Caractérisation structurale et thermodynamique du complexe CuII-Aβ

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Le peptide β-amyloïde (Aβ)

Le peptide Aβ est produit à partir de l’APP via les voies β- puis γ-sécrétases. Le clivage par cette seconde enzyme est hétérogène. Il conduit principalement à un peptide Aβ de 40 acides aminés noté Aβ40. Cependant, d’autres formes plus courtes ou plus longues sont également produites (entre 39 et 43 acides aminés), en particulier la forme Aβ42 (figure 1.9), qui représente environ 10 % des espèces de Aβ. Les deux peptides Aβ40 (majoritaire) et Aβ42 (minoritaire) sont présents en tant qu’espèces solubles dans les fluides biologiques de tous les individus. Cependant une augmentation de la production d’Aβ42 et de son accumulation conduit à des dépôts amyloïdes dans le cerveau des malades d’Alzheimer (Iwatsubo et al., 1994). C’est le constituant principal des plaques séniles. Il est supposé jouer un rôle plus important que Aβ40 dans la pathologie.

Interaction de Aβ avec les ions métalliques

Il est difficile d’attribuer l’initiation de l’amyloïdogenèse à la seule présence des peptides Aβ40 et Aβ42, alors que ce sont des constituants normaux du fluide cérébrospinal et que les porteurs de la maladie d’Alzheimer familiale, qui surexpriment Aβ42 dès la naissance, ne présentent pas de dépôts amyloïdes dans leur enfance. D’autre part, il est difficile d’expliquer que les dépôts formés soient localisés à des endroits bien précis (au niveau des synapses par exemple) et que leur distribution ne soit pas uniforme puisque l’Aβ est exprimé de façon ubiquitaire. Il est donc raisonnable d’évoquer, en plus de la surproduction d’Aβ (liée à des causes génétiques ou à l’âge), d’autres facteurs permettant l’initiation des dépôts amyloïdes avec l’âge.
Il a été proposé que les ions métalliques participent à ce phénomène (Atwood et al., 1999). Leur homéostasie est perturbée lors de la maladie d’Alzheimer (voir chapitre III). Les ions métalliques sont retrouvés à des concentrations très élevées dans le cerveau des malades d’Alzheimer, à proximité ou au sein des plaques amyloïdes (Atwood et al., 1999; Lovell et al., 1998). L’interaction entre l’Aβ et les métaux (cuivre, zinc et fer) est donc de plus en plus étudiée. Comme elle est au cœur de notre sujet, elle fera l’objet d’une bibliographie détaillée dans la partie IV. Disons pour le moment qu’il est désormais admis que les métaux sont des acteurs majeurs de la maladie d’Alzheimer.

Interaction de Aβ avec les membranes

Plusieurs facteurs jouent un rôle important dans l’interaction entre le peptide Aβ et la membrane des lipides : la concentration et la nature du métal lié à l’Aβ, l’état d’oxydation de la Met35, le pH, la charge des lipides dans la membrane, le ratio avec le cholestérol sont autant de paramètres qui varient et influent sur le mode d’interaction entre l’Aβ(40 ou42) et la bicouche lipidique.
Aβ est un peptide avec une partie hydrophobe issu de la région transmembranaire de l’APP. Il est supposé être partiellement extracellulaire (région 1 à 16) et partiellement structuré en hélice alpha dans la région transmembranaire (29 à 42). La localisation contenant les acides aminés 17 à 28 n’est pas très claire. Le caractère hydrophobe de la partie 28 à 41 favorise son interaction avec les membranes et sa conformation en hélice alpha.
La structure supramoléculaire de Aβ associé aux membranes est relativement peu connue et controversée. Des études de RMN du solide et de dichroïsme circulaire montrent l’affinité de Aβ pour les phospholipides chargés négativement. D’autres études RMN ont montré que le peptide adoptait une conformation en hélice-α dans un environnement de type membranaire. On suppose donc que le peptide est capable de s’insérer dans les membranes suite à la formation d’hélices-α, alors que les peptides non insérés forment des structures en feuillets-β à la surface des lipides (Bokvist et al., 2004). Cela entraîne une diminution de la fluidité des membranes. (Kremer et al., 2000). Il en résulte une altération de leurs propriétés, conduisant par exemple à leur dépolarisation (Hartley et al., 1999) ou à l’augmentation de leur perméabilité. (Arispe et al. 1996). Les ions Ca2+ peuvent passer. Ce mécanisme explique la toxicité de l’Aβ par la formation de canaux à Ca2+, aboutissant à une accumulation de calcium (connu pour être toxique) dans la cellule. Cependant ce mécanisme est indépendant de la conformation en feuillet-β de l’Aβ et par voie de conséquence indépendant de l’agrégation (voir le lien entre feuillet-β et agrégation décrit précédemment). Il a aussi été montré que l’hélice-α de l’Aβ s’insère dans la membrane et forme des canaux cations monovalents (Arispe et al., 1993). Des études de microscopie à force atomique ont montré la présence de structures multimériques (tétramériques ou hexamériques) de Aβ42 en forme de canaux au sein de bicouches lipidiques, favorisant l’afflux de Ca2+ dans les cellules (Lin et al., 2001).
Une autre voie possible est que l’Aβ quitte la membrane et commence à agréger en adoptant une conformation en feuillet bêta dans le domaine extracellulaire et/ou à la surface de la membrane. La conformation en feuillet bêta est supposée être liée à la toxicité de l’Aβ (puisqu’en relation avec la structuration des agrégats en fibrilles), mais le mécanisme, n’est pas encore bien compris. Il a cependant été démontré que l’agrégation de l’Aβ était plus rapide à la surface des membranes qu’en solution.
Plusieurs études indiquent que la charge des lipides dans la membrane joue un rôle important dans l’interaction avec l’Aβ. Ainsi, le cholestérol, composant essentiel des membranes, semble participer car il contribue à la fois à la structure des membranes et est associé à la régulation des sécrétases α et β clivant l’APP (partie I.3.b). Sa présence dans les membranes neuronales (en forte concentration dans la MA) est connue pour induire des modifications importantes dans la fluidité des membranes.
Rôle des métaux
Peu d’études font état du rôle des ions métalliques sur l’interaction de l’Aβ avec les membranes. La coordination de CuII ou ZnII à Aβ dans un environnement lipidique chargé négativement provoque également un changement conformationnel de feuillet-β à hélice-α, accompagné de la structuration du peptide en « oligomères allostériquement organisés » qui pénètrent dans la membrane (Curtain et al., 2001). Par ailleurs, l’absence de CuII et/ou de ZnII inhibe l’insertion de Aβ40 et Aβ42 dans des bicouches lipidiques (pour un pH = 5,5-7,5) indiquant l’importance des ces ions métalliques dans l’interaction de Aβ avec la membrane cellulaire (Curtain et al., 2003).
La proximité de ces complexes CuII-Aβ avec le cholestérol présent dans les membranes pourrait par ailleurs faciliter la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), le cholestérol servant de réducteur. Des espèces oxydées du cholestérol (telles que le 4-cholesten-3-one) sont ainsi produites en présence de tels complexes et ont été retrouvées in vivo chez des souris transgéniques modélisant la maladie d’Alzheimer et dans des cerveaux humains post-mortem (Puglielli et al., 2005).
L’agrégation de Aβ en structures fortement hydrophobes et leur pénétration au sein des structures lipidiques ont plusieurs conséquences sur leur intégrité, que ce soit selon un mécanisme direct ou via l’oxydation des membranes suite à la libération des ROS par l’Aβ à proximité ou au sein de celles-ci (Murray et al., 2005), comme il sera décrit au paragraphe II.4. La conséquence principale de ces phénomènes est une augmentation de la perméabilité membranaire. Il en résulte la dérégulation de l’homéostasie des ions et des dérèglements de la signalisation cellulaire pouvant conduire à la mort cellulaire, phénomènes qui seront décrits plus longuement au paragraphe II.4.

La protéine tau et son implication dans les neurofibrilles

En plus des dépôts extracellulaires de peptides β-amyloïdes (plaques séniles), les neurones des zones du cerveau touchées par la maladie d’Alzheimer présentent des enchevêtrements intracellulaires de neurofibrilles qui affectent leur cytosquelette. Ce type de lésions impliquant la protéine tau n’est pas spécifique à la maladie d’Alzheimer, il est également retrouvé dans d’autres maladies neurodégénératives regroupées sous le terme « taupathies », incluant le syndrome de Down, la démence fronto-temporale avec Parkinsonisme liée au chromosome 17 (FTDP-17), la maladie de Pick ou encore la paralysie supranucléaire progressive (LaFerla et Oddo, 2005).
Ces enchevêtrements de neurofibrilles sont constitués d’agrégats de protéines tau sous forme hyperphosphorylée (Grundke-Iqbal et al., 1986).
La protéine tau est responsable de l’assemblage et de la stabilisation des microtubules, composants essentiels du cytosquelette des neurones. Dans son état natif, tau est une protéine comprenant entre 352 et 441 acides aminés (de masse 55 à 62 kDa) et existe sous six isoformes produites à partir d’un gène unique situé sur le chromosome 17. Des mutations génétiques sur ce chromosome conduisent à la démence frontale temporale avec Parkinsonisme (FTDP-17), mais aucune mutation conduisant à la maladie d’Alzheimer n’a été répertoriée à ce jour (LaFerla et Oddo, 2005). Ces protéines ont la particularité de posséder dans leur séquence trois à quatre répétitions d’un même domaine qui permet la liaison aux microtubules. Cette liaison est par ailleurs fortement régulée par la phosphorylation de la protéine au niveau de résidus sérine et thréonine.
La protéine tau pathologique est hyperphosphorylée. Suite à cette hyperphosphorylation, tau se dissocie des microtubules (Bramblett et al., 1993), compromettant ainsi leur stabilisation et leur fonctionnement. Cela conduit à une altération des transports axonaux et dendritiques ainsi qu’à une dégénérescence des neurones. De plus, la protéine hyperphosphorylée libérée montre une solubilité nettement plus faible. Elle est aussi plus sensible aux modifications chimiques induites par le stress oxydant et subit des changements conformationnels suite à ces oxydations. Elle s’agrège alors, selon un processus de polymérisation avec une étape de nucléation (Barghorn et Mandelkow, 2002), sous forme de paires hélicoïdales de filaments (PHFs, « paired helical filaments » en anglais). Ces dernières s’associent ensuite en structures plus grandes : les neurofibrilles. Par ailleurs, il est également suggéré que les ions AlIII et FeIII, retrouvés liés à tau dans des cerveaux de patients post mortem, soient impliqués dans la polymérisation des protéines tau hyperphosphorylées (Shin et al., 2003).
Ces structures en filaments hélicoïdaux présentes dans le cytoplasme sont responsables de neurodégénérescence. Des modèles de protéines tau hyperphosphorylées sont toxiques sur cultures cellulaires (Fath et al., 2002). De plus, le nombre et la localisation des enchevêtrements de neurofibrilles dans le cerveau post-mortem a pu être corrélé avec le niveau de démence, alors qu’une telle relation n’existe pas dans le cas des plaques amyloïdes (Arriagada et al., 1992).

Relations existant entre Aβ et tau

Le lien entre les lésions de la maladie d’Alzheimer (plaques et enchevêtrements de neurofibrilles) et les composants qui leur sont associés (Aβ et tau), ainsi que leurs relations avec la mort neuronale qui caractérise la maladie ont longtemps été controversés. Pendant de nombreuses années, deux hypothèses majeures ont été proposées sur les causes de la maladie d’Alzheimer (Suh et Checler, 2002) : « l’hypothèse de la cascade amyloïde », qui postule que le processus neurodégénératif est une série d’évènements causés par une production anormale de Aβ (Hardy et Higgins, 1992), et « l’hypothèse de la dégénération du cytosquelette neuronal » proposant que les modifications du cytosquelette associées à tau sont les évènements déclencheurs de la maladie. Des travaux sur les kinases ont apporté les premiers éléments de réponse. De nombreuses kinases, dont GSK-3 (kinase glycogène-synthase 3 ou PTK I pour « Tau protein kinase I ») et cdk5 (kinase cycline-dépendante 5), sont capables de phosphoryler tau in vitro. Elles sont activées en réponse à l’agrégation de Aβ et conduisent à la mort neuronale (Alvarez et al., 1999; Takashima et al., 1993).
Par ailleurs, des études récentes réalisées sur des souris triplement transgéniques APP x PS1 x tau montrent le lien hiérarchique entre Aβ et tau, en faveur de l’hypothèse de la cascade amyloïde (LaFerla et Oddo, 2005). Ces souris développent les pathologies associées à Aβ et à tau, mais de façon non synchrone : Aβ intracellulaire (3 mois), dépôts amyloïdes extracellulaires (6 mois), premiers changements conformationnels de tau (10 – 12 mois) et hyperphosphorylation de tau (12 – 15 mois) (Oddo et al., 2003). Dans une seconde étude, Oddo et al. ont montré que la suppression de Aβ par immunothérapie (ou via à un inhibiteur de γ-sécrétase) conduit à un retrait de la pathologie associée à tau à un stade précoce (avant qu’il y ait hyperphosphorylation) : la disparition de Aβ précédant celle de tau et la réapparition de la pathologie associée à Aβ précède celle associée à tau (Oddo et al., 2004). Enfin, ces travaux suggèrent que Aβ peut moduler la progression de la pathologie associée à tau. En effet, des souris transgéniques PS1 x tau (dépourvues d’APP et donc ne développant pas de pathologie associée à Aβ), développent des taupathies plus tardivement et moins sévèrement (en particulier, les dysfonctionnements synaptiques sont moins prononcés) par comparaison aux souris triplement transgéniques APP x PS1 x tau (Oddo et al., 2003).
Ainsi, ces résultats confirment l’hypothèse de la cascade amyloïde selon laquelle Aβ est l’élément déclencheur de la pathologie associée à tau. Il faut toutefois noter que tau lui-même est essentiel pour la neurotoxicité associée à Aβ (dégénérescence des neurones en présence de fibrilles amyloïdes). Ainsi, dans un modèle cellulaire en présence de Aβ fibrillaire, on observe une dégénérescence des neurones isolés de souris transgéniques exprimant tau (humain ou de souris), alors que les cellules issues d’animaux knock-out pour tau ne dégénèrent pas. De plus, la dégénérescence est rétablie suite à la réexpression de tau (Rapoport et al., 2002).

Approches symptomatiques et traitements utilisés

Il n’y a actuellement aucun traitement curatif pour la maladie d’Alzheimer. Mis à part les neuroleptiques et les antidépresseurs utilisés pour lutter contre les troubles comportementaux des malades, les seuls traitements utilisés à ce jour sont des inhibiteurs des choline estérases ou des antagonistes des récepteurs du NMDA. D’autres axes thérapeutiques, incluant les antioxydants ou des anti-inflammatoires, sont actuellement en cours d’évaluation clinique quand à leur efficacité sur la maladie d’Alzheimer.
Les Inhibiteurs des choline estérases
Une perte importante de neurones cholinergiques avec de faibles niveaux d’acétylcholine et de choline acétyltransférase a été observée chez les malades d’Alzheimer. Cela se traduit par une diminution des fonctions cognitives. Afin de compenser ce déficit du neurotransmetteur acétylcholine, une voie thérapeutique intéressante consiste à utiliser des inhibiteurs des choline estérases. Leur rôle est d’augmenter la concentration et la durée d’action de l’acétylcholine dans la fente synaptique et donc d’améliorer l’activation des récepteurs cholinergiques (muscariniques et nicotiniques), améliorant ainsi les fonctions cognitives.
Ces composés ont été parmi les premières molécules essayées pour traiter les patients atteints de la maladie d’Alzheimer à un stade précoce ou modéré, et représentent l’une des deux seules classes de traitements utilisés actuellement (Bachurin, 2003).
La tacrine (Cognex®), inhibiteur des acétylcholine (AChE) et butylcholine estérases (BuChE), a été une des premières molécules employées (figure 1.17). Cependant, sa faible organospécificité et ses effets secondaires toxiques (inhibition des canaux à sodium et potassium) font qu’elle a été abandonnée en faveur d’inhibiteurs de seconde génération tels que le donepezil (Aricept®) et la galantamine (Reminyl®). Ces composés présentent une sélectivité prononcée pour l’AChE par rapport à la BuChE, et semblent avoir également une fonction agoniste sur les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (Arias et al., 2005). Enfin, une dernière catégorie de composés, dont la rivastigmine (Exelon®), inhibe les deux formes acétylcholine et butylcholine estérases. Elle est particulièrement intéressante pour sa régiosélectivité permettant une inhibition sélective des choline estérases du cerveau par rapport aux formes périphériques. De plus, ce composé s’avère plus efficace que les autres pour augmenter les taux d’acétylcholine, ce qui peut s’expliquer par sa capacité à inhiber la butylcholine estérase de manière pseudo-irréversible (Bar-On et al., 2002).
Rivastigmine
Les inhibiteurs de l’activité cholinestérase induisent malheureusement aussi des états dépressifs. Les voies de recherches actuelles consistent donc à trouver des molécules capables de stimuler la synthèse et/ou le relargage de l’acétylcholine au niveau présynaptique (Bachurin, 2003), de stimuler les récepteurs cholinergiques muscariniques ou nicotiniques post-synaptiques ou d’utiliser des agents possédant des propriétés cholinomimétiques (Suh et Checler, 2002). Ces stratégies pourraient par ailleurs avoir des effets directs sur la cascade amyloïde, dans la mesure où la voie α-sécrétase de protéolyse de l’APP pourrait être régulée par l’activation des récepteurs cholinergiques muscariniques, via l’activation de protéines kinases.
Régulation du Ca2+ : Antagonistes des récepteurs du glutamate de la famille NMDA
Les récepteurs du N-Méthyl-D-Aspartate (NMDA) sont des récepteurs ionotropiques du glutamate. Activés par le glutamate, ils permettent l’influx des ions calcium dans la cellule via les canaux ioniques qui leur sont associés. Une conséquence d’un stress oxydatif élevé (comme dans la MA) est leur hyperactivation qui s’accompagne d’une augmentation de l’influx des ions calcium dans la cellule. De plus le transport du glutamate est altéré dans la maladie d’Alzheimer. L’excès de calcium résultant entraîne alors une cascade de processus dégénératifs et aboutit finalement à l’apoptose (cf. paragraphe II.4.b). Sur la base de cette hypothèse, il a été proposé que des antagonistes des récepteurs du NMDA qui bloqueraient l’influx de calcium induit par le glutamate puissent empêcher la neurotoxicité causée par Aβ.
C’est le cas de la mémantine (Namenda®, figure 1.18), antagoniste non compétitif du récepteur du NMDA. Elle possède une affinité modérée pour ce récepteur et bloque transitoirement l’ouverture des canaux à calcium. Ainsi, elle diminue la mort cellulaire engendrée par excitotoxicité sans altérer les fonctions normales de ce récepteur impliqué entre autres dans la transmission neuronale et dans la mémorisation (Lipton, 2006). Ce composé améliore les performances lors de tests d’apprentissage chez des souris transgéniques modélisant la maladie d’Alzheimer (Minkeviciene et al., 2004). Lors de la la phase III d’essais cliniques chez des patients atteints d’Alzheimer modéré à grave, la mémantine a permis de réduire les détériorations cliniques (Reisberg et al., 2003). En combinaison avec le donezepil, elle a permis d’améliorer les fonctions cognitives (Tariot et al., 2004).
La mémantine est actuellement utilisée en tant que traitement neuroprotecteur ralentissant le développement de la maladie d’Alzheimer pour des cas modérés à graves.
Mémantine
Une approche alternative consisterait à utiliser des composés capables de bloquer la toxicité du calcium induite par Aβ, en bloquant par exemple certains canaux calciques ou en modulant l’activité de récepteurs chargés de réguler l’homéostasie du calcium (Bachurin, 2003).
Les Anti-inflammatoires non stéroïdiens
La maladie d’Alzheimer se traduisant par un état inflammatoire chronique du cerveau, il a été très vite suggéré d’utiliser des anti-inflammatoires dans son traitement.
Des anti-inflammatoires non stéroïdiens (NSAIDs), inhibiteurs des cyclooxygénases (enzymes de la biosynthèse des dérivés de type prostaglandines intervenant dans les processus inflammatoires), ont donc été testés (Dannhardt et Kiefer, 2001; Townsend et Pratico, 2005). La cyclooxygénase de type 1 (COX1), constitutive et exprimée dans presque tous les tissus, assure un grand nombre de fonctions homéostasiques. La cyclooxygénase de type 2 (COX2), inductible en réponse à l’inflammation, est également présente constitutivement au niveau des neurones. Son expression augmente dans la maladie d’Alzheimer suite à une réponse inflammatoire forte face à la formation des plaques amyloïdes (Dannhardt et Kiefer, 2001).
L’ibuprofène, le naproxène, le flubiprofène, ou encore l’indométhacine (figure 1.19) sont des inhibiteurs de COX proposés pour réduire l’inflammation dans la maladie d’Alzheimer. Les deux premiers sont actuellement évalués sur ce sujet en phase III d’essais cliniques (www.alzforum.org). Par ailleurs, il a été montré que la prise régulière d’anti-inflammatoires non stéroïdiens de la même classe que l’aspirine ou l’ibuprofène pourrait réduire le risque d’Alzheimer de près d’un facteur deux (Stewart et al., 1997). Une large utilisation de ces médicaments est toutefois limitée à cause des effets secondaires observés généralement pour les NSAIDs, tels que les ulcères.
La recherche s’est donc orientée vers des inhibiteurs spécifiques de COX-2, comme le rofecoxib (Vioxx®) ou le celecoxib (Celebrex®) (figure 1.19). De plus, ils devraient être dépourvus des effets secondaires liés à l’inhibition de la synthèse constitutive des prostaglandines (Dannhardt et Kiefer, 2001). Malheureusement, les premiers essais cliniques dans le cadre de la maladie d’Alzheimer n’ont révélé aucun effet thérapeutique (Reines et al., 2004).
Les antioxydants
Le phénomène de stress oxydant existe dans tous les cerveaux; cependant il est particulièrement important à proximité des plaques séniles. On pense que la présence d’ions métalliques à activité redox (cuivre et fer) à des concentrations élevées dans les plaques contribue à entretenir cette production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’origine d’un stress oxydant provoquant des dommages irréversibles sur les neurones. L’activation des cellules microgliales associée au phénomène inflammatoire et l’augmentation des taux de calcium intracellulaire sont également à l’origine de stress oxydant, notamment suite à l’activation de la NO-synthase (nNOS) par ce dernier (cf. paragraphe II.4.b).
Afin de limiter ce stress oxydant, de nombreux antioxydants (dont un certain nombre d’origine naturelle) ont été testés chez l’animal et chez l’homme (Bachurin, 2003).
L’α-tocophérol (une des formes prédominantes de la vitamine E) (figure 1.20) a fait l’objet d’études cliniques et s’avère efficace pour ralentir le développement de la maladie chez des patients atteints d’Alzheimer modéré ou grave (Sano et al., 1997). Les polyphénols tels que la curcumine (présente dans le curry), le resvératol (composant du vin rouge) ou la catéchine (issue du thé vert) ont montré un effet protecteur sur cultures cellulaires (Conte et al., 2003). Le défaut majeur de ces composés est leur difficulté à passer la barrière hémato-méningée.
La mélatonine est une hormone de régulation du sommeil dont le niveau de production décroît avec l’âge, plus particulièrement chez les malades d’Alzheimer. Une étude sur des souris transgéniques a confirmé l’activité positive de la mélatonine (réduction du stress oxydant et augmentation de la durée de vie) (Matsubara et al., 2003). Cette molécule (ainsi que son précurseur, la sérotonine) présente l’avantage de passer facilement la barrière hémato-méningée. Approuvée par la FDA, elle est en vente libre aux Etats-Unis comme molécule facilitant le sommeil des personnes âgées. Sa distribution est contrôlée dans de nombreux pays européens (dont la France) car elle accentuerait les états dépressifs.

Métaux et maladie neurodégénérative

Les métaux, indispensables pour l’organisme

Rôle des métaux dans le cerveau

Les ions métalliques (cuivre, zinc et fer notamment) sont essentiels pour les organismes vivants. Ils sont présents dans le cerveau sain à des concentrations relativement élevées (Atwood et al., 1999). Le zinc est présent dans le néocortex (partie extérieure latérale du cerveau) à une concentration de l’ordre de 150 à 200 μM (soit dix fois plus que dans le sang). Libéré dans la fente synaptique lors de la transmission neuronale, il peut alors atteindre des concentrations supérieures à 300 µM. Le cuivre est également très abondant dans le cerveau. Sa concentration est comprise entre 60 et 110 μM. Quand au fer, sa concentration dans l’hippocampe et le cortex cérébral peut atteindre 400-600 μM.
Ces ions métalliques participent à l’activité neuronale au niveau des synapses (zinc et cuivre) et assurent le fonctionnement des métalloprotéines (cytochrome c oxydase, Cu/Zn superoxyde dismutase, …). Le cuivre est notamment nécessaire pour l’activité d’un certain nombre d’enzymes d’importance physiologique catalysant des réactions redox (Miranda et al. 2000), figure 1.27. En tant que cofacteur dans de multiples réactions redox, le Cu est aussi impliqué dans la production d’espèces radicalaires potentiellement toxiques via des réactions de Fenton ou Haber-Weiss (Miranda et al. 2000). Bien qu’essentiel pour la vie et pour le bon fonctionnement d’un certains nombres d’enzymes d’intérêt neurobiologique (tyrosinase, ceruloplasmine, cytochrome c oxydase, dopamine-β-hydroxylase …) , le CuII/I même lié à certaines molécules peut catalyser la formation de radicaux hydroxyles, les plus dangereux des espèces réactives de l’oxygène (ROS).
Ces ROS peuvent oxyder les protéines, l’ADN, entraîner une péroxydation des lipides (figure 1.28). Le CuII/I est trop réactif pour exister sous forme libre en quantité importante dans la cellule sans causer de dommages oxydants. Cette remarque vaut également pour le FeIII/II.
C’est pourquoi, tous les organismes vivants possèdent des mécanismes de contrôle de la concentration du Cu. Parmi ceux récemment élucidés, la séquestration du métal et sa libération à des compartiments spécifiques de la cellule semblent très importantes.
Des études ont en effet montré que le cuivre, le zinc ne sont pas uniformément répartis dans le cerveau (Becker et al., 2005) comme le montre la figure 1.29.
Il existe donc des protéines qui transportent les métaux et les libèrent dans des zones spécifiques où ils sont utilisés.

Contrôle de la concentration

Ces concentrations élevées en métaux sont permises par des protéines assurant leur stockage dans le cerveau (métallothionéines pour le zinc et le cuivre, ferritine pour le fer) et par des protéines assurant leur transport. Par exemple la famille de protéine ZnT pour le zinc transporte le zinc à travers les membranes. Les « chaperonnes à cuivre» assurent le transfert du cuivre vers sa destination (par exemple les enzymes). La glycoprotéine transferrine est impliquée dans le transport du fer. Par ailleurs, leur concentration dans le cerveau est strictement régulée par d’autres protéines, afin d’éviter des phénomènes toxiques associés à un dérèglement de l’homéostasie des ions métalliques.
Un déséquilibre (soit une déficience soit un excès) des concentrations en cuivre peut avoir de sérieuses conséquences sur l’organisme.
Quand le Cu fait défaut, les cellules ne disposent plus d’assez de cuivre pour les enzymes. Le Cu, étant nécessaire pour le bon fonctionnement de leur site catalytique, l’activité de ces enzymes diminue et conduit à un déclin de l’activité métabolique. Par exemple, la cytochrome c oxydase (CCO), impliquée dans le métabolisme énergétique, est fortement affectée par des concentrations anormalement basses en Cu puisque son centre catalytique ne fonctionne pas sans cuivre. L’activité des enzymes responsables du renouvellement des radicaux libres dans la cellule est aussi fortement affectée quand la quantité de cuivre disponible diminue. Le cas le plus parlant est celui de la superoxyde dismutase (SOD) qui possède du Cu et du Zn dans son centre catalytique et requiert du cuivre pour sa catalyse 2 O2•- H2O + O2.
Un excès de cuivre est associé avec le stress oxydant et peut être toxique à la fois au niveau cellulaire et au niveau de l’organisme. Quand CuII est réduit en CuI, il est capable de transférer un électron et générer des espèces réactives de l’oxygène (ROS) tels que les radicaux hydroxyles (HO•) (Halliwell et Gutteridge, 1984). Ces radicaux sont responsables de dommages tels que l’oxydation de protéines, la péroxydation des lipides dans les membranes et endommagement de l’ADN.
De l’assimilation aux cellules
Le corps d’un adulte de 70 kg en bonne santé contient moins de 110 mg de Cu répartis ainsi : dans le foie (10 mg), dans le cerveau (8,8 mg), le sang (6 mg) et le squelette (46 mg) et l’architecture des muscles (26 mg) (Gaggelli et al., 2006). Le cuivre est initialement absorbé dans l’intestin. Le foie joue ensuite un rôle central dans la l’homéostasie du cuivre puisque qu’il permet son entrée dans l’organisme. La plupart du cuivre nouvellement absorbé est ensuite incorporé dans la cerruplasmine et sécrété ainsi dans le sang. S’il y a un excès de cuivre, alors il est excrété dans la bile.
Le transport du cuivre jusqu’au cerveau requiert le passage de la barrière hémato-méningée. Cette étape est bloquée dans le cas de la Maladie de Menkes, où le gène codant pour l’ATP7B est déficient, suggérant que cette protéine est impliquée. Le cuivre est alors amené jusqu’aux neurones et aux astrocytes par la protéine hCtr1.
Dans les cellules
Le maintien de l’homéostasie du cuivre dans la cellule requiert des transporteurs membranaires de cuivre et une famille de protéines, appelées « chaperonnes du cuivre » qui délivrent le CuII à une cible spécifique (figure 1.31). Ces transporteurs du cuivre et ces protéines chaperonnes ont été identifiés chez les procaryotes mais sont aussi présents chez les mammifères, avec une étonnante similarité des systèmes de circulation du cuivre dans les cellules. La figure 1.31 illustre leur rôle. Figure 1.31. Modèle de circulation du cuivre dans une cellule (hépatocyte) (d’après Shim et Harris, 2003). Le cuivre entre via une protéine membranaire de transport hCtr1. Une fois à l’intérieur, plusieurs possibilités de distribution existe : (i) rejoindre le pool de cuivre des métallothionéines. (ii) transport par « la chaperonne à cuivre » Cox17 à la cytochrome c oxydase. (iii) fixation du cuivre à la CCS pour être ensuite délivré à la SOD Cu,Zn . (iv) distribution à l’ATPase de type P de la maladie de Wilson, située dans l’appareil trans-Golgi par HAH1.
hCtr1
La hCtr1 (de l’anglais « Human Copper Transporter ») est une protéine de 190 acides aminés contenant un domaine N-terminal extracellulaire riche en Histidine et en Méthionine. Elle se situe dans le plasma membranaire et permet au cuivre de passer à travers les membranes. Elle participerait aussi à la compartimentation intracellulaire de ce métal.
Les Métallothionéines
Les métallothionéines (MTs) constituent une famille de polypeptides riches en cystéine avec de faibles poids moléculaires (4-8 kDa). Elles sont capables de chélater les ions métalliques tels que le Cd(II), le Zn(II) et le Cu(I). Elles sont composées de deux domaines (α et β), chacun présentant des clusters métal-thiolate. Plusieurs rôles leurs sont attribués : (i) détoxification des métaux non essentiels tels que le cadmium et le mercure ; (ii) détoxification de l’excès de métaux essentiels tels que le cuivre et le zinc ; (iii) séquestration des radicaux et des espèces réactives de l’oxygène ; (iv) transfert et transport des métaux lourds.
Les protéines « chaperonnes à cuivre ».
Les protéines chaperonnes du cuivre ont d’abord été mises en évidence dans la levure de boulanger Saccharomyces cerevisae puis des homologues ont été isolées chez les souris, le mouton et l’homme. Elles conduisent le CuI dans le cytoplasme et le transfèrent directement jusqu’à des protéines spécifiques.
Atox1 ou HAH1
C’est une petite protéine de 68 acides aminés. Elle fixe le CuI entré dans la cellule, et le transfère à des protéines cibles via la chemin de la figure 1.31.
Elle est le prototype même de la protéine chaperonne jouant le rôle de récepteur soluble du cuivre(I) cytoplasmique en fixant 2 ou 3 ions dans son site actif. Elle adapte sa structure en fonction de l’échange à effectuer en créant des interactions spécifiques avec la protéine cible facilitant ainsi le mécanisme de transfert entre les deux sites de fixation du donneur et de l’accepteur.
CCS
La protéine chaperonne qui a pour cible la Superoxyde dismutase (SOD) est appelée CCS (de l’anglais « copper chaperon superoxide dismutase »). Elle est responsable de l’incorporation du cuivre dans la SOD1. La comparaison de la séquence des acides aminés de la SOD1 et de la CCS a révélé une homologie remarquable entre l’enzyme et sa protéine chaperonne.

Table des matières

Chapitre 1 : Maladie d’Alzheimer : causes, mécanismes et stratégies thérapeutiques 
I. La maladie d’Alzheimer
I.1 Historique : une maladie déjà centenaire
I.2 Impacts sociaux économiques
I.3 Origines et facteurs de risque de la maladie
I.3.a Facteurs génétiques
I.3.b Facteurs biologiques et environnementaux
I.3.c Implication des métaux dans la maladie d’Alzheimer
I.4 Le diagnostic
I.4.a Les manifestations cliniques
I.4.b Les tests neuropsychologiques
I.4.c L’imagerie cérébrale
II. Plaques amyloïdes et neurofibrilles
II.1 Le peptide β-amyloïde et son implication dans les plaques amyloïdes
II.1.a La protéine APP
II.1.b Le peptide β-amyloïde (Aβ)
II.1.c Interaction de Aβ avec les ions métalliques
II.1.d Interaction de Aβ avec les membranes
II.2 La protéine tau et son implication dans les neurofibrilles
II.3 Relations existant entre Aβ et tau
II.4 Hypothèse de la cascade amyloïde
II.5 Différentes approches thérapeutiques
II.5.a Approches symptomatiques et traitements utilisés
II.5.b Agents thérapeutiques ciblant les causes de la maladie
III. Métaux et maladie neurodégénérative
III.1 Les métaux, indispensables pour l’organisme
III.1.a Rôle des métaux dans le cerveau
III.1.b Contrôle de la concentration
III.1.c Dérégulation des métaux et maladies
III.2 Cuivre et espèces réactives de l’oxygène (ROS)
III.3 Cuivre et MA
III.3.a Concentration
III.3.b Agrégation
III.3.c Toxicité
IV. Les complexes Métaux
IV.1 Sites de fixation et constantes de dissociation
IV.1.a CuII-Aβ
IV.1.b ZnII-Aβ
IV.1.c FeII-Aβ
IV.1.d Signification biologique de ces sites de fixation des métaux
IV.2 Chimie de coordination
IV.2.a CuII-Aβ
IV.2.b ZnII-Aβ
IV.2.c FeIII-Aβ
IV.2.d Autres métaux
IV.2.e Dans les plaques amyloïdes
IV.3 Agrégation
IV.4 Toxicité
V. Conclusion
VI. Bibliographie
Chapitre 2 : Caractérisation structurale et thermodynamique du complexe CuII-Aβ
I. Nombre de sites de fixation et constantes d’affinités
I.1 Vérification du nombre de sites de fixation
I.2 Constantes de fixation
I.2.a La titration calorimétrique isotherme (ITC)
I.2.b La Fluorimétrie
II. Les ligands mis en jeu
II.1 La Résonance Paramagnétique Electronique (RPE)
II.1.a Site de forte affinité
II.1.b Site de faible affinité
II.2 Spectroscopie UV
II.3 La RMN
II.3.a RMN 1H de CuII- Aβ16 à pH = 7.4
II.3.b RMN 1H de CuII- Aβ16 à pH = 6,5
II.3.c RMN 1H de CuII- Aβ28 à pH = 7,4
II.3.d RMN 2D de CuII- Aβ28/40
II.3.e RMN 1H de NiII-Aβ16
II.3.f Exclusion de la Tyrosine
III. Ligand labile
III.1 Le site de forte affinité
III.2 Le site de faible affinité
IV. Conclusion
V. Bibliographie
Chapitre 3 : Génération de radicaux hydroxyles par les complexes CuII-Aβ 
I. Détection des radicaux hydroxyles
I.1 Utilisation de la deferroxamine (ou desferral)
I.2 Détection en fluorescence
I.3 Détection des radicaux hydroxyles en RPE
II. Les résultats
II.1 En Fluorescence
II.2 En RPE
III. Potentiels d’oxydo-réduction des complexes cuivre-peptide
IV. Inhibition des ROS
IV.1 Le Clioquinol
IV.2 La Métallothionéine -3 (MT-3)
IV.2.a MT-3 et production de HO•
IV.2.b MT-3 et Aβ
V. Conclusion
VI. Bibliographie
Chapitre 4 : Le processus d’agrégation 
I. Effets des métaux sur l’agrégation
II. Monomère, dimère, oligomère ?
II.1 Chromatographie d’exclusion stérique (CES)
II.1.a Aβ16,28 et 40
II.1.b Aβ42
II.2 Gel d’électrophorèse
III. Nature des agrégats
IV. Conclusion
V. Bibliographie
Chapitre 5 : Matériels et méthodes 
I. Préparation des échantillons
I.1 Solutions de peptides
I.1.a Peptides Aβ
I.1.b Autres peptides
I.2 Solutions de métaux
I.3 Autres solutions
II. Méthodes
II.1 Spectroscopie d’absorption UV-Visible
II.2 Spectroscopie de Fluorescence
4Table des matières
II.3 Titration Calorimétrique Isotherme (ITC)
II.4 Spectres RPE
II.5 Spectres RMN
II.6 Spectroscopie de Luminescence
II.7 Mesures électrochimiques
II.8 Chromatographie d’exclusion stérique (CES)
II.9 Expériences d’agrégation
II.9.a Quantification
II.9.b Electrophorèse
III. Bibliographie
Conclusion générale et perspectives 
Annexes 

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