Soutenance mémoire
La phase hépatique ou phase exo-érythrocytaire
Les premières formes infectantes, appelées sporozoïtes, sont inoculées chez l’homme pendant le repas sanguin de l’anophèle femelle. Ces sporozoïtes atteignent le foie au bout de 30 minutes environ. Des recherches récentes ont mis en évidence l’existence d’un système plus complexe au cours de l’invasion. Les sporozoïtes persistent au niveau de l’épiderme pendant des heures, puis sont relargués doucement au niveau des capillaires où ils peuvent migrer en suivant le système lymphatique [6, 7]. Au niveau des hépatocytes, les sporozoïtes subissent des séries de divisions nucléaires aboutissant à la formation des schizontes. Chaque schizonte hépatique libère des dizaines de milliers de mérozoïtes (10 000 à 30 000) capables à leur tour d’envahir les globules rouges. La période séparant l’injection des sporozoïtes par le vecteur et l’apparition des premiers trophozoïtes sanguins s’appellent la « phase prépatente ». Elle varie selon les espèces. Elle est courte moins de 9 jours chez P. falciparum, de 11 à 13 jours chez P. vivax, de 10 à 14 jours chez P. ovale, de 15 jours chez P. malariae, et enfin, de 9 à 12 jours pour P. knowlesi. Les infections à P.vivax et à P.ovale peuvent rester quiescentes sous la forme d’hypnozoïtes. Ces formes sont à l’origine des reviviscences ou recrudescences provoquant des signes cliniques, des mois voire des années plus tard. Cependant, la phase hépatique est asymptomatique et sa durée est spécifique de chaque espèce.
Le diagnostic par la microscopie
La méthode de référence pour la détection de Plasmodium est l’examen microscopique. L’identification des parasites se fait par la reconnaissance de la morphologie propre des stades de développement de l’espèce plasmodiale (cf. annexe 4 : Examen microscopique de Plasmodium sp). De plus, la charge parasitaire peut être estimée, paramètre utile pour évaluer l’évolution de la réponse parasitologique lors des études d’efficacité thérapeutique d’un antipaludique [22]. Le diagnostic microscopique effectué par un personnel bien formé a une bonne sensibilité. Dans la pratique, le seuil de détection est estimé entre 4 à 20 parasites par microlitre de sang [23]. Cependant, la sensibilité dépend de la qualité de l’équipement, des réactifs, et surtout de l’expérience du technicien et l’investissement de temps. Les problèmes résident souvent en la présence des artefacts entraînant de faux positifs [24], ou à l’inverse de faux négatifs en cas de faible parasitémie, à cause du manque d’expérience du microscopiste, ou faute de temps pour l’examen des frottis [25]. La microscopie n’est pas à l’abri des problèmes d’identification des espèces autres que P. falciparum surtout P. vivax et P. ovale [26, 27] , et peut parfois conduire à une sous-estimation des infections mixtes [28].
Le diagnostic par PCR
Les techniques de biologie moléculaire basées sur la PCR se sont révélées être l’une des méthodes de diagnostic du paludisme les plus spécifiques et les plus sensibles. La PCR permet de détecter non seulement des infections palustres à très faible parasitémie (1 à 5 parasites par microlitres de sang) mais aussi les infections mixtes [36]. Les techniques consistent à amplifier des régions très conservées comme ssrRNA ou CytB de chaque espèce plasmodiale permettant ainsi leur identification. La PCR facilite également l’identification de P. knowlesi, la cinquième espèce infectant l’homme [37, 38]. Bien que la PCR affiche une sensibilité et une spécificité remarquables, son utilisation en routine dans les centres de santé, ou dans les centres hospitaliers, n’est pas encore envisageable car la méthode exige des environnements techniques répondant à certaines normes (appareils et locaux) et du personnel bien formé. Par conséquent, la PCR n’est pas systématiquement mise en œuvre dans les pays en voie de développement en raison de la complexité de l’approche et du manque de ressources
Les moustiquaires imprégnées d’insecticides
La campagne de distribution gratuite de moustiquaires imprégnées d’insecticides (pyréthrinoïde de synthèse) a commencé parmi 10 districts cibles à Madagascar depuis 2005. A part les Hautes Terres Centrales (HTC), le but est d’avoir une moustiquaire imprégnée d’insecticide à efficacité durable (MID) pour deux personnes tous âges confondus dans chaque ménage. Des indicateurs d’impact sont encore utilisés pour vérifier l’efficience des campagnes menées comme le pourcentage d’enfants de moins de 5 ans et des femmes enceintes dormant sous MID. L’Enquête Démographique et de Santé (EDS) en 2004 a montré que le taux de possession de moustiquaire imprégnée ou non d’insecticide variait respectivement de 11% à 34% sur les marges de la région centrale et le Sud, et de 62% à 82% dans les régions Est et Ouest de l’île. De 2006 à 2008, 3,6 millions de moustiquaires à imprégnation durable ont été distribués [42]. La dernière Enquête sur les Indicateurs du Paludisme à Madagascar (EIPMD) 2011 a montré que plus 4 ménages sur cinq disposaient d’au moins une Moustiquaire Imprégnée d’insecticide à efficacité Durable (MID) et trois ménages sur cinq (60%) possédaient au moins une MID pour 3 personnes. La possession d’une MID pour deux personnes est encore faible au niveau national, seulement le tiers des ménages (33 %) en possède. Dans l’ensemble, 85 % des MID disponibles dans les ménages ont été utilisés la nuit précédant l’enquête dont 77% par des enfants de moins de cinq ans et également 77% des femmes enceintes de 15 à 49 ans.
Le diagnostic biologique du paludisme
La confirmation biologique de tous les cas suspects de paludisme par la microscopie ou l’utilisation deTDR au niveau des formations sanitaires a été adoptée en 2006.L’enquête sur les indicateurs du paludisme à Madagascar en 2011 (EIPMD), figure 6a, a permis de cartographier la prévalence du paludisme à Madagascar chez les enfants de 6 à 59 mois par la microscopie. Entre Mars et Mai 2011, dans l’ensemble de Madagascar, la prévalence du paludisme était de 9 %. Les écarts selon le milieu de résidence sont très importants : la prévalence est 4 fois plus élevée en milieu rural (9 %) par rapport au milieu urbain (2 %). Les infections à P. falciparum représentent 99% des cas, et les infections à P. malariae moins de 1 %. Dans les zones rurales de Madagascar, les TDR jouent un rôle primordial dans la gestion des fièvres. Ils peuvent être aussi bien utilisés par les personnels de santé au niveau des Centres de Santé de Base (CSB), où la microscopie n’est généralement pas disponible, et par les agents communautaires dans les zones difficiles d’accès ou loin des structures de santé. Egalement, les résultats de ces TDR enregistrés et envoyés au central de surveillance épidémiologique permettent une riposte rapide en cas d’augmentation des seuils d’alerte des indicateurs de surveillance (voir paragraphe surveillance épidémiologique). Aussi, d’après les figures 6b et 6c, les informations remontant des sites sentinelles de surveillance de la fièvre montrent une recrudescence des cas du paludisme presque dans toute l’île en 2012. Même au niveau hospitalier, les TDR ont été d’une grande utilité vu le nombre de cas à gérer (Figure 6).
|
Table des matières
Introduction
Partie I : Généralités
I. 1 – Le paludisme : de la biologie au diagnostic
1.1 Cycle de développement de Plasmodium
1.1.1 La phase hépatique ou phase exo-érythrocytaire
1.1.2 La phase érythrocytaire ou phase intra-érythrocytaire
1.1.3 La phase sexuée chez l’anophèle
1.2 Le diagnostic du paludisme
1.2.1 Le diagnostic par la microscopie
1.2.2 Le diagnostic par bandelettes réactives ou test de diagnostic rapide (TDR)
1.2.3 Le diagnostic par PCR
I. 2 – Le paludisme à Madagascar
2.1 Historique du paludisme à Madagascar
2.2 Faciès épidémiologiques à Madagascar
2.2.1 Le faciès équatorial
2.2.2 Le faciès tropical
2.2.3 Le faciès des Hauts Plateaux
2.2.4 Le faciès subdésertique
2.2.5 Le faciès sans paludisme
2. 3 Lutte contre le paludisme à Madagascar
2.3.1 La prévention
2.3.2 Le diagnostic biologique du paludisme
2.3.3 La prise en charge du paludisme
2.3 .4 Le système de surveillance épidémiologique
2. 3. 5 Surveillance de la résistance aux antipaludiques
I. 3 – L’ingénierie des protéines recombinantes
3.1 Optimisation des séquences et/ou des protéines à exprimer
3.1.1 Codons rares
3.1.2 Taille et domaine de la protéine
3. 2 Les plasmides ou vecteurs
3.2.1 L’origine de réplication
3.2.2 Le promoteur
3.2.3 Les protéines de fusion
3.2.4 Les séquences responsables de la transcription
3.2.5 Les séquences responsables de la traduction
3. 3 Choix du système d’expression
3.3.1 Le système d’expression eucaryote
3.3.2 Le système d’expression procaryote
3.3.3 Cas de la production des anticorps recombinants
3.4 Problématique et justificatifs relatifs à nos travaux de thèse
Partie II : Matériels et méthodes
II.1 Matériels
II.1.1 Isolats collectés chez les patients impaludés
II.1.2 Souche Plasmodium falciparum 3D7
II.1.3 Anticorps
II.1.4 Souches bactériennes
II.2 Méthodes
A- Les anticorps monoclonaux et Fab anti-HSP70, la protéine recombinante i-72
A.1 Caractérisation des anticorps anti-HSP70 G4C17, E5A12 et C9C11
A.1.1 Culture en continue de P. falciparum 3D7 et préparation d’antigène
A.1.2 Western blotting ou immunoblotting
A.1.3 Immunofluorescence indirecte
A.1.4 “Epitope mapping” par Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ou ELISA
A.2 Evaluation test ELISA sandwich HSP70 par rapport à la microscopie, TDR et la PCR
A.2.1 Microscopie
A.2.2 TDR
A.2.3 La PCR nichée ou Nested PCR
A.2.4 Test ELISA sandwich HSP70 sur des isolats du terrain
A.3 Expression de la protéine recombinante HSP70 et les FabG4C17 et E5A12
A.3.1 La protéine recombinante HSP70 ou i-72.
A.3.2 Expression des Fab recombinants
B- Les anticorps monoclonaux anti-HRP2, la protéine recombinante HRP2 et les Fab antiHRP2
B.1 Caractérisation des anticorps monoclonaux sur des isolats en culture et provenant du terrain
B.1.1 Test ELISA sandwich HRP2 sur des isolats de P. falciparum en culture
B.1.2 Test ELISA sandwich HRP2 sur des isolats du terrain
B.2 Production de MalE-HRP2
B.3 Vérification de la fonctionnalité des Fab 1546-H6
B.3.1 Sur l’extrait d’antigène
B.3.2 Sur la protéine recombinante HRP2
C- Analyse statistique
Partie III : Résultats, discussion et conclusion
III.1 Caractérisation des anticorps anti-HSP70
III.1.1 Caractéristiques des anticorps monoclonaux anti-HSP70, G4C17 et E5A12
III.1.2 Analyse de la réactivité croisée des anticorps anti-HSP70
III.1.3 Test ELISA « sandwich »
III.2 Performance des anticorps anti-HSP70 comparée à la microscopie, TDR et PCR
III.2.1 Analyse descriptive des isolats de Plasmodium collectés et testés
III.2.2 Diagnostic par la microscopie
III.2.3 Diagnostic du paludisme par TDR CareStartTM
III.2.4 Diagnostic du paludisme par PCR nichée
III.2.5 ELISA HSP70 comparée à la microscopie, au TDR et à PCR nichée dans le diagnostic du paludisme
III.3 Expression et production de la protéine recombinante HSP70 ou i-72
III.4 Expression et production des Fab recombinants
III.4.1 Amplification des chaines légères CL et chaines lourdes CH
III.4.2 Séquences consensus des Fab anti-HSP70
III.4.3 Expression des Fab-G4C17-His6 et Fab-E5A12-His6
III.5 Anticorps monoclonaux, Fab anti-HRP2, protéine recombinante HRP2
III.5.1 Sensibilité de l’ELISA HRP2 sur des isolats de P. falciparum en culture
III.5.2 Performance de l’ELISA HRP2
III.5.3 Production de la protéine recombinante HRP2
III.5.4 Vérification de la fonctionnalité de FabF1546-H6
Discussion
Le système E5A12/G5C17/C9C11/HSP70
Caractérisation des anticorps sur culture de P. falciparum et des patients impaludés
Protéines i-72 et les anticorps recombinants Fab-G4C17-H6, Fab-E5A12
Possibilité de diagnostic différentiel pour P. vivax ?
Le système F1110/F1546/PfHRP2
Production de la protéine HRP2
Anticorps anti- Fab-F1110 et F1546 : nouvelle génération de TDR
Conclusion et perspectives
Bibliographie
Annexes
Télécharger le rapport complet
