Caractérisation d’une bactériocine produite par une bactérie lactique Leuconostoc pseudomesenteroides isolée du boza

Présence des bactéries à l’état libre dans l’environnement

  Dans l’environnement, les bactéries lactiques sont souvent retrouvées dans le lait et ses dérivés (lait fermenté, fromages, …). Les différentes espèces de Lactobacillus, Lactococcus lactis (Lc. lactis) et/ ou Lc. garvieae, les plus rencontrées dans le lait et le fromage, sont communément utilisées comme ferments (« starter culture ») par l’industrie agroalimentaire pour la production de produits laitiers. Un ferment désigne un microorganisme, bactérie ou champignon, responsable de la fermentation. Aussi, les bactéries lactiques sont à l’origine de la fermentation utilisée pour la préparation de boissons à partir de plantes (boza, cidre, …). Parmi elles, on distingue des espèces appartenant aux genres Lactobacillus et Leuconostoc (Gálvez et al., 2011). Acidotolérantes, les bactéries lactiques sont capables de survivre dans des milieux très acides en raison de leur production d’acide lactique. De plus, l’acidification du milieu participe à l’inhibition de la croissance de certains microorganismes pathogènes, tels que Listeria monocytogenes (Li. monocytogenes). Cette espèce bactérienne pathogène présente dans les aliments (lait, fromage, boissons) est responsable d’infections graves comme la listériose chez l’Homme, qui affectent en particulier la femme enceinte (Gálvez et al., 2011).

Définition des fermentations

   La fermentation est un processus produisant de l’énergie par oxydation de composés organiques, principalement des glucides, où un donneur d’électron, NADH cède ses électrons à un accepteur endogène, le pyruvate (Figure I. 2). Dans la respiration les électrons sont donnés à un accepteur exogène, l’oxygène pour la respiration aérobie et le nitrate ou le sulfate pour la respiration anaérobie. La fermentation ne nécessitant pas l’absence totale d’oxygène, certaines levures comme Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) et certaines bactéries comme Lactobacillus plantarum (Lb. plantarum) utilisent la fermentation en présence d’oxygène pour dégrader les sucres (Prescott et al., 2003, Weiss et al., 1968). Les sucres tels que le glucose, le fructose, le lactose ou le saccharose sont les substrats les plus utilisés pour la fermentation, engendrant la production d’énergie et de métabolites comme l’acide lactique et l’éthanol avec un dégagement de gaz (CO2) dans certains cas. Cependant d’autres métabolites, moins communs comme l’acide butyrique et l’acétone sont produits au cours de la fermentation.

Origine des bactéries lactiques

   Les bactéries lactiques ont été retrouvées dans des sédiments datant de 2,75 milliards d’années bien avant l’apparition d’oxygène dans l’atmosphère, ce qui pourrait expliquer leur caractère anaérobie (Quiberoni et al., 2001). De plus, des études sur la phylogénie bactérienne mentionnent leur apparition avant celle des cyanobactéries (Quiberoni et al., 2001). D’autres études montrent que certaines bactéries lactiques, comme Lb. lactis, sont en voie d’acquérir une chaîne respiratoire (Duwat et al., 2001).

Diversité des bactéries lactiques

   Les bactéries lactiques regroupent de nombreux genres bactériens tels que Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella,… (Tableau I. 1, Figure I. 3.). De plus, l’utilisation des séquences de gènes codant les ARN 16S et 23S a conduit à l’identification de nouveaux genres bactériens parmi des bactéries lactiques, tels que Carnobacteria, Enterococcus, Tetragenococcus et Vagococcus issue d’une evolution taxonomique (Vandamme et al., 1996). Parmi les bactéries lactiques, Lactobacillus présente le genre le plus répandu. Ce dernier comprend à lui seul de nombreuses espèces qui diffèrent par leurs caractéristiques phénotypiques, biochimiques et génétiques (Vandamme et al., 1996).

Utilisation des bactéries lactiques productrices de bactériocine(s)

   C’est durant le XIXe siècle, au Danemark, que la première boisson fermentée fabriquée à partir d’un mélange de souches bactériennes isolées à partir de lait cru a été commercialisée. Le concept de ferment a ensuite évolué au début du XXe siècle après l’identification de quelques souches impliquées dans la fermentation. Grâce à leur propriétés d’acidification et de production de polysaccharides, les bactéries lactiques ont souvent été utilisées en co-cultures pour initier et/ ou améliorer la fermentation de nombreux aliments comme la choucroute, les saucisses ou les olives vertes (Settanni et Corsetti, 2008). Cependant, une des caractéristiques des bactéries lactiques qui leur permet de se placer comme bio-conservateur est leur production de molécules antimicrobiennes (Settanni et Corsetti, 2008). La production de bactériocine in situ offre de nombreux avantages comparée à la production de bactériocine ex situ, comme le coût ou l’augmentation de la compétition avec la microflore résidente augmentant ainsi l’inhibition de croissance des bactéries pathogènes. La diminution du coût de préparation pourrait généraliser la pratique permettant aux pays en voie de développement où la sécurité alimentaire est le plus souvent compromise de bénéficier de ces applications (Holzapfel, 2002). D’autres qualités ont depuis été associées aux bactéries lactiques lorsqu’elles sont associées aux produits alimentaires comme l’augmentation des valeurs nutritionnels des aliments, la réduction de la formation de produits toxiques et la propriété de probiotique. En plus de la propriété de bioconservation, plusieurs propriétés ont été attribuées aux bactéries productrices de bactériocines telles que la diminution des gaz dus à la fermentation ainsi qu’à l’amélioration du goût et de la qualité du produit fini. Grâce à leur activité protéolytique et leur acidification importante du milieu, les bactéries productrices de bactériocines sont utilisées soit pour initier la fermentation soit pour jouer le rôle d’adjuvant en présence d’une bactérie initiatrice de fermentation (Gálvez et al., 2011). Aussi, la croissance de la co-culture ne doit avoir aucun effet sur les propriétés physicochimiques et organoleptiques du produit fini, ni interférer avec celles-ci. De plus, la bactérie productrice doit être prédominante et capable de produire sa bactériocine à n’importe quelle température, pendant la réfrigération ou à température ambiante, afin d’empêcher la croissance et la prolifération des bactéries pathogènes dans les aliments (Holzapfel et al., 1995). Les bactéries productrices sont aussi utilisées comme cultures bio protectrices dans les aliments non fermentés dans la mesure où elles ne présentent aucun effet négatif sur le produit fini. De nombreuses souches bactériennes productrices de bactériocines sont actuellement utilisées dans les produits alimentaires fermentés, tels que les produits laitiers, les viandes, les poissons ou les légumes. Les souches bactériennes du genre Lactococcus sont les bactéries productrices de bactériocines les plus utilisées. La souche bactérienne productrice de la nisine, Lc. lactis, est souvent utilisée lors de la fermentation de fromages comme le Manchego ou le Camembert en raison de ses propriétés antibactériennes dirigées contre Li. monocytogenes et Staphylococcus aureus (Sta. aureus) (Gálvez et al., 2008). Les souches productrices de nisine Z sont aussi utilisées pour limiter les gaz produits lors de la fermentation, qui sont le plus souvent dus à une surcroissance de spores de Clostridium et en particulier de Cl. tyrobutyricum. La souche productrice de lacticine 3147 est aussi utilisée pour le contrôle de la prolifération de Li. monocytogenes dans les aliments tels que les fromages fabriqués à partir du lait écrémé (O’Sullivan et al., 2006). L’optimisation de l’arôme du fromage pourrait être réalisée par l’utilisation des souches productrice de lacticine 3147 en combinaison avec des cultures bactériennes productrices d’aminotransférases et de décarboxylases (Fernández de Palencia et al., 2004). Du fait de leur robustesse, leur présence naturelle dans différents produits alimentaires et leur production de nombreuses bactériocines, Enterococcus faecalis (En. faecalis) et En. faecium productrices de bactériocines sont largement utilisées comme adjuvants (Franz et al., 2007). Les bactéries appartenant au genre Pediococcus productrices de bactériocines ne sont pas adaptées à la fabrication des produits laitiers fermentés de par leur manque ou leur lenteur de fermentation du lactose (Papagianni et Anastasiadou, 2009). En revanche, la souche Pediococcus acidilactici productrice de pédiocine PA-1/ AcH s’est révélée être responsable de la bonne conservation de la viande en diminuant les populations de Li. monocytogenes et de Clostridium perfringens (Rodríguez et al., 2002). Les bactéries lactiques sont, de loin, la catégorie de microorganismes la plus utilisée dans la production de produits alimentaires contribuant ainsi à la texture et au goût des produits fermentés. Par ailleurs, la production par ces bactéries de métabolites tels que les peptides antimicrobiens et l’acide lactique, permet d’inhiber la prolifération des microorganismes pathogènes et d’assurer ainsi une bonne conservation des aliments (Pot, 2008).

Définition d’un probiotique

   Les probiotiques sont des microorganismes vivants, qui lorsqu’ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent un effet bénéfique sur la santé de l’hôte (FAO, 2001). Consommés depuis des centaines d’années, les produits laitiers ont toujours été considérés comme source de santé et de longévité, dans le Caucase et au Moyen-Orient. Ce n’est qu’à partir du XXe siècle, qu’Elie Metchnikoff évoqua une éventuelle relation entre la longévité de certaines populations et leur consommation de grandes quantités de lait fermenté. Plus tard, il isola deux espèces bactériennes Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (Str. salivarius subsp. thermophilus) et Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus auxquelles il attribua les bienfaits de « longue vie ». Ce n’est qu’en 1954, que le terme « probiotique » a été pour la première fois introduit dans la littérature par Ferdinand Vergin (Vergin, 1954). Pour optimiser leur croissance, les probiotiques nécessitent la présence de fibres composées d’oligosaccharides comme l’inuline extraite de la racine de chicorée, appelées prébiotiques. De nombreux microorganismes sont considérés comme probiotiques, parmi eux des bactéries lactiques telles que Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. casei, et Streptococcus thermophilus (Str. thermophilus). Lb. bulgaricus et Str. Thermophilus sont les premières souches bactériennes qui ont été utilisées pour la fabrication de yaourt. Ainsi, la dénomination yaourt ou yoghourt se réfère à un lait fermenté obtenu, selon des usages loyaux et constants, par le développement des seules bactéries lactiques thermophiles  spécifiques dites Str.thermophilus et Lb. bulgaricus qui doivent être ensemencées et se trouver vivantes dans le produit fini à raison d’au moins 107 bactéries par gramme. D’autre part, des levures comme S. boulardii et S. cerevisiae, communément utilisées dans la fabrication du pain, de la bière et du kéfir, sont également reconnues pour leurs propriétés probiotiques. S. boulardii a été isolée pour la première fois à partir de fruits de litchis et de mangoustans par le scientifique Français Henri Boulard en 1923. Il a été démontré, plus tard, que S. boulardii permet la restauration de la flore du gros intestin après des diarrhées causées par Vibrio cholerae (Dias et al., 1995).

Biosynthèse

   Les gènes impliqués dans la biosynthèse sont organisés en clusters dont le locus est symbolisé par lan (Asaduzzaman et Sonomoto, 2009) (Figure I. 10). Le système génétique impliqué dans la production des lantibiotiques est retrouvé sur le chromosome (subtiline) (Banerjee et Hansen, 1988), sur un plasmide (nukacine) (Aso et al., 2004a) ou sur des éléments transposables présents sur le chromosome (nisine) (Buchman et al., 1988). Le système génétique codant la nisine est le plus étudié et le mieux connu (Kuipers et al., 1993). Il est symbolisé par nis (Lubelski et al., 2008). Pour les lantibiotiques, le gène lanA (nisA pour la nisine) code le peptide immature ou peptide précurseur composé de 23 à 59 acides aminés (57 acides aminés pour la nisine). Le peptide précurseur est inactif et serait impliqué dans la protection de la souche productrice, mais son rôle précis demeure mal connu (van der Meer et al., 1994).

La classe IIb

   Les bactériocines, communément appelées « two-peptides », sont formées de deux peptides différents, α et β, dont l’activité antimicrobienne optimale nécessite la présence des deux peptides complémentaires, le plus souvent en quantité équimolaire (Garneau et al., 2002, Nissen-Meyer et al., 2009, Oppegård et al., 2007b). Dans certains cas, ces peptides peuvent être actifs individuellement comme c’est le cas de la lactacine F (Allison et al., 1994) et des plantaricines EF et JK(Anderssen et al., 1998). Depuis l’identification de la lactococcine G chez Lb. lactis (Nissen-Meyer et al., 1992), environ 15 bactériocines de la même classe ont été isolées et caractérisées (Figure I. 27). Ces bactériocines possèdent une taille très variable allant de 25 résidus (plantaricine J, PlnJ) à 62 résidus (thermophiline A, ThmA). Comme les autres bactériocines de classe II, les bactériocines de classe IIb possèdent un spectre d’activité incluant de nombreux genres de bactéries à Gram positif pathogènes telles que Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Listeria, Staphylococcus et Streptococcus ou commensales comme Lactobacillus, Lactococcus et Pediococcus (Garneau et al., 2002). Les systèmes génétiques impliqués dans la biosynthèse et la régulation des « two-peptides » sont organisés en clusters de gènes comportant de un à six opérons (Diep et al., 2009, Nissen-Meyer et al., 2010).

Table des matières

Introduction générale
Chapitre I : Les bactériocines produites par les bactéries à Gram positif. Origine, diversité et rôle dans la bioconservation
I. Les bactéries lactiques 
I.1. Généralités sur les bactéries lactiques
I.2. Habitat
I.2.1. Culture des bactéries lactiques
I.2.2. Présence des bactéries à l’état libre dans l’environnement
I.2.3. Présence des bactéries lactiques en association avec un hôte
I.3. Les fermentations
I.3.1. Définition des fermentations
I.3.2. Les fermentations lactiques
I.4. Diversité et taxonomie
I.4.1. Origine des bactéries lactiques
I.4.2. Diversité des bactéries lactiques
I.4.3. Taxonomie des bactéries lactiques
I.5. Utilisation des bactéries lactiques
I.5.1. Utilisation des bactéries lactiques productrices de bactériocine(s)
I.5.2. Notion d’un probiotique
a. Définition d’un probiotique
b. Rôle du probiotique
c. Applications des probiotiques
• Traitement des diarrhées
• Traitements gastriques
II. Les peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif
II.1. Définitions, généralités
II.2. Classification
III. Les bactériocines de classes I : les lantibiotiques 
III.1. Structure
III.2. Biosynthèse
III.3. Mode d’action
III.3.1. Le double mécanisme d’action
III.3.2. Inhibition de synthèse de la paroi bactérienne
IV. Les bactériocines de classe II 
IV.1. La classe IIa
IV.1.1. Structures tridimensionnelles
IV.1.2. Biosynthèse et régulation
a. Biosynthèse
b. Régulation
IV.1.3. Mode d’action et immunité
a. Mode d’actio
b. Immunité
IV.2. La classe IIb
IV.2.1. Structure
IV.2.2. Biosynthèse et régulation
a. Biosynthèse
b. Régulation
IV.2.3. Mécanisme d’action et immunité
a. Mécanisme d’action
b. Immunité
IV.3. La classe IIc : les bactériocines circulaires
IV.3.1. Structure
IV.3.2. Biosynthèse
IV.3.3. Mécanisme d’action et immunité
a. Mécanisme d’action
b. Mécanisme d’immunité
IV.4. La classe IId : les bactériocines linéaires, non modifiées, non « pediocin-like »
IV.4.1. Les différentes bactériocines de classe IId
a. Bactériocines sécrétées via le système Sec
b. Bactériocines dépourvues de peptide « leader » et de séquence signal (« leaderless »)
• Bactériocines produites par des bactéries du genre Enterococcus
• Bactériocines produites par des bactéries du genre Staphylococcus
• Bactériocines produites par des bactéries du genre Lactobacillus
c. Bactériocines « autres »
• La lactococcine A et les bactériocines homologues
• L’entérocine B et les bactériocines homologues
IV.4.2. Mode d’action
a. La lactococcine
b. La lactococcine 972
V. Les applications des bactériocines 
V.1. Les bactériocines en agalimentaire
V.1.1. Applications
V.1.2. Conditionnements
V.2. Les applications médicales des bactériocines
V.2.1. Applications
a. Traitements d’infections cutanées
b. Traitements de la gingivite
c. Traitements de la mastite
d. Traitements de l’otite
e. Traitements d’infections systémiques
f. Traitements d’infections urogénitales et contraception
V.2.2. Conditionnements
V.3. Limites d’utilisations des bactériocines
Matériels et méthodes
I. Méthodes bactériologiques 
I.1. Souches et plasmides
I.1.1. Souches bactériennes
I.1.2. Plasmides
I.2. Milieux de culture
I.2.1. Milieux liquides
I.2.2. Milieux gélosés
I.2.3. Antibiotiques
I.3. Identification bactérienne
I.3.1. Coloration Gram
I.3.2. Galerie API
I.4. Activité antibactérienne
I.4.1. Tests en milieu solide
I.4.2. Tests en milieu liquide
I.4.3. Effet de la leucocine KM432Bz sur la croissance bactérienne
I.5. Biofilms
I.5.1. Formation de biofilms
I.5.2. Effet de la leucocine 432Bz sur la faisabilité des biofilms
I.5.3. Effet de la leucocine KM432Bz sur des biofilms
II. Méthodes de biologie moléculaire 
II.1. Manipulation d’ADN
II.1.1. Purification
a. Extraction d’ADN génomique
b. Extraction d’ADN plasmidique
• Bactéries à Gram négatif
• Bactéries à Gram positif
II.1.2. Dosage d’ADN
a. Au spectrophotomètre
b. Sur gel d’agarose
II.1.3. Digestions
II.2. Amplification d’ADN
II.2.1. Réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction)
II.2.2. Electrophorèse sur gel d’agarose
a. Champ continu
b. Champ pulsé
II.2.3. Interaction sonde-ADN
a. Transfert sur membrane Hybond
• “Southern Blot”
• “Dot Blot” :
b. Marquage de la sonde à la digoxygénine-11-dUTP (DIG-11dUTP)
c. Hybridation
d. Détection et révélation du signal
e. Déshybridation et conservation de la membrane
• Déshybridation thermique
• Déshybridation chimique
II.3. Clonages
II.3.1. Préparation des inserts d’ADN
II.3.2. Préparation des vecteurs
a. Digestion
b. Déphosphorylation
II.3.3. Ligation (conditions)
a. pGEM®-T Easy
b. pBR322
II.3.4. Préparation de cellules compétentes
II.3.5. Transformation
II.3.6. Sélection des clones
II.4. Séquençage
III. Production et purification de la bactériocine KM432Bz 
III.1. Culture de la souche KM432Bz
III.2. Purification de la bactériocine KM432Bz
III.2.1. Préparation et traitement du surnageant de culture
III.2.2. Précipitation au sulfate d’ammonium et dialyse
III.2.3. Extraction en phase solide sur cartouche C18 (35CC)
III.2.4. Purification par chromatographie liquide haute performance (C18Inertsil ODS2)
IV. Caractérisation de la bactériocine KM432Bz 
IV.1. Dosage de la bactériocine KM432Bz
IV.1.1. Dosage de Bradford
IV.1.2. Absorbance à 280 nm
IV.2. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS Tris-tricine (SDS-PAGE)
IV.2.1. Préparation du gel et des échantillons
IV.2.2. Colorations
a. Au bleu de Coomassie G-250 (principe présenté dans le paragragraphe IV.1.a)
b. Au nitrate d’argent
IV.2.3. Détection d’activité antibactérienne sur gel (gel overlay)
IV.3. Spectrométrie de masse
IV.3.1. MALDI-TOF
IV.3.2. ESI-qTOF
IV.4. Détermination de la séquence peptidique
IV.4.1. Réduction et alkylation
IV.4.2. Digestions enzymatiques
IV.4.3. Séquençage par dégradation d’Edman
a. Purification du peptide réduit et alkylé par CLHP
b. Dégradation d’Edman
IV.4.4. Séquençage par spectrométrie de masse (LC-MS/MS)
Chapitre II : Caractérisation d’une bactériocine produite par une souche de Leuconostoc pseudomesenteroides isolée du boza
I. Publication 
II. Synthèse des résultats 
II.1. Identification de la souche productrice KM432Bz
II.2. Caractérisation de la bactériocine KM432Bz
II.3. Caractérisation du cluster de gènes impliqué dans la biosynthèse de la leucocine KM432Bz
II.4. Spectre d’activité de la leucocine KM432Bz
III. Résultats complémentaires 
III.1. Caractérisation de la bactériocine KM432Bz
III.2. Implication de EIIt Man dans le mode d’action de la leucocine KM432Bz
III.3. Effet de la leucocine KM432Bz sur des biofilms
a. Effet de la leucocine KM432Bz sur la formation d’un biofilm
b. Effet de la leucocine KM432Bz sur un biofilm préformé
III.4. Recherche du gène codant le précurseur de la leucocine KM432Bz chez autres espèces de Leuconostoc
Discussion générale, conclusions et perspectives
Bibliographies

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