Caractérisation histo-phénotypique et moléculaire des récidives lymphomateuses après traitement par CAR T-cells

Histologie et immunohistochimie

Les échantillons, fixés au formol tamponné 10%, étaient inclus en paraffine puis ont fait l’objet de colorations standard. Les anticorps utilisés pour les techniques immunohistochimiques sontdétaillés en annexe 1. Les analyses en FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) étaient réalisées sur des coupes paraffinées à 3µm à l’aide de sondes «break-apart» pour MYC/8q24, BCL2/18q21 et BCL6/3q27 (sondes Y5410, Y5407 et Y5408 ; Dako A/S).

Polymerase chain reaction (PCR)

L’ADN génomique tumoral était extrait à partir de coupes paraffinées à 10µm à l’aide du kit Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen Inc. Valencia, CA). Les échantillons amplifiés étaient ensuite quantifiés à l’aide du kit « Qubit dsDNA broad range assay » sur automate Qubit Fluorometer (Thermo Scientific). Les réarrangements des gènes codant pour les immunoglobulines (IG) et les récepteurs T (TCR) étaient étudiés en PCR multiplex ciblant TCRβ, TCRɣ, IGH et IGK, à l’aide de primers BIOMED-2 dans des conditions PCR standard(15). Chaque réaction était réalisée en duplicate. Les produits d’amplification étaient analysés par électrophorèse capillaire en hétéroduplex (QIAxcel, QIAGEN, Hilden, Allemagne) et GeneScan. De plus, la présence de CAR T-cells était mise en évidence dans l’ADN extrait à partir de 6 échantillons post-CART (patients #1, #2, #3, #5, #7 et #8), à l’aide de primers de PCR spécifiques des gènes de fusion 4-1BB et CD3 Zeta. Le gène GAPDH était utilisé en tant que gène contrôle.

Array comparative genomic hybridization (aCGH)

Cette technique permet de mettre en évidence les variations du nombre de copies de l’ADN (copy number alterations, CNAs), à l’aide de puces micro-array haute résolution selon le principe d’hybridation génomique comparative (SurePrint G3 Human 4×180 ; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EU). L’ADN tumoral était marqué au Cy5 et co-hybridé avec un échantillon commercial de référence marqué au Cy3 (Promega Madison, WI, EU), puis scanné à l’aide de l’automate Agilent Autofocus Dynamic Scanner (G2565BA ; Agilent). L’extraction des données était effectuée à l’aide du logiciel Agilent FEATURE EXTRACTION (version 10.7.1). L’analyse des données et leur visualisation était réalisée sur le logiciel Agilent GENOMIC WORKBENCH (version 6.5)

Next Generation Sequencing (NGS)

Un séquençage haut débit (Next Generation Sequencing, NGS) à l’aide d’un large panel ciblé était réalisé selon la méthode de capture, avec une profondeur médiane d’environ 1425 reads et 96% de cibles supérieures à 220 reads. Les échantillons étaient séquencés sur un automate Illumina NextSeq 500. Le séquençage exonique complet de 795 gènes impliqués dans des cancers (notamment les lymphomes) était réalisé. Les reads étaient alignés sur la séquence de référence (Human genome, GRCh38) à l’aide du logiciel BWA mem (v0.7.17) et dédupliqués à l’aide du logiciel Picard MarkDuplicates (v2.18.27). Les variants étaient pris en compte s’ils présentaient une fréquence allélique minimale de 5%. Après élimination des artéfacts et polymorphismes, les variants détectés sur les deux brins et associés à des mutations faux-sens, décalages du cadre de lecture, insertion/délétion, du site d’épissage et non-sens étaient conservés.

RNA sequencing

Les ARN étaient isolés à partir de coupes pré et post-CART du patient #1, à l’aide du Trizol reagent kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, EU). La préparation des librairies était effectuée à l’aide du kit TruSeq mRNA Sample Prep Kit v2 (Illumina), puis celles-ci étaient séquencées sur un automate NextSeq500. Les transcrits étaient quantifiés avec le logiciel kallisto puis normalisés et transformés en Log (cpm) grâce au logiciel EdgeR (Bioconductor).

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Table des matières

Introduction
Matériel et méthodes
Choix des patients
Histologie et immunohistochimie
Polymerase chain reaction (PCR)
Array comparative genomic hybridization (aCGH)
Next Generation Sequencing (NGS)
RNA sequencing
Résultats
Etude de cas
Observation #1
Observation #2
Observation #3
Observation #4
Observation #5
Observation #6
Observation #7
Observation #8
Observation #9
Synthèse des résultats
Discussion
Conclusion
Bibliographie
Annexes