des procédures correspondantes est l’assemblage de fragments peptidiques par ligations natives et déprotections sucessives des résidus cystéines en N-terminale[79,80]80]
. Un autre exemple est l’assemblage de différents fragments contenant des fonctions alcynes protégées par des groupes orthogonaux par cycloaddytions de Huisgen successives[81].
Cependant ce type de stratégie induit des étapes de déprotections et de couplages successifs. Nous avons donc choisi une autre stratégie basée sur l’utilisation de ligations chimiosélectives orthogonales. Dans cet optique quatre ligations chimiosélectives ont été sélectionnées et utilisées durant ma thèse : la ligation native (et plus particulièrement la ligation SEA), la ligation oxime, la cycloaddition de Huisgen et le couplage thiol-maléimide.
Ligation native
La ligation chimique native (native chemical ligation ou NCL), mise au point par Stephen Kent en 1994[82], permet de lier deux fragments peptidiques dont l’un contient un thioester en C-terminale et l’autre une cystéine en N-terminale (fig. I.35.).
L’introduction d’une cystéine en N-terminale durant la synthèse peptidique sur support solide (SPPS) se réalise en routine. Cependant l’incorporation d’un thioester en C-terminale en stratégie Fmoc/tBu, qui est la stratégie la plus utilisée de nos jours, est plus complexe. En effet la fonction thioester est instable dans les conditions de déprotection standard du groupement Fmoc. Cette difficulté peut être surmontée en utilisant une base non nucléophile[83–85]. D’autres stratégies ont été mises au point comme la protection du groupe thioester[86] ou bien l’introduction du thioester après l’élongation peptidique[87,88]. Une autre stratégie est de l’introduire sous la forme d’un précurseur stable qui après réarrangement donne un thioester utilisable pour la ligation native. C’est cette dernière stratégie que nous avons utilisé. Un de ces systèmes est le groupe bis(2-sulfanylethyl)amido (SEA)[89]. Le peptide SEA est décroché et déprotégé de la résine sous sa forme SEA-on, il peut être ensuite inactivé dans des conditions oxidantes faibles pour mener à sa forme SEA-off (fig. I.36.). Il sera ensuite converti en thioester dans les conditions réductrices de la ligation (TCEP). Cette étape a lieu en présence de MPAA (acide 4-mercaptophenylacetique) qui est un réducteur trop faible pour reduire le SEA-off mais qui cependant catalyse la réaction par transtioesterification.
Ligation oxime
La condensation de carbonyle sur des composés aminés, est egalement une méthode de choix pour la ligation de fragments peptidiques. Tout d’abord cette condensation est possible avec des amines primaires pour former des liens imines reversibles. Ces imines peuvent être reduites pour former des liens amines non-hydrolysables. Cette condensation est également possible avec des composés aminés portant un groupement donneur en α, de type oxyamine, pour former des liens oxime[90,91] qui seront exploités dans ce manuscrit91] 90] 89]
Cycloaddition de Huisgen catalysée par le Cu+
Parmi les ligations utilisées durant ma thèse nous pouvons citer la cycloaddition de Huisgen catalysée par le Cu+[92,93]. Cette ligation permet de coupler un azoture et un alcyne terminal afin de former un 1,2,3 triazole substitué en position 1, 4 (fig. I.38.).
Introduction
Elle peut se réaliser dans une grande gamme de température (0-160°C) et de pH (5 à 12), ainsi que dans differents solvants (dont H2O).Les deux précurseurs de cette ligation sont stables, facile à introduire, faisant en partie la popularité de cette ligation[94]. De plus d’un point de vue structural le lien triazole est un isostère de la liaison peptidique avec une susceptibilité moindre la coupure hydrolytique. De nombreuses études se sont penchées sur l’optimisaton de cette ligation et ont montré que l’utilisation d’un ligand stabilisant le Cu+ permet d’augmenter la cinétique, le rendement de la réaction et limite les oxydations néfastes[95]. Les ligands les plus utilisés sont basés sur des dérivés tris(triazolylmethyl)amines tels que les analogues solubles dans l’eau THPTA, OEG-TTAA, et BTTAA (fig. I.39.).
Couplage thiol-maléimide
Parmi les acides aminés naturels, la cystéine combine de nombreux avantages (nucléophilie importante, faible abondance) permettant ainsi son utilisation pour des réactions chimiosélectives. En effet outre la ligation native qui nécessite sa présence, on peut citer la formation de pont disulfure, de lien thioéther, thioester, thiazolidine, la ligation thiol-maléimide. Cette dernière est utilisée dans les travaux présentés dans le manuscrit. Elle consiste en une addition de Michael entre une groupemenr thiol et maléimide. Elle est spécifique des thiols à pH compris entre 6,5 et 7,5. Cependant ce lien n’est pas stable, il peut subir des réactions d’échanges de thiol ainsi qu’une régénération du maléimide. Ces réactions parasites peuvent être évitées par l’hydrolyse du maléimide[96] (fig. I.40.). Cette ligation n’étant pas sélective d’une cystéine en particulier elle nécessite l’absence ou la protection orthogonale des autres résidus cystéines dans la séquence.

Sondes intensiométriques émettant dans le visible

Sondes SP3-Cs124-DapDOTA(Ln)

Synthèse

Le peptide cystéinyl Cys-F2-DapDOTA(Ln) a été synthétisé automatiquement par synthèse peptidique sur support solide (SPPS) en stratégie Fmoc/tBu sur résine Rink amide (fig. II.8.). Les acides aminés non standard Fmoc-Dap(Alloc)-OH et Boc-Cys(Trt)-OH ont été utilisés afin d’introduire respectivement l’acide diaminopropionique et le résidu cystéinyl. Ces acides aminés étant couteux, ils ont été introduits manuellement afin de réduire les équivalents introduits (2 au lieu de 4). Le premier couplage a été effectué également à la main afin de contrôler le taux de greffage sur la résine. Les acides aminés utilisés sont protégés par des groupements standards de synthèse peptidique en Fmoc/tBu, sauf pour le résidu Dap qui est protégé par un groupement orthogonal alloc en vue de l’introduction sélective du DOTA, ainsi que le résidu terminal cystéine qui est protégé en N-terminale par un Boc, au lieu du groupement Fmoc classique.

Figure II.8. : Voie de synthèse pour la préparation du fragment Cys-F2-DapDOTA(Ln). * représente les groupements protecteurs standards (Boc pour Lys ; tBu pour Glu, Thr ; Trt pour Cys, Gln et His)

Il a été démontré que la chaine latérale de la lysine est suffisamment basique pour permettre l’élimination du groupement Fmoc en N-terminale[100]. Ainsi lors de l’étape de synthèse suivante correspondant au couplage du DOTA, deux fonctions pouvaient potentiellement réagir avec le chélateur menant à des produits secondaires (fig. II.9.). Afin d’empêcher cette réaction parasite, la cystéine N-terminale est introduite sous sa forme protégée non standard Boc-Cys(Trt)-OH. Ainsi le groupement protecteur Fmoc en N-terminale a été remplacé par un groupement Boc stable en milieu basique. Ce groupement protecteur a été retiré dans les conditions standards de déprotection et de décrochage. Bien que la chaine latérale du Dap soit moins basique que celle de la lysine, nous avons choisi de garder la même stratégie de synthèse.

Des sondes intensiométriques aux sondes ratiométriques

Le groupement alloc de la chaîne latérale du Dap a été retiré sélectivement en présence de palladium(0) (Pd(Ph3)4) et de phénylsilane dans le dichlorométhane (DCM) anhydre et dégazé[101]. Cette déprotection n’est pas totale, environ 50% ne se déprotège pas et ce même si la réaction est répétée. Après rinçage, le DOTA-tris(tBu)ester a été greffé par un couplage peptidique classique durant une nuit. Le peptide a été ensuite décroché et déprotégé de la résine en présence d’acide trifluoroacétique (TFA) et de scavengers : triisopropylsilane (TIS), eau et dithiotréitol (DTT). Il a été ensuite purifié par HPLC préparative en phase inverse (gradient eau/acetonitrile à 0.1% TFA), puis lyophilisé. Le peptide Cys-F2-DapDOTA(Ln) a été caractérisé en spectrométrie de masse et sa pureté a été contrôlée par HPLC analytique. Il a été ensuite métallé en présence d’un excès de TbCl3 ou EuCl3 dans l’eau à pH 6.5 pendant une nuit sous argon. Les peptides ont été ensuite purifiés par HPLC préparative. Du Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) a été ajouté avant l’injection pour réduire les ponts disulfures potentiellement formés par oxydation des cystéines par le dioxygène lors des manipulations du peptide à l’air. Après lyophilisation les peptides Cys-F2-DapDOTA(Tb) et Cys-F2-DapDOTA(Eu) ont été caractérisés par spectrométrie de masse et leur pureté a été contrôlée par HPLC analytique. La figure II.10. montre le chromatogramme et le spectre de masse confirmant l’identité du peptide Cys-F2-DapDOTA(Tb).

Intensité (u.a.)

Le fragment F1-SEA incorpore l‘antenne Cs124 sous forme d’un acide aminé modifié. La synthèse a été décrite par le groupe d’Imperiali[102] et a été réalisée au laboratoire. La première étape est la synthèse de la partie aromatique. L’acétoacétate d’éthyle réagit avec la diamine m-phénylènediamine pour mener au groupement Cs124 (rendement 48 %). Cette amine aromatique est ensuite couplée à la chaine latérale de l’acide aminée acide glutamique protégé Fmoc-Glu(OH)-OtBu en présence d’HATU et de DIEA. S’en suit l’acidolyse de l’ester tertiobutylique du composé Fmoc-Glu(Cs124)-OtBu obtenu en présence de TFA et de TIS dans du CH2Cl2 (fig. II.11). Cet acide aminé Fmoc-Glu(Cs124)-OH a été obtenu avec un rendement de 30 %. La réaction peut être améliorée en réalisant le couplage de l’acide aminé et de l’antenne en boite à gant (rendement 85 %).

Le fragment thioester F1-Cs124-SEA a été synthétisé manuellement sur support solide SEA-PS-Résine (fig. II.12). Les acides aminés non standard Fmoc-Cys(StBu)-OH et Fmoc-Glu(Cs124)-OH ont été incorporés afin d’introduire respectivement le résidu cystéine et l’antenne. Le groupe protecteur StBu orthogonal du résidu cystéine permet de prévenir l’oxydation de la fonction thiol lors du passage de la forme SEA-on en SEA-off dans des conditions oxydantes[103]. Le résidu cystéine a été déprotégé ultérieurement dans le milieu réducteur de la ligation native. Le dernier acide aminé a été acétylé en N-terminale pendant 10 min par un mélange DMF/anhydride acétique/pyridine. Le fragment a été ensuite décroché de la résine et déprotégé en présence de TFA, TIS, H2O et de thioanisole. Il a été ensuite dissout par portion de 10 mg dans une solution aqueuse à 10% d’acide acétique et traité avec une solution d’I2 (200 mM dans du DMSO) afin d’oxyder le groupement C-terminal SEA-on en SEA-off. Après 30 s quelques grains de DTT ont été ajoutés afin de quencher le diiode en excès. Le peptide oxydé a été ensuite directement purifié par HPLC préparative. Il a été caractérisé en spectrométrie de masse et sa pureté a été contrôlée par HPLC analytique (fig. II.13).

Sondes SP3-Cs124-LysDOTA(Ln)

Les premières sondes synthétisées lors de ma thèse incorporent le complexe de lanthanide sur la chaine latérale d’un résidu Dap. En effet pour la sonde à zinc SP3-Trp-LysDOTA(Ln) basées sur le couple tryptophane/terbium l’utilisation de la lysine à la place du Dap induisait un contraste moindre. Il a été supposé que la flexibilité apportée par la chaine latérale de la lysine éloigne en moyenne le complexe de lanthanide de l’antenne induisant une diminution du transfert d’énergie et donc de la luminescence du lanthanide. Nous avions donc développé nos sondes en nous basant sur ce résultat. Cependant compte tenu des problèmes de synthèse du fragment Cys-F2-DapDOTA(Ln) (déprotection incomplète de l’alloc), nous avons choisi de développer les sondes en série lysine selon la même stratégie de synthèse. Ces sondes nécessitent donc la synthèse du fragment Cys-F2-LysDOTA(Ln) qui ne diffère du fragment Cys-F2-DapDOTA(Ln) seulement par la nature de l’acide aminé non standard alloc introduit lors de la SPPS.

Synthèse

Le fragment Cys-F2-LysDOTA(Ln) a été synthétisé manuellement de manière similaire au fragment Cys-F2-DapDOTA(Ln) la seule différence est l’introduction de l’acide aminé non standard Fmoc-Lys(alloc)-OH à la place du Fmoc-Dap(alloc)-OH. Le rendement de synthèse associé à ce fragment est de 21 % contre 11% pour l’analogue Dap.
Le fragment Cys-F2-LysDOTA(Ln) ainsi obtenu a été assemblé par ligation native avec le fragment F1-Cs124-SEA. Les produits finaux SP3-Cs124-LysDOTA(Tb) et SP3-Cs124-LysDOTA(Eu) ont été caractérisés en spectrométrie de masse et leur pureté a été contrôlée par HPLC analytique.
Les deux sondes ont ensuite été analysées selon la même démarche que celle utilisée pour les sondes en série Dap. Tout d’abord le repliement et la stœchiométrie vis-à-vis du zinc a été investigué par dichroïsme circulaire puis l’émission de la sonde a été analysée.

Caractérisations spectroscopiques et physicochimiques

Dichroïsme circulaire
Le signal de dichroïsme circulaire du peptide SP3-Cs124-LysDOTA(Eu) est fortement négatif à 200 nm ainsi qu’un épaulement à 220 nm. La présence de zinc induit un signal moins négatif à 200 nm alors que l’épaulement est plus marqué, deux signes indiquant que le peptide se structure. L’évolution du spectre est linéaire jusqu’à un équivalent de zinc où il se stabilise, ainsi le peptide et le zinc forme un complexe 1 : 1. Le comportement de la sonde en série lysine est le même qu’en série Dap, ainsi le repliement de la sonde ne semble pas être modifiée par l’allongement de la chaine latérale portant le complexe de lanthanide (fig. II.28.).

Synthèse des sondes SP3R-Ln1-Cs124-Ln2

Les fragments cystéinyl Cys-F2-DapDOTA(Ln) sont les mêmes que ceux synthétisés pour les sondes intensiométriques en série Dap.

Le fragment F1R(Ln)-Cs124-SEA a été synthétisé de manière similaire au peptide F1-Cs124-SEA. Seule la dernière étape sur support diffère. En effet la glycine terminale n’a pas été acétylée mais le DOTA-tris(tBu)ester a été couplé manuellement en N-terminale par un couplage classique en présence de PyBOP et de DIEA. Le fragment F1R-Cs124-SEA a été métallé en présence d’un excès de TbCl3 ou EuCl3 dans l’eau à pH 6.5 pendant une nuit sous argon (fig. II.37.). Les peptides F1R(Tb)-Cs124-SEA et F1R(Eu)-Cs124-SEA ont été caractérisés par spectrométrie de mz

Les différents fragments ont été assemblés par ligation SEA dans les mêmes conditions expérimentales que celles décrites pour les sondes intensiométriques. Les produits

Par cette méthode nous avons donc synthétisé deux sondes : SP3R-Ln2-Cs124-Ln1 avec Ln1 = Tb et Ln2 = Eu ou Ln1 = Eu et Ln2 = Tb. SP3R-Tb-Cs124-Eu : SP3R-Eu-Cs124-Tb :

Ces sondes diffèrent par le positionnement des lanthanides. De ce fait on peut s’attendre à une sensibilisation et un comportement différents de chaque lanthanide entre les deux sondes. Nous allons voir cela par la suite.

Caractérisations spectroscopiques et physicochimiques

SP3R-Eu-Cs124-Tb

Fluorescence

L’émission de fluorescence de la sonde ratiométrique SP3R-Eu-Cs124-Tb suit la même tendance que pour les sondes intensiométriques à savoir une diminution de l’émission lors de l’ajout de zinc. Les rendements quantiques de fluorescence sont du même ordre de grandeur que pour les sondes intensiométriques (tabl. II.9).

Des sondes intensiométriques aux sondes ratiométriques

Lors du titrage du peptide par le zinc , l’émission du terbium augmente (×11) et celle de l’europium reste quasi-constante (×1,5). L’augmentation du signal du terbium est proche de celle de la sonde intensiométrique (×13) (fig. II.40.). La faible variation de l’émission de l’europium correspond au comportement voulu en positionnant ce lanthanide à une distance constante par rapport à l’antenne.

La sonde SP3R-Eu-Cs124-Tb est ratiométrique. Le rapport de l’intensité du terbium sur celle de l’europium augmente de 5,7 à 47,8, jusqu’à atteindre un plateau suivant la formation du complexe Zn-SP3R-Eu-Cs124-Tb (fig. II.41.). Cependant l’émission de l’europium est totalement écrasée par celle du terbium lorsque le peptide complexe le zinc. En effet, le rapport des deux signaux atteint 50 lorsque la sonde est repliée, ainsi le signal de l’europium se trouve dans le bruit de fond. La sonde SP3R-Eu-Cs124-Tb n’est donc pas optimale.

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Table des matières

Chapitre I : Introduction
I.1. Les métaux dans le vivant
I.2. Zinc et Cuivre
I.2.1. Zinc
I.2.2. Cuivre
I.2.3. Sphère de coordination
I.3. Détection des cations Zn2+ et Cu+
I.3.1. Méthodes de détection
I.3.2. Sondes fluorescentes
I.3.3. Critères pour une sonde idéale
I.3.4. Etat de l’art
I.3.4.1 Sondes à zinc
I.3.4.2. Sondes à cuivre
I.4. Lanthanides
I.4.1. Propriétés magnétiques
I.4.2. Propriétés de luminescence
I.5. Sondes développées au laboratoire
I.5.1. Sondes à zinc développées au laboratoire
I.5.2. Sondes à cuivre développées au laboratoire
I.6. Projet de thèse
I.6.1. Objectifs
I.6.2. Stratégie et mise en œuvre
I.6.2.2. Ligation
Chapitre II : Des sondes intensiométriques aux sondes ratiométriques
II.1. Principe
II.2. Sondes intensiométriques émettant dans l’UV
II.2.1. Sondes SP3-Cs124-DapDOTA(Ln)
II.2.1.2. Synthèse
II.2.1.3. Caractérisations spectroscopiques et physicochimiques
II.2.2. Sondes SP3-Cs124-LysDOTA(Ln)
II.2.2.1. Synthèse
II.2.2.2. Caractérisations spectroscopiques et physicochimiques
II.2.3. Conclusion
II.3. Sondes ratiométriques émettant dans l’UV
II.3.1. Design : une antenne pour deux lanthanides
II.3.2. Synthèse des sondes SP3R-Ln1-Cs124-Ln2
II.3.3. Caractérisations spectroscopiques et physicochimiques
II.3.3.1. SP3R-Eu-Cs124-Tb
II.3.3.1. SP3R-Tb-Cs124-Eu
II.3.4. Conclusion
II.3. Sonde à zinc émettant dans le proche infrarouge
II.3.1. Synthèse
II.3.2. Propriétés spécifiques liées à l’anthracène
II.3.3.1. Sondes intentiométriques
II.3.3.1. Sondes ratiométriques
II.3.4. Conclusion
II.4. Conclusion
Chapitre III : Développement des sondes pour l’imagerie cellulaire
III.1. Peptide de pénétration cellulaire
III.1.1. Généralités
III.1.2. Mécanisme de passage de la membrane cellulaire
III.1.2.1. Translocation
III.1.2.2. L’endocytose
III.1.3. Séquences de pénétrations choisies pour l’élaboration des sondes
III.2. Stratégie pour l’élaboration des sondes pénétrantes
III.3. Sondes pénétrante de 1ère génération : CPP-SP3-Cs124-DOTA(Ln)
III.3.1. Synthèse
III.3.2. Caractérisations spectroscopiques et physicochimiques
III.3.3. Tests cellulaires
III.3.4. Conclusion
III.4. Sondes pénétrante de 2nde génération : CPP-SP3-Acri-DO3A-pic(Ln)
III.4.1. Modification de l’antenne
III.4.2. Modification du polyaminocarboxylate chélatant le lanthanide
III.4.2.1. Chélate DO3A-pic
III.4.1.2. Synthèse du DO3A-pic-tri(allyl)ester
III.4.2.3. Evaluation de l’influence du DO3A-pic : sonde SP3-Cs124-DO3A-pic(Eu)
III.4.2.4. Evaluation de l’influence du DO3A-pic : sonde SP3-Acri-DO3A-pic(Eu) 105
III.4.3. Synthèse des sondes CPP-SP3-Acri-DO3A-pic(Ln)
III.4.4. Caractérisations des sondes CPP-SP3-Acri-DO3A-pic(Ln)
III.4.5. Tests cellulaires
III.5.Conclusion et perspectives
Chapitre IV : Sondes ratiométriques pour la détection du Cu+ et de l’Ag+
IV.1. Principe
IV.2. Stratégie oxime
IV.2 1. Synthèse
IV.2.2. Caractérisations spectroscopiques : titrage à l’Ag+ en milieu aérobie
IV.2.3. Conclusion
IV.3. Stratégie thiol-maléimide
III.3.1. Synthèse
III.3.2. Caractérisations spectroscopiques et physicochimiques
III.3.2.1. Titrage au Cu+
III.3.2.2. Titrage à l’Ag+
IV.3.3. Etude mécanistique de la sonde
IV.4. Conclusion
V Conclusion et perspectives
Chapitre VI : Partie expérimentale
Peptide synthesis
Intensiometric probes (SP3)
Ratiomectric probe (SP3R)
CPP-containing probes
Ratiometric copper probes
Spectroscopy
Sample preparation
Measurements:
Influence of metal cations:
Determination of binding constants
Determination of q, the number of water molecules coordinated to Tb3+ or Eu3+:
Circular dichroism
Chapitre VII : Bibliographie