Caractérisation moléculaire des souches d’Actinomycètes

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Caractéristiques générales des Actinomycètes

Les Actinomycètes forment un groupe de microorganismes procaryotes à coloration Gram positive, généralement filamenteux et sporulants. Ils sont hétérotrophes et la majorité des Actinomycètes connus sont mésophiles mais il existe des individus capables de se multiplier à des températures avoisinant les 50°C, on les appelle les « Thermoactinomyces » (Omura, 1992).
En comparaison aux autres bactéries qui ont une croissance rapide avec un temps de génération d’environ 20 minutes, les Actinomycètesont une croissance plus lente avec un temps de génération moyen de 2 à 3 heures (Ottow etGlathe ,1968 ; Larpent et Sanglier, 1989).
Ils ont un ADN riche en Guanine et en Cytosine puisque leur taux de GC est supérieur à 55%. Parmi les Actinomycètes, le genre Streptomyces est le plus dominant et les non-Streptomyces sont appelés Actinomycètes rares .

Ecologie et distribution des Actinomycètes

Les Actinomycètes sont des organismes ubiquitaires qui peuvent se multiplier dans les divers habitats écologiques (Waksman, 1959).

Le sol

Le sol est le milieu écologique où l’on rencontre le plus les Actinomycètes. Ils se retrouvent surtout entre la surface du sol jusqu’à deux mètres de profondeur. La production de substances comme la géosmine et le 2-méthyl isobornéol par les Actinomycètes contribue à l’odeur caractéristique du sol. Dans la rhizosphère, les Actinomycètes les plus abondants appartiennent au genre Streptomyces (tableau 1).

Biologie de développement des Actinomycètes

Les Actinomycètes présentent une diversité morphologique tout à fait remarquable. Cette diversité se traduit par une différenciation importante et l’existence d’un cycle biologique semblable à celui de certains eucaryotes .
Les Actinomycètes les plus différenciés développentsur milieu gélosé une masse d’hyphes mycéliens répartis en deux couches distinctes : lemycélium aérien et le mycélium du substrat. Des spores peuvent se former sur l’un de ces mycéliums ou même sur les deux à la fois, ces spores permettent la propagation de la souche.

Mycélium aérien et mycélium du substrat

Le mycélium aérien ou encore mycélium secondaire,ste formé d’hyphes dressés sur le mycélium du substrat (figure 1). Ces hyphes aérienssont en général pigmentés et enfermés dans une enveloppe externe hydrophobe. Et ces hyphes aériens sont plus épais et moins ramifiés que les hyphes du substrat.
Divers mutants de Streptomyces sans mycélium aérien ou incapables de sporuler ontété décrits (Chater et Merrick, 1979).
Le mycélium du substrat appelé encore mycélium végétatif ou primaire se développe à partir du tube de germination issu de la spore. Il est ancré dans le support solide où il puise ses nutriments. Le mycélium du substrat a une croissance apicale.
Chez certains genres comme Rhodococcus, il n’y a pas de véritable mycélium mais seulement croissance d’une propagule originelle formant un filament plus ou moins long se fragmentant ensuite en petites unités et donnant parfois naissance à des ramifications élémentaires. Généralement, cette fragmentation des hyphes est présente chez des genres dépourvus de spores ou qui n’en produisent qu’un petit nombre.

Particularités des Actinomycètes telluriques

Les Actinomycètes sont largement répandus dans le ol,s ils sont surtout représentés par les genres Streptomyces et Nocardia. Leur nombre peut atteindre les 106 unités formatrices de colonies par gramme de terre sèche mais leur développement dépend de plusieurs facteurs physiques et chimiques. (Mayfield et al., 1972)
Les facteurs qui influencent la multiplication des Actinomycètes sont :
· Le pH : un pH compris entre 7 et 8 est favorable au développement des Actinomycètes.
· La température: la température optimale pour la croissance des Actinomycètes telluriques est comprise entre 25 à 30°C.
· L’aération et l’humidité: la majorité des Actinomycètes sont aérobies etont une préférence pour des taux d’humidité compris entre01à 30%.
· La profondeur : les Actinomycètes sont plus abondants dans la rhizosphère jusqu’à une profondeur de 2m, leur nombre diminue a vec la profondeur.
· La nature et l’abondance des matières organiques : un apport d’engrais constitue une addition de composés frais et augmente le nombre d’Actinomycètes dans le sol.

TAXONOMIE DES ACTINOMYCETES

Au cours de ces trente dernières années, la taxonomie des Actinomycètes est passée par plusieurs stades. Son évolution est étroitementliée à l’évolution du nombre des genres des Actinomycètes. Ainsi, les 5 genres d’Actinomycètes recensés en 1948 sont devenus 10 en 1958 et 37 en 1974 selon la huitième édition du Bergey’s“ Manual of Determinative Bacteriology” (Gottlieb, 1974).
L’application des critères chimiotaxonomiques en plus des critères morphologiques et biochimiques a permis, en 1989, de répartir les Actinomycètes en sections de 26 à 33.
En 1994, l’édition du “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” a présenté une classification dans laquelle, les Actinomycètes sont répartis en 8 groupes (de 22 à 29) avec introduction de nouveaux genres, et avec plus de précision sur lesNocadioformes (groupe 22) et les Maduromycètes (groupe 26).
Une nouvelle classification basée uniquement sur l’analyse des séquences de l’ARNr 16S et des gènes codant pour l’ARNr 16S a été proposée parStackebrandt et al., en 1997. Dans cette classification, une nouvelle classe a été décrite.
Actuellement, selon la seconde édition du «Taxonomic Outline of The Procaryotes, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology » (Garrity et al., 2004), le phylum Actinobacteria est constituée d’une seule classe dénommée égalementActinobacteria qui est subdivisée en cinq sous-classes : Acidimicrobidae, Rubrobacteridae, Coriobacteridae, Sphaerobacteridae, Actinobacteridae (tableau 3).

Colorations et caractéristiques biochimiques

Certains groupes d’Actinomycètes ont une paroi riche en lipides. En effet, des lipides présents dans la paroi rendent les bactéries posit ves à la coloration de Ziehl Neelsen (acido-alcoolo-résistance). L’acido-alcoolo-résistance estcaractéristique du genre Mycobaterium et elle est partielle avec la technique modifiée de Ziehl-Neelsen chez les Nocardia.
Pour distinguer les genres d’Actinomycètes : Nocardia des Rhodococcus, Tsukumurella et Gordonia, d’autres tests, comme l’analyse de la sensibilité aux lysozymes ainsi que la recherche d’une activité β-galactosidase et de nitrate réductase peuvent être proposés (tableau 4).

Dégradation des substances non biodégradables par les bactéries et les champignons

A cause du caractère non compétitif des Actinomycètes, les premières étapes de la dégradation des matières organiques fraîches sont assurées par les champignons et les bactéries et ils n’assurent que les dernières étapes. Ils se développent donc bien sur les matières organiques partiellement dégradées alors ueq cette condition ne convient pas à la croissance des microflores fongique et bactérienne(Krassilnikov, 1958).

Production de substances probiotiques, antibiotiques ou toxiques

Les Actinomycètes peuvent produire des substances probiotiques comme l’acide folique, la biotine et les vitamines B1, B2, B6, B12 (Morel, 1996; Dommeregues et al., 1970).
Les Actinomycètes auraient aussi un rôle dans le processus d’humification par production de composés dont la structure chimique est proche de celle des acides humiques (Krassilnikov, 1958). Dans le sol, le nombre de microorganismes diminue à cause de la production d’antibiotiques par les Actinomycètes (Morel, 1996).

Les métabolites secondaires des Actinomycètes

Les métabolites secondaires sont définis comme des composés de faible poids moléculaire, non essentiels à la croissance du microorganisme producteur. La production de ces métabolites est souvent associée à la croissance des microorganismes correspondant à la phase stationnaire de la courbe de croissance (Demain, 1995).
Les Actinomycètes sont aptes à synthétiser de nombreux métabolites secondaires d’une diversité structurale très vaste et la plupart d’entre eux sont doués d’un potentiel d’activité biologique important (Higashide, 1984; Vining, 1992). C’est en 1940, après la découverte de l’actinomycine, que les Actinomycètessont devenus l’objet de nombreuses recherches et ils ont été exploités durant les années 80. En conséquence, de nouvelles structures et surtout les antibiotiques sont continuellement isolés à partir des Actinomycètes. Ainsi, ces microorganismes sont devenus les premiers fournisseurs de ces métabolites .

La production d’Antibiotiques par les Actinomycètes

Un antibiotique, par définition, est une molécule uiq détruit (bactéricide) ou qui bloque la croissance (bactériostatique) des bactéries. Unmême antibiotique peut être bactériostatique à faible dose et bactéricide à dose élevée (Decre et Courvalin, 1995). Un antibiotique peut être antibactérien, antifongique, anticancéreux, antiviral ou antiparasitaire.
Parmi les souches isolées d’Actinomycètes, 50 à 75% produisent des antibiotiques et sont à l’origine des 70% des antibiotiques naturels connus dans le monde (tableau 7) (Okami et Hotta, 1988).
En 1943, S. Waksamn a décrit pour la première foisla streptomycine, un antibiotique produit par un Actinomycète tellurique, Streptomyces griseus. La streptomycine se révéla être le premier médicament efficace contre la tuberculose.
Les antibiotiques obtenus à partir des Actinomycètes ont plusieurs applications :
– En santé humaine.
– En santé animale et en élevage.
– En agriculture.

Table des matières

PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I-1-Le sol
I-1-1- La rhizosphère
I-1-2- Les microorganismes de la rhizosphère
I-2- Les Actinomycètes
I-2-1- Définition des Actinomycètes
I-2-2- Caractéristiques générales des Actinomycètes
I-2- 3- Ecologie et distribution des Actinomycètes
I-2- 3-1- Le sol
I-2- 3-2- Milieux aquatiques
I-2- 3-3- Débris végétaux
I-2-3-4- Air
I-2-3-5- Les végétaux, l’animal et l’homme
I-2-4- Biologie de développement des Actinomycètes
I-2-4-1- Mycélium aérien et mycélium du substrat
I-2-4-2- Formation des spores
i- Les endospores
ii- Les exospores
iii- La germination des spores
I-2-4-3- Structures particulières
I-2-4-4- Particularités des Actinomycètes telluriques
I-3-Taxonomie des Actinomycètes
I-3-1- Les critères utilisés pour la taxonomie des Actinomycètes
I-3-1-1- Caractères morphologiques
I-3-1-2- Colorations et caractéristiques biochimiques
I-3-1-3- Caractères chimiques
I-3-1-4- Caractères moléculaires
I-4- Rôles des Actinomycètes telluriques
I-4-1- Dégradation des substances non biodégradables par les bactéries et les champignons
I-4-2- Production de substances probiotiques, antibiotiques ou toxiques
I-4-3- Les métabolites secondaires des Actinomycètes
I-4-3- 1-La production d’Antibiotiques par les Actinomycètes
DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES
II-1-MATERIELS
II-1-1-Echantillonnage du sol
II-1-2-Milieux d’étude
II-1-2-1- Milieu d’isolement
II-1-2-2- Milieu d’identification
i- Préparation des inoculums pour la pré-identification
ii- Milieu d’identification macroscopique
iii- Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des pigments diffusibles
iv-Milieu pour la détermination des caractères biochimiques
II-1-2-3- Milieu pour la détermination des caractères physiologiques
i- Détermination de la température optimale de croissance
ii- Détermination du pH optimum
iii- Milieu pour la détermination du type respiratoire
iv- Milieu pour la détermination de la mobilité
II-1-2-4- Milieu d’enrichissement
II-1-2-5- Milieu de rajeunissement
II-1-2-6- Milieu pour le test antibiogramme
II-1-2-9- Milieu pour le test antifongique
II-1-3-Stérilisation
II-2-METHODES
II-2-1- Isolement des souches d’Actinomycètes
II-2-1-1- But
II-2-1-2- Principe
II-2-1-3- Mode opératoire
i-Techniques d’isolement
· Sélection par antibiotiques
· Traitement à haute température
· Sol aérosolisé
ii- Prélèvements des colonies d’Actinomycètes
iii- Coloration de Gram
II-2-2- Conservation des souches d’Actinomycètes
II-2-2-1- Conservation à long terme
II-2-3- Pré-identification des souches d’Actinomycètes
II-2-3-1- Préparation des inoculums pour la pré-identification
II-2-3-2- Aspect macroscopique
II-2-3-3- Détermination des pigments mélanoides et des pigments diffusibles
II-2-3-4- Aspect microscopique
i- Technique de culture sur lame
II-2-3-5- Détermination de l’acido-alcoolo-résistante
i- Coloration de Ziehl –Neelsen (ZN)
II-2-3-6- Caractéristiques biochimiques
i- Recherche de la catalase
ii- Recherche de la Bêta -Galactosidase
iii- Recherche de Nitrate-Réductase
II-2-3-7- Caractères physiologiques
i- Détermination de la température optimale de croissance
ii- Détermination du pH optimum de croissance
iii- Détermination du type respiratoire
iv- Détermination de la mobilité
II-2-4- Caractérisation moléculaire des souches d’Actinomycètes
II-2-4-1- Extraction d’ADN génomique
i-But
ii-Principe
iii- Mode opératoire
II-2-4-2- Amplification par PCR de l’ADN
i-But
ii-Principe
iii- Mode opératoire
II-2-4-3- Vérification et purification du produit PCR
i-But
ii-Principe
iii- Mode opératoire
II-2-4-4-Séquençage
i-But
ii-Principe
iii- Mode opératoire
II-2-4-5- Analyse et alignement des séquences
II-2-5- Test d’activité antimicrobienne
II-2-5-1- But
II-2-5-2- Principe
II-2-5-3- Mode opératoire
i- Les souches pures à étudier
ii- Revivification des souches
iii- Rajeunissement des souches
iv- Préparation de l’inoculum
v- Ensemencement
vi- Lecture
II-2-6- Test d’activité antifongique
II-2-6-1- But
II-2-6-2- Principe
II-2-6-3- Mode opératoire
i- Revivification de souche de Fusarium
ii- Déroulement de la confrontation
iii- Evaluation des résultats
TROISIEME PARTIE : RESULTATS
III-1-Isolement des souches d’Actinomycètes
III-2-Pré-identification des souches d’Actinomycètes
III-2-1- Aspect macroscopique
III-2-2- Détermination des pigments mélanoïdes et diffusibles
III-2-3- Aspect microscopique
III-3-Coloration et caractéristiques biochimiques
III-3-1- Coloration de Ziehl-Neelsen
III-3-2- Caractéristiques biochimiques
III-4-Caractères physiologiques
III-5-Analyse phylogénétique des séquences de l’ADNr 16S
III-6-Test antimicrobien
III-7-Test antifongique
DISCUSSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Télécharger le rapport complet