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Architecture testiculaire
Les testicules des mammifères sont constitués de deux compartiments : le compartiment interstitiel et le compartiment des tubules séminifères (Fawcett, Neaves and Flores, 1973; Leeson and Cookson, 1974). Le compartiment interstitiel entoure les tubules séminifères (Figure 1). Il est composé de cellules endothéliales et stromales. Les cellules de Leydig y sont prédominantes, elles y sécrètent des hormones dont la testostérone, le principal androgène (Neaves, 1975; Mori and Christensen, 1980). On retrouve également des macrophages parmi les cellules du compartiment interstitiel, notamment à la surface des tubules séminifères (Hume et al., 1984; DeFalco et al., 2015). Ce compartiment interstitiel ne contribue pas seulement à la fonction endocrine du testicule, mais serait aussi essentiel à la régulation des CSGs à l’intérieur des tubules séminifères. Enfin, dans le compartiment des tubules séminifères, on retrouve une structure simple et uniforme sur toute leur longueur, ils sont séparés en une dizaine de boucles dont les extrémités s’ouvrent sur le rete testis. Les tubules séminifères mesurent environ deux mètres de long pour un seul testicule de souris (Russell et al., 1990; Nakata et al., 2015). Les spermatogonies sont situées à la membrane basale de l’épithélium séminifère. Une organisation stratifiée des cellules germinales en cours de différenciation est observable de la membrane basale à la lumière du tubule, ainsi que les cellules somatiques qui les entourent dans l’espace interstitiel. Le tubule séminifère est enveloppé par des cellules myoïdes péritubulaires (PTM). Il contient des cellules somatiques, les cellules de Sertoli, qui sécrètent notamment le GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor), un facteur de croissance nécessaire pour la prolifération et la différenciation des CSGs (Parekh, Garcia and Hofmann, 2019). Le réseau proéminent de jonctions serrées entre les cellules de Sertoli crée une barrière qui sépare les tubules en compartiments basaux et adluminaux. Enfin, on retrouve dans ce compartiment, les cellules germinales, responsables de la spermatogenèse. Ainsi, tous les stades des spermatogonies sont situés dans le compartiment basal, tandis que les spermatocytes, les spermatides et les spermatozoïdes sont situés dans le compartiment adluminal d’une manière orchestrée, illustrant une polarité claire de la périphérie vers le centre (Figure 1). La spermatogenèse est un processus complexe hautement régulé qui se produit de manière cyclique au sein de l’épithélium séminifère organisé. La transition des spermatogonies indifférenciées vers les spermatogonies différenciées se déroule périodiquement, avec un intervalle régulier de 8,6 jours chez la souris, défini comme le « cycle épithélial séminifère », tandis que leurs descendants sont générés et déplacés à un rythme constant vers la lumière des tubules séminifères (Leblond and Clermont, 1952; Russell et al., 1990). Comme la différenciation complète prend plus d’un mois, des combinaisons des quatre stades différents de différenciation (spermatogonies, spermatocytes, spermatides et spermatozoïdes) sont toujours observées dans une section transversale d’un tube séminifère. L’ordre chronologique des différentes phases du cycle définit 12 (I à XII) stades, les stades II et III décrits à l’origine étant ensuite combinés en un seul stade II-III, ce qui laisse 11 stades. La progression de la spermatogenèse et la configuration répétitive des stades épithéliaux le long du tubule séminifère est appelé onde ou vague spermatogénétique (Figure 2A et B). Ces cycles et ondulations assurent la production continue de spermatozoïdes dans une proportion constante du testicule. L’ensemble du processus de différenciation, des spermatogonies indifférenciées à la libération de spermatozoïdes matures dure 35 jours chez la souris. Chez l’Homme, le cycle épithélial est composé de 6 stades (I-VI) le long de l’épithélium séminifère et prend 16 jours pour être achevé (Figure 2C). Il faut 64 jours à une spermatogonie indifférenciée pour donner un spermatozoïde mature (Johnson, Chaturvedi and Williams, 1992).
Émergence de la lignée germinale
La spécification des précurseurs de la lignée germinale, les cellules germinales primordiales (PGCs), au cours du développement embryonnaire précoce, est essentielle à la continuité de l’espèce car ces cellules donneront finalement naissance à des gamètes matures, des spermatozoïdes et des ovules, chargés de transmettre l’information génétique aux descendants. Les PGCs se forment au cours de l’embryogenèse, généralement selon l’un des deux modes suivants : la préformation et l’épigenèse. La préformation fait référence à l’héritage de déterminant maternel. Elle est basée sur la synthèse, le transport, puis la distribution inégale et l’accumulation d’ARN et de protéines spécifiques dans une certaine zone du cytoplasme de l’ovocyte, appelée plasme germinatif qui permet la spécification de la lignée germinale lors de l’embryogenèse. Le mode de préformation se retrouve chez de nombreuses espèces, dont Drosophila melanogaster, Danio rerio, Caenorhabditis elegans et Xenopus laevis. Dans le mode d’épigénèse, aucun plasme germinal déposé par la mère n’est observé, et la lignée germinale est spécifiée à partir d’une population plutôt homogène de cellules embryonnaires grâce à des signaux inducteurs provenant de sources embryonnaires et extra-embryonnaires (Extavour and Akam, 2003; Whittle and Extavour, 2017). Chez la souris, l’Homme et de nombreux autres mammifères, la lignée germinale est déterminée par le mode d’épigénèse. Chez la souris, les PGCs sont spécifiées avant la gastrulation au cours du développement embryonnaire précoce vers le jour embryonnaire (E) 6 à 7, où elles représentent un groupe d’environ 40 cellules. Les PGCs migrent à E10,5 vers les crêtes génitales qu’elles colonisent jusqu’à E13,5 (Saitou and Yamaji, 2012) (Figure 3). Lors de cette phase de prolifération, les PGCs subissent un reprogrammation épigénétique, plus particulièrement, une déméthylation de l’ADN à l’échelle du génome qui inclut l’effacement de l’empreinte génomique (Saitou, Kagiwada and Kurimoto, 2012). Dès E13,5 les PGCs rentrent en arrêt mitotique et restent quiescents dans la phase G0/G1 du cycle cellulaire pour le reste de la période embryonnaire (Western et al., 2008). Chez la souris, on retrouve trois facteurs de transcription essentiels à l’adoption de l’identité des cellules germinales : BLIMP1 (B-Lymphocyte-Induced Maturation Protein 1), PRDM14 (PR Domain Zinc Finger Protein 14), TFAP2C (Transcription Factor AP-2 Gamma) (Ohinata et al., 2005; Weber et al., 2010; Nakaki and Saitou, 2014). Les PGCs expriment Blimp1 à E6,5, permettant ainsi la répression du programme somatique et l’activation du programme germinal. L’expression de PRDM14 et de BLIMP1, ainsi que l’induction et le maintien de TFAP2C par ces deux facteurs, sont nécessaires pour assurer la spécification et l’engagement des PGCs. Lorsque Sry (sex-dertemining region of y) est induit, les PGCs gonadiques sont incorporés dans les cordons testiculaires à partir de E12, les cellules germinales présentes dans les cordons testiculaires sont alors appelées gonocytes ou prospermatogonies. Le terme préspermatogenèse est parfois utilisé pour désigner la phase du développement testiculaire impliquant les gonocytes (Hilscher et al., 1974; McCarrey, 2013). Ces cellules ne reprennent l’avancée de leur cycle, qu’après la naissance.
Autorenouvellement et différenciation : division symétrique et asymétrique
Le mode de division des cellules souches est important pour leur maintien et leur expansion. Il existe deux types de division chez les cellules souches : la division asymétrique et la division symétrique. La capacité de se diviser de façon asymétrique pour donner une cellule souche identique et une cellule fille spécialisée, est considérée comme l’un des attributs du caractère souche (souchitude), et permet le contrôle homéostatique du réservoir de cellules souches. Ce modèle présente donc l’avantage de maintenir la population des cellules souches à un niveau constant, mais pas de se développer en nombre, le rendant incapable de reconstituer son réservoir en cas de perte d’intégrité du tissu. Cette problématique est résolue par le modèle de division symétrique. On retrouve notamment ce modèle de division dans les neuroblastes de la drosophile (Jan and Jan, 2001). Ce modèle permet également l’autorenouvellement des cellules souches et d’engendrer des progéniteurs. En effet, il existe deux types de division symétrique : une division de prolifération qui donne deux nouvelles cellules souches et une division de différenciation qui donne deux cellules progénitrices (Figure 5). Ces deux types de division sont soumis au contrôle de nombreux signaux émanant du tissu environnant, ce microenvironnement est appelé la niche. Pour la division asymétrique :
– Les mécanismes intrinsèques : ils interviennent dans la répartition du contenu cellulaire, lors de la division. Ces mécanismes comprennent la régulation de l’ensemble des facteurs de polarité cellulaire et la ségrégation régulée des déterminants du destin cellulaire (Tran et al., 2012).
– Les mécanismes extrinsèques : ils sont liés au positionnement de la cellule au sein de la niche. En effet le microenvironnement est propice soit à l’autorenouvellement pour la cellule fille restée dans la niche, soit à la différenciation pour la cellule fille sortie de la niche (Yamashita, Jones and Fuller, 2003). Les cellules souches se divisent de manière symétrique ou asymétrique, permettant leur autorenouvellement et leur différenciation (Adapté de Yoshida 2019).
Pour la division symétrique, le microenvironnement des cellules est responsable de la formation soit de deux cellules souches (lorsqu’elles sont dans la niche) soit de deux cellules progénitrices (lorsqu’elles sortent de la niche). On retrouve la division symétrique majoritairement durant le développement, mais aussi lors de la régénération tissulaire après un dommage. Dans de rares cas, on peut retrouver cette forme de division chez l’adulte en condition d’homéostasie, comme chez les mammifères dans le colon (Yatabe, Tavaré and Shibata, 2001). De manière générale, la division asymétrique prévaut permettant l’homéostasie tissulaire. Enfin chez certains mammifères, on retrouve une alternance entre la division symétrique et asymétrique notamment dans le tissu neural et l’épiderme.
L’unipotence des CSGs ?
Les CSGs sont capables de proliférer en culture, en présence de GDNF, un facteur de croissance produit par les cellules de Sertoli, qui leurs permettent de s’autorenouveler (Meng et al., 2000). Bien qu’unipotentes in vivo, les CSGs possèdent une plasticité leur permettant, dans certaines conditions in vitro, de dériver en cellules souches germinales multipotentes, comme en 2004 lorsque l’équipe de Kanatsu-Shinohara a développé des cellules ES-like à partir de cultures primaires de CSGs de testicules de souris néonatales (Kanatsu-Shinohara et al., 2004; Guan et al., 2006; Seandel et al., 2007). Les CSGs provenant de testicules de souris néonatales ont été cultivées sur un tapis de MEFs (Mouse Embryonic Fibroblasts) inactivées, en présence de GDNF, FGF2, LIF et EGF (epidermal growth factor). Ces cellules multipotentes partagent différentes caractéristiques avec les cellules ES (embryonic stem cells) comme l’autorenouvellement, la tumorogénécité (capacité à former des tératomes) mais aussi des anomalies génomiques et épigénétiques. Elles aussi sont embryonnaires (ectoderme/mésoderme/endoderme). Cette transformation de CSGs unipotentes en cellules ES-like pluripotentes se fait in vitro spontanément, sans reprogrammation artificielle avec des vecteurs lentiviraux ou plasmides, comme pour les cellules souches pluripotentes induites (iPS). De plus, l’âge des animaux, les conditions de culture et les facteurs de croissance impliqués, la densité cellulaire des CSGs pendant la culture, le délai après le début de la culture et la durée de la culture sont des éléments clés dans le processus de transition (Azizi et al., 2016). En 2007, Seandel et ses collègues génèrent des cellules multipotentes à partir de cultures de CSGs GPR125+ (marqueurs des spermatogonies adultes), provenant de souris âgées de 3 semaines à 8 mois. Ces cellules sont cultivées sur un tapis de cellules stromales CD34+ inactivées provenant du testicule de souris, en présence des facteurs de croissance GDNF, FGF2, LIF et EGF (Seandel et al., 2007). Pour générer des cellules multipotentes à partir de CSGs, Ko et al., établissent l’importance de la densité cellulaire des CSGs dans les cultures in vitro. En effet dans un milieu de culture particulier contenant des facteurs de croissance (FGF2, EGF, GDNF) ainsi que des hormones (œstradiol et progestérone), à faible densité (< 8000 cellules), après 4 semaines, certaines CSGs adultes deviennent multipotentes (Ko et al., 2009). Bien qu’il n’y ait pas encore de compréhension complète du mécanisme de reprogrammation et de l’établissement des ESlike à partir de CSGs, certaines pistes ont été suggérées comme l’implication de DMRT1 (Doublesex and mab-3 related transcription factor 1) et P53 (tumor protein 53) dont l’inhibition empêche la conversion des CSGs en ES-like (Takashima et al., 2013; Tanaka et al., 2015). De plus, il a été démontré que les CSGs murines étaient réfractaires à la reprogrammation induite par les facteurs de Yamanaka OCT4 (octamer-binding transcription factor 4), SOX2 (sex determining region Y), C-MYC (MYC Proto-Oncogene, BHLH Transcription Factor) et KLF4 (KLF Transcription Factor 4) (Corbineau et al., 2016). Si le potentiel de multipotence est admis chez les CSGs murines, il reste encore très débattu chez l’Homme. En effet, en 2008, chez l’Homme, Conrad et al., dans un article maintenant rétracté, ont affirmé que des cellules pluripotentes, appelées cellules souches germinales adultes humaines (haGSC : human adult germinal stem cells), pouvaient être dérivées de testicules humains (Conrad et al., 2008). Par la suite, deux autres publications ont également affirmé que l’obtention de cellules pluripotentes ressemblant à des cellules ES à partir de culture de cellules testiculaires humaines était possible (Golestaneh et al., 2009; Kossack et al., 2009). Cependant, ces affirmations ont été remises en question par Ko et al., qui affirme que ces cellules n’étaient pas pluripotentes, en cause : leur incapacité à générer des tératomes (Ko et al., 2011). De plus, une autre étude affirme que ces cellules pluripotentes dériveraient de cellules somatiques mésenchymateuses et non de cellules germinales (Chikhovskaya et al., 2014).
Les marqueurs cytoplasmiques et nucléaires
Les marqueurs cytoplasmiques et nucléaires ont été identifiés soit par la technique de lineage tracing soit par marquage immunohistochimique en whole-mount. Ces méthodes ont permis la mise en évidence de marqueurs comme VASA (ou DDX4) qui marquent toute la population germinale chez la souris et l’humain (Castrillon et al., 2000; Tanaka et al., 2000). D’autres facteurs de transcription ont été mis en évidence comme PLZF qui est exprimé chez la souris dans les spermatogonies Aal à As (Buaas et al., 2004). Il est aussi retrouvé dans les spermatogonies chez l’humain (Sadri-Ardekani et al., 2009). Le facteur ID4 est très important car il différencie chez la souris les spermatogonies les plus indifférenciées. En effet, il est présent sous forme de gradient dans les spermatogonies As, et n’est plus retrouvé dans les spermatogonies Apr et Aal, dans un modèle de souris transgénique Id4-EGFP. Au sein des spermatogonies As, celles qui expriment ID4bright sont considérées comme étant les cellules souches (Sun et al., 2015; Helsel et al., 2017), même si l’expression unique d’ID4 dans les spermatogonies As reste controversée (La, Chan, et al., 2018; La, Mäkelä, et al., 2018; Kitadate et al., 2019). Un autre marqueur important des spermatogonies est NGN3, qui permet de différencier les spermatogonies souches des progéniteurs (Nakagawa et al., 2010). ID4 a aussi été retrouvée exprimée chez l’humain (Sachs et al., 2014). SOHL1 et 2 (Spermatogenesis And Oogenesis Specific Basic Helix-Loop-Helix 1 et 2) sont exprimés dans les spermatogonies indifférenciées GFRα1 négatives, et sont importants pour leur différenciation chez la souris (Ballow et al., 2006; Toyoda et al., 2009; Suzuki et al., 2012). Les facteurs de transcription OCT4, SOX3 et LIN28 sont exprimés dans les spermatogonies indifférenciées, mais ils définissent un état engagé vers la différenciation comme les spermatogonies NGN3 positives (Chakraborty et al., 2014; La, Chan, et al., 2018; Liao et al., 2019; Nakagawa et al., 2021). Chez l’Homme, deux types de spermatogonies ont été identifiés : Adark et Apale, distinctes par la morphologie du noyau et l’intensité de la coloration à l’hématoxyline. Les spermatogonies Adark et Apale sont retrouvées à la membrane basale des tubules séminifères. Les spermatogonies Adark sont relativement petites, sphériques ou légèrement ovoïdes. Leur noyau contient une chromatine sombre et dense. Les spermatogonies Apale relativement plus grandes et ovales, voir presque rondes. Elles possèdent un noyau pâle et allongé, dont la chromatine est granuleuse (Clermont and Leblond, 1959; Clermont, 1966b). Les spermatogonies Apale maturent en spermatogonies de type B qui se divisent ensuite en spermatocytes pour produire les spermatides. Les spermatogonies B qui sont identifiables par leur plus grande taille, elles possèdent un noyau clair et arrondi. Chez l’Homme, on retrouve MAGEA4 (Melanoma-Associated Antigen 4) qui marque toutes les spermatogonies, et l’enzyme UCHL1 (ubiquitin C-terminal hydrolase L1) qui marque les spermatogonies Adark et Apale (Di Persio et al., 2017). Enfin, le facteur transcription UTF1 (Undifferentiated Embryonic Cell Transcription Factor 1) est exprimé par les spermatogonies Adark et Apale humaines et les spermatogonies murines (von Kopylow et al., 2010; Zhou et al., 2015). PIWIL4, un membre de la famille des Argonautes (Piwi Like RNA-Mediated Gene Silencing 4) (ou HIHI2 ou MIWI2) est un petit ARN qui réprime l’expression génique, il est exprimé dans les spermatogonies murines NGN3 positives (Yoshida, 2018), il est nécessaire à la restauration de la spermatogenèse en cas de dommage sur le lignage germinal murin (Carrieri et al., 2017). Il est décrit comme un des marqueurs des spermatogonies les plus primitives dans les études de scRNAseq humaines, il a notamment été retrouvé dans les spermatogonies quiescentes UTF1+ GFRα1low (Guo et al., 2020; Shami et al., 2020). Dans ces études, les spermatogonies les plus primitives sont définies comme GFRα1low UTF1high FGFR3high TSPAN33high SSEA4low.
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Table des matières
Introduction
Chapitre 1 : De la cellule souche au spermatozoïde
I) La spermatogenèse
A) Architecture testiculaire
B) La lignée germinale
1) Émergence de la lignée germinale
2) Transition gonocyte-spermatogonie, puberté et différenciation
II) Les cellules souches germinales
A) Propriétés générales des cellules souches
1) Autorenouvellement et différenciation : division symétrique et asymétrique
2) La niche des cellules souches
B) Fonctions et caractéristiques des cellules souches germinales
1) L’unipotence des CSGs ?
2) Méthodologies d’analyse et d’identification des CSGs
C) Les marqueurs des CSGs murines et humaines
1) Les marqueurs membranaires
2) Les marqueurs cytoplasmiques et nucléaires
D) Autorenouvellement et différenciation des CSGs chez la souris
1) Mise en place du pool de CSGs chez la souris prépubère
2) Les trois différents modèles de régulation des CSGs adultes
E) Modèle d’autorenouvellement et de différenciation de spermatogonies humaines
Chapitre 2 : DOT1L, la méthyltransférase de l’histone 3 lysine 79, et son rôle en tant que modulateur épigénétique
I) Histones et code épigénétique des histones
A) Structure des histones
B) Le « code épigénétique » des histones
1) L’acétylation des histones
2) La méthylation des histones
II) Épigénétique et cellule souche : régulation de l’homéostasie et différenciation
A) Paysage épigénétique
B) Régulation des marques épigénétiques des histones dans les cellules souches
1) Les complexes polycomb et trithorax
2) Modifications des histones et notion de gènes bivalents dans les cellules souches
C) Les différents types de modifications d’histones observés dans les cellules souches germinales
III) DOT1L et apposition de la marque H3K79 : cross talk avec les autres histones
A) La méthylation de l’histone H3 sur la lysine 79 et DOT1L
B) Rôle de DOT1L dans le développement
C) Rôle de DOT1L dans les leucémies
IV) DOT1L et la réponse aux dommages à l’ADN
A) La réponse aux dommages à l’ADN
B) Dynamique chromatinienne dans la réponse aux dommages à l’ADN, rôle de DOT1L
Objectifs
Résultats
I) Caractérisation des cellules souches germinales humaines : étude par cytométrie spectrale d’un nouveau panel de 14 marqueurs cellulaires
II) Etude du rôle de la méthyltransférase DOT1L dans l’autorenouvellement et la différenciation des cellules souches germinales
Discussion
1) Préciser l’identité des cellules souches germinales humaines ?
2) DOT1L : un nouvel acteur épigénétique de la maintenance et de la différenciation des CSGs
Conclusion
Références
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