Soutenance mémoire
Les symbioses Légumineuse-Rhizobium
Les Généralités
Les symbioses rhizobiennes sont des associations entre les plantes de la superfamille des légumineuses et des bactéries de type Rhizobium permettant de réduire l’azote atmosphérique en des formes assimilables par les plantes. Au cours de ces interactions, un nouvel organe, le nodule, est formé sur les racines ou plus rarement sur les tiges à partir de primordia racinaires dormants et disposés en rang le long de la tige. C’est au sein de cet organe protecteur que l’azote atmosphérique est fixé par les bactéries (Ferguson et al., 2010 ; Oldroyd, 2013). A ce jour, les seules plantes non légumineuses capables de noduler avec des rhizobia (Sinorhizobium et Bradyrhizobium spp.) sont de petits arbres tropicaux appartenant au genre Parasponia, de la famille des Cannabaceae. La formation du nodule est un processus complexe comprenant plusieurs étapes : la pré-infection, l’infection (intracellulaire ou intercellulaire ou « crack entry »), le développement, le fonctionnement et la sénescence du nodule. Plusieurs gènes ont été caractérisés au cours de ces différentes étapes.
Bases moléculaires de la transduction du signal Facteur NOD
Ici, nous n’allons pas développer toutes les bases moléculaires de la symbiose Légumineuse-Rhizobiummais donner quelques unes gouvernant surtout celles de la voie de signalisation NOD. L’interaction commence avec la colonisation de jeunes poils absorbants par les diazotropheset un échange de molécules signal (Fig. 3). Les bactéries reconnaissent des flavonoïdeset d’autres molécules sécrétées par la plante-hôte. Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires dérivés de la voie des phénylpropanoïdes. Ceux qui sont présents dans les exsudats racinaires induisent l’expression des gènes nod bactériens qui gouvernent la production des facteurs Nod(FN). Les FN sont des lipochitooligosaccharides (LCO), formés d’une suite de 4 ou 5 unités de N-acétyl-D-glucosamineréunies par des liaisons β (1 → 4) (structure de la chitine), et comprenant une chaîne lipidique (acetyl). Des études fonctionnelles chez les légumineuses modèles (Medicago truncatula, Lotus japonicus) ont révélé plusieurs gènes essentiels à la symbiose en particulier lors de l’étape de pré-infection ou de reconnaissance symbiotique. Ces analyses ont été facilitées par la découverte des FN dont les décorations variables entrainent la spécificité d’hôtes. Ces facteurs induisent des événements morphologiques, physiologiques et moléculaires. Le FN est perçu au niveau membranaire par des récepteurs kinase à domaine LysM de type RLK (Haney et al., 2011 ; Madsen et al., 2011 ; Lefebvre et al., 2012), induisant des oscillations calciques décodées par un canal cationique de la membrane nucléaire DMI1 (Ané et al., 2004), un récepteur kinase de type LRR DMI2 (Endre et al., 2002) et une kinase dépendante de la calmoduline et du calcium CCaMK/DMI3 (Mitra et al., 2004). Ces oscillations sont déclenchées par la perception des FN. Elles induisent l’activation d’un facteur de transcription IPD3/CYCLOPS phosphorylé par DMI3 et d’une série de régulateurs transcriptionnels (NIN, sous-unités NF-Y, ERN) et enfin, les gènes impliqués dans l’infection et l’organogenèse nodulaire (Suzaki et Kawaguchi, 2014). Les mécanismes précis de transduction des signaux sont encore inconnus.
Ces approches ont également démontré le rôle infectieux de certains gènes nécessaires à la reconnaissance symbiotique. Si la symbiose légumineuses-Rhizobiumest considérée comme la plus étudiée, l’association entre les espèces actinorhiziennes et l’actinomycète du sol Frankia reste à être explorée.
Les symbioses actinorhiziennes
Les symbioses actinorhiziennes sont des associations durables à bénéfice réciproque entre 260 espèces d’angiospermes et les bactéries du sol du genre Frankia. Elles s’établissent en situation de carence azotée et de photosynthèse active (Wall, 2000).
Les plantes actinorhiziennes
Généralités
Les plantes actinorhiziennes (Fig. 4) sont susceptibles d’établir des symbioses fixatrices d’azote avec les bactéries filamenteuses du genre Frankia. Il s’agit d’angiospermes appartenant à 24 genres répartis dans 8 familles (Betulaceae, Casuarinaceae, Coriariaceae,Datiscaceae, Elaeagnaceae, Myricaceae, Rhamnacaceae et Rosaceae). Elles sont pour la plupart des ligneuses pérennes à l’exception de Datisca qui est une herbacée. Les espèces actinorhiziennes sont capables de s’adapter à une grande variété de stress comme une forte salinité ou un pH extrême (Dawson, 1990 ; Sprent et Parsons, 2000). Les plantes actinorhiziennes constituent après les légumineuses, le deuxième groupe de plantes fixatrices d’azote (240 et 350 kg/ha/an) (Wall, 2000). Parmi celles-ci, figurent les essences de la famille des Casuarinaceae qui sont très résistantes à la salinité (Casuarina glauca ; El-Lakany etShepherd, 1983), et à la sécheresse (Allocasuarina decaisneana). Elles favorisent également les processus pédogénétiques conduisant à la formation d’un sol fertile (Moiroud, 1996).
A ce jour, aucun mutant chez ces espèces n’a été généré car ce sont des ligneuses pérennes et difficiles à transformer génétiquement. De plus, aucun génome de ces arbres n’a encore été séquencé. Ce qui constitue des freins à la compréhension des mécanismes moléculaires mis en place lors des symbioses actinorhiziennes et explique en partie le fait qu’elles soient moins étudiées que la symbiose rhizobienne.
Répartition écologique des plantes actinorhiziennes
Les espèces actinorhiziennes sont réparties sur tous les continents à l’exception de l’antarctique (Duhoux et Franche, 2003). Leur répartition écologique est assez disparate: Myrica galese développe dans les marais ou étangs, les espèces d’aulne s’adaptent mieux le long des cours d’eau, les Casuarinaceaepeuvent croître sur les sites marécageux, les bords des marées, les estuaires, les mangroves, les forêts ouvertes parfois près des fronts de plage.
Les Casuarinaceae ont une aire d’origine qui s’étend de l’Australie aux îles du Pacifique et au Sud-est de l’Asie (National Research Council, 1984).
Etude bibliographique
Parmi ces espèces, 5 appartenant au genre Casuarina, 3 au genre Allocasuarinaet 1 au genre Gymnostomaont été largement introduites en Afrique (Gtari et Dawson, 2011). Dans certains pays d’Afrique dont le Sénégal, Casuarina est largement planté alors que dans d’autres comme le Gabon sa présence est très réduite et se limite à la décoration. L’introduction de Casuarinadépend de plusieurs facteurs : les conditions climatiques dans la zone concernée, la proximité de la mer, le vent, l’érosion des sols et les carences minérales du sol à la plantation des sites (Sayed, 2011).
Importance des plantes actinorhiziennes : L’exemple de la famille des Casuarinaceae
Présentation de la famille des Casuarinaceae
Les espèces de la famille des Casuarinaceae sont caractérisées par des rameaux chlorophylliens et des feuilles réduites à des écailles verticillées et cornées ce qui limite les déperditions en eau.
Propriétés
Les Casuarina sont des espèces à croissance rapide, édificatrices et susceptibles d’établir des symbioses avec des microorganismes du sol tels que la bactérie Frankiaet les champignons endomycorhiziens pour combler le déficit minéral dans des conditions limitantes en azote et en phosphore. En cas de carence en fer et en phosphore, des racines protéoïdes apparaissent pour améliorer la nutrition minérale (Neumann et Martinoia, 2002).
Les racines protéoïdes forment des groupes denses de courtes radicelles latérales très rapprochées.
Utilisations
Grâce à ces propriétés, les Casuarina présentent un grand intérêt écologique ce qui justifie leur large utilisation dans les grands programmes de revégétalisation et en agroforesterie.
En Inde, des associations culturales entre les espèces à intérêt agronomique et les Casuarina ont été développées dans des champs de culture (Rajendran et Mohan, 2013).
En Afrique, les Casuarina sont largement utilisés pour la réhabilitation des écosystèmes dégradés (Diagne et al., 2013). Les arbres de la famille des Casuarinacées interviennent dans la protection des sols contre diverses formes d’érosion et la stabilisation des dunes de sable comme c’est le cas le long du littoral Nord Dakar-Saint Louis (Sénégal).
Au vu de ces propriétés, l’espèce Casuarina equisetifolia a été par ailleurs fortement recommandée par les chercheurs dans le cadre du projet de la grande muraille verte qui s’étend de Dakar à Djibouti pour stopper le désert même si elle n’a pas été retenue.
Par ailleurs, au Kakadou Farm (Kenya), le bois de Casuarina est principalement utilisé pour la construction d’hôtels touristiques et des villas (Mbuvi et al., 2011). L’arbre a également été utilisé pour la réhabilitation d’une zone dégradée par l’exploitation d’une carrière de ciment à Mombasa (Siachoono, 2010).
Transport et signalisation de l’hormone auxine
L’auxine est importante pour la formation des arbuscules au cours de la symbiose endomycorhizienne (Etemadi et al., 2014). Elle est également nécessaire pour l’organogenèse nodulaire chez les symbioses légumineuse-rhizobium(Mathesius, 2008 ; Suzaki et al., 2013).
L’accumulation locale de l’auxine conduit à la formation et au développement des primordia nodulaires et la signalisation de l’auxine est active dans le méristème nodulaire (Mathesiuset al., 1998).
Chez C. glauca, CgAUX1, un gène codant un transporteur d’influx d’auxine est exprimé dans les cellules infectées par Frankia au cours de la formation des nodules actinorhiziens (Péret et al., 2007). En revanche, la formation des mycorhizes n’est pas associée à l’expression de CgAUX1 (Péret et al., 2007). Par conséquent, l’infection intracellulaire de C. glauca n’est pas une réponse générale à tout microorganisme (Péret et al., 2008). Des études récentes ont montré que deux auxines, l’acide indole acétique et l’acide phénylacétique, s’accumulent spécifiquement dans les cellules infectées du nodule de C. glauca (PerrineWalker et al., 2010). Ces données soulèvent la question de la fonction de l’auxine dans les cellules végétales infectées par Frankia.
La signalisation de l’auxine est contrôlée par deux voies qui dépendent de la protéine de liaison à l’auxine (ABP1) et des récepteurs d’auxine TIR1/AFB1-5 respectivement (Peer, 2013). Ces récepteurs font partie du complexe enzymatique de la ligase SCF TIR1-AFB (E3) qui dirige l’ubiquitination et la dégradation des protéines AUX/IAA, en présence d’auxine. Les protéines AUX/IAA agissent comme des répresseurs des gènes de type ARF, qui sont des régulateurs transcriptionnels. Ainsi, à faible concentration d’auxine, les protéines AUX/IAA répriment l’activité transcriptionnelle des ARF alors que les fortes concentrations d’aux ine entraine la dégradation des protéines AUX/IAA. Les régulateurs transcriptionnels ARF peuvent contrôler l’expression de leurs gènes cibles. Pour comprendre le rôle de l’auxine dans la voie de signalisation C. glauca-Frankia, un gène nommé CgIAA7 appartenant à la famille AUX/IAA et codant un régulateur négatif de la voie de signalisation auxine a été caractérisé.
Les résulats suggèrent que l’auxine est impliqué dans l’autorégulation de la nodulation (Champion et al., 2015).
Les facteurs de transcription NF-Y
Les protéines NF-Y font partie d’un complexe transcriptionnel également appelé CBF ou HAP présents dans tous les systèmes eucaryotes (Mantovani, 1999). Une quatrième sousunité HAP4 est uniquement présente chez les champignons avec un domaine d’activation transcriptionnelle (Forsburg et Guarente, 1989). Au cours de ces dernières années, la majorité des publications chez les mammifères et chez diverses espèces végétales ont préférentiellement utilisé le nom NF-Y, en particulier chez Arabidopsis, suivant les recommandations d’une nomenclature simplifiée récemment publiée par Siefers et al., (2009).
Les facteurs de transcription ERN
Un facteur de transcription de la famille ERF nommé ERN1 contient un domaine de liaison à l’ADN appelé AP2 hautement conservé et nécessaire à la nodulation de M. truncatula et deux motifs conservés CMV-3 et CMV-4 du groupe V de la famille des ERFs (Fig. 15 ; Andriankaja et al., 2007 ; Middleton et al., 2007). Ce gène a été identifié à l’issu d’un criblage de mutants déficients dans la nodulation, et le mutant bit1 (ern1) est bloqué dans l’initiation et le développement des cordons d’infection et l’invasion du nodule par les bactéries (Middleton et al., 2007). ERN1 est nécessaire à l’expression des gènes induits par les FN et pour la nodulation spontanée activée par CCaMK/DMI3.
Des expériences de délétions de promoteur ont permis d’identifier des éléments cis dirigeant l’expression d’ENOD11 au cours des étapes de pré-infection et d’infection (BoissonDernier et al., 2005 ; Andriankaja et al., 2007). Un élément cis entre -411 et -358 pb (paires de bases) en amont de l’ATG, appelé NF-box et présentant un motif GCC-like, confère l’expression d’ENOD11 en réponse aux FN au cours des étapes de pré-infection (BoissonDernier et al., 2005; Andriankaja et al., 2007). Cette dernière a été utilisée comme appât dans des expériences de simple hybride dans la levure, afin d’identifier des régulateurs transcriptionnels d’ENOD11 au cours de la signalisation NOD, et a mené à l’identification detrois FT de la famille des ERFs (ERN1, ERN2, ERN3) (Andriankaja et al., 2007).
RT-PCR semi-quantitative
Les données d’expression in silico de CgZF1 ont été validées par RT-PCR semiquantitative à l’aide des amorces de CgZF1 RT (Annexe 3). Le gène CgUBI a servi de contrôle et a été amplifié en utilisant les amorces CgUBI sens et antisens (Annexe 3).
L’amplification a été réalisée à partir d’ADNc de racines non infectées par Frankia, de nodules, de racines non mycorhizées et de racines mycorhizées de C. glauca produits par l’équipe Rhizogenèse du centre IRD de Montpellier (Hocher et al., 2011). La PCR a été réalisée dans un thermocycleur GenAmp PCR Sys 2400 (Perkin Elmer) programmé pour une pré-dénaturation de l’ADN de 2 min à 94°C suivie de 32 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à 62°C et 45 s à 72°C.
PCR en temps réel
La PCR quantitative (Q-PCR) se base sur la quantification d’un rapporteur fluorescent, le SYBR green, qui est fixé aux amplifiats néoformés au cours des cycles de PCR. Ainsi la quantité de fluorescence émise est proportionnelle à la quantité d’amplifiats.
La Q-PCR se dissocie en 3 phases, une phase de bruit de fond, lorsque les amplifiats ne dépassent pas la valeur seuil de détection, une phase exponentielle, pendant laquelle la quantité d’amplifiats double à chaque cycle, et enfin une phase plateau, lorsque les réactifs deviennent limitant et que peu d’amplifiats sont générés. La quantification des transcrits que permet la Q-PCR se base sur la valeur Ct (Threshold Cycle), défini comme cycle seuil, apparaissant dans la phase exponentielle. Plus la valeur Ct est faible et plus il y avait de matrice et donc de transcrits au départ.
Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée avec trois réplicats biologiques pour chaque échantillon traité (racines non infectées par Frankia, nodules, racines non mycorhizées par Rhizophagus irregulariset de racines mycorhizées Rhizophagus irregularis). Les amorces ont été choisies en utilisant le logiciel Beacon concepteur (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) selon les critères ci-après: température de fusion: 58 à 60°C, le pourcentage de GC = 30 à 80% et la taille du fragment: 50-150 nucléotides. Des analyses par RT-PCR quantitative ont été réalisées comme décrit par Tromas et al.,(2012). Les amplifications ont été effectuées en utilisant un thermocycleur (Stratagene MX 3005P) programmé pour une prédénaturation de 5 min à 95°C suivie de 40 cycles de 10 s à 95°C, 30 s à 60°C et 15 s à 72°C.
Le gène d’ubiquitine de C. glauca (CgUbi) a été utilisé comme un contrôle positif tel que rapporté par Hocher et al., (2006).
Analyse de l’expression des facteurs de transcription
Les facteurs de transcription potentiellement régulés chez C. glauca (numéro d’accession GPL10929) et chez A. glutinosa (numéro d’accession GSE24153) ont été récupérés à partir des données de puces à ADN (Hocher et al., 2011 ; Tromas et al., 2012). Un facteur de transcription a été considéré comme régulé si son seuil d’expression est supérieur ou égal à 2 /inférieur ou égal -2 et sa valeur p inférieure à 0,01.
Méthodes de clonage moléculaire
Deux méthodes de clonage moléculaire ont été utilisées en parallèle pour générer les différentes fusions transcriptionnelles entre les versions tronquées du promoteur de Cg12et le gène rapporteur GUSpuis la fusion traductionnelle CgZF1 :GFP. Il s’agit de la technique « Golden gate » (Engler et al., 2008) et de la technique « Gateway » (Curtis et Grossniklaus, 2003). La première est basée sur l’utilisation d’enzymes de restriction de type IIs telles que Bsa1, capables de couper en dehors de leur site de reconnaissance.
Par contre, la deuxième repose sur la recombinaison de sites spécifiques entre un vecteur d’entrée et un vecteur d’expression. Les gènes d’intérêt ont été introduits dans plusieurs plasmides (Annexe 4). La clé de ces approches réside dans l’utilisation d’un gène rapporteur. Chez les plantes, on utilise surtout les gènes rapporteurs GUS (β-glucuronidase) et GFP (Green Fluorescent Protein) qui permettent une détection colorimétrique et luminométrique. Le gène GUS code la β-glucuronidase d’E. coli. Ce gène est dépourvu de promoteur et de site d’initiation à la transcription ATG dans la translation du vecteur de fusion. Le substrat de GUS est le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Glucuronic acid (X-Gluc).
Le clivage de ce dernier sous l’action du GUS produit un précipité bleu et insoluble qui confère une coloration bleue. On l’utilise en tant que gène rapporteur en biologie moléculaire.
Le gène GUS est couplé au promoteur du gène que l’on veut étudier (gène d’intérêt). La coloration bleue indiquera l’expression du gène d’intérêt. Le gène GUS peut également être utilisé pour étudier les séquences promotrices des gènes pour savoir s’ils sont inductibles.
C’est pourquoi, il a été fusionné avec les versions tronquées du promoteur de Cg12.
La protéine GFP (Green Fluorescent Protein) a été observée pour la première fois dans la méduse Aequorea victoria en 1962. Contrairement au gène LacZ, la visualisation de la GFP ne nécessite ni fixation du tissu, ni substrat chromogène. Le gène lacZ est un des trois gènes présents dans l’opéron lactose, que possèdent de nombreuses Eubactériescomme Escherichia coli. Il code la β-galactosidase, une enzyme capable d’hydrolyser les β-galactosides (comme le galactose) en monosaccharides (glucose par exemple). Le gène LacZ est un gène rapporteur très utilisé, parce que l’on connaît très bien le fonctionnement de l’opéron lactose (décrit très tôt par Jacques Monod) et parce que la présence de β-galactosidase est facilement détectable en présence de X-gal. Le gène lacZ métabolise le X-galet le produit du métabolisme donne un précipité bleu. Par contre, la GFP absorbe la lumière bleue et émet une fluorescence verte. Ce gène rapporteur est donc particulièrement adapté pour suivre l’expression d’un transgène dans des cellules vivantes. Sa fusion avec la séquence codante de CgZF1a permis de localiser l’expression de ce facteur de transcription dans les cellules de protoplastes d’A. thaliana.
Criblage des agrobactéries transformées
Le criblage a été réalisé comme pour E. colipar PCR sur colonie, en remplaçant le milieu LB (Annexe 1) par le milieu AG (Annexe 2).
Les protoplastes
Génération de protoplastes d’Arabidopsis thaliana
Les graines d’A.thaliana Col-0 ont été semées dans des pots contenant 25% de terre et 75% de terreau azoté. Les plants ont été suivis en chambre de culture à 23-25°C avec une photopériode de 16 h de jour et 8 h de nuit et irrigation régulière. Des protoplastes ont été générés à partir de feuilles de rosettes d’A. thaliana âgées de 2 à 3 semaines. Quarante (40) feuilles ont été coupées en bandes de 2 mm de longueur. Ces dernières ont été incubées dans une boîte de Pétri contenant 25 mL d’une solution enzymatique (Annexe 6). Les boîtes de Pétri ont été transférées dans une cloche sous vide pendant 15 min. Cette étape a permis de faire le vide entre les espaces cellulaires créés par laméllisation pour favoriser la pénétration des enzymes dans ces espaces. Ce qui facilite la digestion des parois pectocellulosiques. Les boîtes de Pétri ont ensuite été incubées à 28°C sous l’obscurité pendant 3 h. Après une légère agitation, le contenu des boîtes de Pétri a été filtré sur un support dont la taille des mailles est de 63 μm. Les protoplastes ont alors été transférés dans un tube Falcone ® de 50 ml puis centrifugés à 600 rpm pendant 5 min. Après élimination du surnageant, trois lavages ont été effectués avec la solution W5 (Annexe 7) froide. Les protoplastes ont été repris dans 5 ml de W5 (Annexe 7) ensuite dénombrés sur cellule de Malassez (Poly Labo) d’une profondeur de 0,100 mm et une surface de 0,0025 mm 2 . Ils ont été lavés avec 25 ml de W5 (Annexe 7) puis repris dans du W5 (Annexe 7) pour obtenir une concentration de 1.10 6 protoplastes/ml. Après 30 min d’incubation sur glace, les protoplastes ont été centrifugés pendant 5 min à 600 rpm.
Le culot a été repris dans une solution de MMg (Annexe 8) afin d’obtenir la concentration précédente. Les protoplastes ainsi obtenus ont ensuite été transformés.
Transformation des protoplastes d’Arabidopsis thaliana
La transformation des protoplastes générés à partir de rosettes d’A. thaliana a été réalisée pour déterminer la localisation intracellulaire de CgZF1. Pour cela, 20 μg d’ADN plasmidique de CgZF1 :GFP/pMDC43 ont été placés dans des tubes Eppendorf ® de 2 ml.
Puis 100 μl soit 1.10 5 protoplastes ont été ajoutés dans le tube, et mélangé avec beaucoup de précaution.
Ensuite 110 μl de PEG (Annexe 9) ont été rajoutés goutte à goutte au mélange, puis incubation à température ambiante pendant 10 min.
Quatre cent quarante (440 μl) de W5 (Annexe 7) à température ambiante ont été également ajoutés au mélange, puis une centrifugation à 200xg, pendant 2 min a été réalisée. Six cent trente (630) μl de surnageant ont été enlevés puis remplacés par 100 μl de solution W5 (Annexe 7) à température ambiante.
Dans des cupules, nous avons placé 900 μl de solution W5 (Annexe 7) à température ambiante puis rajouté les protoplastes ayant été transformés (100 μl). Les protoplastes ont été incubés à l’obscurité à 25°C pendant une nuit. Le lendemain, les protoplastes transformés ont été observés au microscope à épifluorescence (Nikon JAPAN, Leitz LABORLUX S, LABOPHOT).
Transformation génétique stable de C. glauca
Germination des graines
Les graines de C. glaucaont été scarifiées pendant 2 min dans de l’acide sulfurique à 95 % puis rincées à l’eau pendant 30 min. Elles ont été placées dans une solution de triton X en les remuant doucement pendant 5 min, ensuite rincées rapidement à l’alcool 75°C puis à l’eau ultra pure. La stérilisation des graines scarifiées a été réalisée à l’aide de l’hypochlorite de calcium 5% (5 g/100 ml H 2O stérile) pendant 30 min, puis lavées trois fois dans de l’eau distillée stérile pendant 5 min. Elles ont été séchées pendant toute une nuit. Le lendemain, les graines ont été mises à germer dans des boîtes de Pétri stérile contenant du milieu MS (Murashige et Skoog, 1962 ; Annexe 10). Les boîtes ont été placées en chambre de culture de 27°Cavec une photopériode de 16 h jour et 8 h nuit et 60% d’hygrométrie. Après un mois de culture, les plantes ont été transférées en boîte Magenta contenant le même milieu MS(Annexe 10).
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Fixation biologique de l’azote
2. Les symbioses Légumineuse-Rhizobium
2.1 Les Généralités
2.2 Bases moléculaires de la transduction du signal Facteur NOD
3. Les symbioses actinorhiziennes
3.1 Les plantes actinorhiziennes
3.1.1 Généralités
3.1.2 Répartition écologique des plantes actinorhiziennes
3.1.3 Importance des plantes actinorhiziennes : L’exemple de la famille des Casuarinaceae
3.2 Le partenaire bactérien
3.3 La mise en place des symbioses actinorhiziennes
3.3.1 La pré-infection
3.3.2 L’infection symbiotique
3.3.2.1 Infection intracellulaire
3.3.2.2 Infection intercellulaire
3.3.3 Développement et structure du nodule
3.3.3.1 Développement du nodule
3.3.3.2 Structure du nodule
3.3.4 Contrôle génétique de la symbiose chez les plantes actinorhiziennes : état des connaissances
3.3.4.1 Systèmes de transformations génétiques développés chez les plantesactinorhiziennes
3.3.4.2 Analyse de l’expression des gènes induits au cours de la symbiose
actinorhizienne
4. Les subtilases végétales
5. Les Facteurs de transcription symbiotique : état des connaissances
5.1 La régulation de la mycorhization arbusculaire
5.2 Les symbioses nodulaires fixatrices d’azote
5.2.1 Les facteurs de transcription NSP1 et NSP2
5.2.2 Le facteur de transcription NIN
5.2.3 Les facteurs de transcription NF-Y
5.2.4 Les facteurs de transcription ERN
MATERIEL ET METHODES
1. Matériel
1.1 Matériel végétal
1.2 Souches bactériennes
2. Méthodes
2.1 Biologie moléculaire
2.2 Transformation génétique
2.3 Inoculation des plantes transgéniques
2.4 Histologie
2.5 Test de fixation d’azote
2.6 Analyse bioinformatique
RESULTATS ET DISCUSSION
CHAPITRE I. FONCTION BIOLOGIQUE DE Cg12 AU COURS DE L’INFECTION ACTINORHIZIENNE
1. Introduction
2. Résultats
2.1 Analyse de la cinétique de nodulation des plantes transformées avec les constructions Cg12-ARNi
2.2 Analyse de l’anatomie des nodules des plants transgéniques Cg12-ARNi
2.3 Etude de la capacité des nodules transgéniques de Cg12-ARNi à fixer l’azote atmosphérique
2.4 Analyse de l’expression de Cg12 dans les plantes Cg12-ARNi
3. Discussion
4. Conclusion
CHAPITRE II. IDENTIFICATION DES REGULATEURS TRANSCRIPTIONNELS DES SYMBIOSES ACTINORHIZIENNES CHEZ Casuarina glauca et Alnus glutinosa
1. Introduction
2. Résultats
2.1 Identification des facteurs de transcription putatifs chez Casuarina glauca et Alnus glutinosa
2.2 Etude de l’expression des facteurs de transcription de Casuarina glauca et Alnus glutinosa dans les racines et les nodules
2.3 Analyse comparative de l’expression des facteurs de transcription régulés dans les nodules et mycorhizes de C.glauca
2.4 Relations phylogénétiques entre les facteurs de transcription : les familles GRAS, NFYA et ERF
2.4.1 Les protéines de type GRAS
2.4.2 Les protéines de type NF-YA
2.4.3 Les protéines de type ERF
3. Discussion
3.1 Familles des facteurs de transcription
3.2 Rôle des facteurs de transcription
4. Conclusion
CHAPITRE III. CARACTERISATION DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION CgZF1 AU COURS DE LA SYMBIOSE ACTINORHIZIENNE
1. Introduction
2. Résultats
2.1 Analyse de la structure primaire protéique de CgZF1 et AgZF1
2.2 Relation phylogénétique entre CgZF1 et les protéines de type C2H2 C1-2i
2.3 Etude de la localisation intracellulaire de CgZF1
2.4 Etude de l’expression de CgZF1 chez C. glauca
2.4.1 Validation des données d’expression de CgZF1
2.4.2 Analyse comparative des cinétiques d’expression de CgNIN, Cg12 et CgZF1 au cours de la symbiose actinorhizienne
2.5 Rôle de CgZF1 au cours de la symbiose actinorhizienne
2.5.1 Genèse des lignées transgéniques stables de C.glauca
2.5.2 Cinétique de nodulation des lignées transgéniques de CgZF1
3. Discussion
4. Conclusion
DISCUSSION GENERALE
CONCLUSION GENERALE – PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
