Caractérisation de l’huile de graines de corossol

Analyses en Spectrométrie de Masse (SM)

Les fragments ont été obtenus par électronébullisation ou « ElectroSpray Ionization» (ESI) à 200 °C, 0,6 bar sur un appareil Micro TOF-Q Bruker Daltonics en mode d‟ionisation positive avec un débit d‟azote de 4 L/min. Les spectres ont été enregistrés au Centre Commun de Spectrométrie de Masse de l‟ICBMS à l‟Université Claude Bernard Lyon1.

Tests biologiques

Tests larvicides

Les larves de moustiques Culex quinquefasciatus ont été collectées le long des canaux d‟évacuation bordant les cités à Ampefiloha dans le centre ville d‟Antananarivo. Elles ont été gardées dans leur eau de gîte jusqu‟au moment des tests à l‟insectarium du Laboratoire International Associé. Les tests larvicides ont été menés suivant un protocole standard de l‟OMS (WHO, 1981). Pour chaque extrait, à une concentration bien définie, 4 réplicas et deux témoins ont été utilisés. Les extraits à tester ont été dissous dans l‟éthanol 95°, trente minutes avant le début du test.
– Vingt cinq larves de stade 3 ou 4 ont été sélectionnées à l‟aide d‟une pipette Pasteur puis transférées dans un bocal de 150 mL contenant 25 mL d‟eau de source. Dans un bocal de 350 mL contenant 225 mL d‟eau, 1 mL de solution de l‟extrait à tester ou 1 mL d‟éthanol (pour les témoins) a été versé à l‟aide d‟une micropipette. Après agitation du mélange à la baguette de verre, les 25 mL d‟eau contenant les 25 larves ont été rajoutés.
– Les bocaux ont été recouverts de tissu mousseline afin de les protéger de la poussière.
– Les nombres de larves vivantes et mortes ont été évalués après 24 heures.

Tests de toxicité sur Artemia salina ou test de « Brine shrimp »

Les cystes d‟Artemia salina, originaires des lacs salés de Sibérie, ont été fournis par la société Aqualma basée à Majunga. Les tests se sont déroulés en trois étapes.

éclosion des cystes d’Artemia salina

Trois litres d‟eau de mer artificielle ont été préparés à partir d‟eau de source et de sel de mer (sans ajout d‟iode ni de fluor). La concentration a été de 38 g de sel de mer/L d‟eau de mer (Nondo et al., 2011). Le pH de ce mélange a été ajusté à 8 par une solution normale de soude ou d‟acide chlorhydrique. L‟eau saline a été transvasée dans une cuvette (23 cm de côté), laquelle a été divisée en deux compartiments inégaux par un isolant multi perforé (Meyer et al., 1982). Les nauplii ont été répandus dans le grand compartiment maintenu à l‟obscurité à l‟aide d‟une plaque en carton. Le tuyau d‟une pompe à air y a été plongé pour permettre aux cystes de flotter en permanence. Le petit compartiment a été exposé à la lumière au moyen d‟une lampe (60 Watts, 660 lumen). L‟eau a été maintenue à 28 °C au moyen d‟une plaque chauffante.

lancement des tests de toxicité

Les tests ont été menés en se basant sur la méthode de Nondo et al. (2011) avec quelques modifications. Différentes concentrations ont été préparées à partir d‟une solution mère de l‟extrait dans le DMSO. Pour chaque concentration, 4 réplicas et un témoin ont été utilisés.
– Dix nauplii âgés de 24 heures ont été sélectionnés à l‟aide d‟une pipette Pasteur et à la loupe puis, transvasés dans un flacon de 15 mL à large goulot contenant 2 à 3 mL d‟eau de mer artificielle. 100 μL d‟extrait y ont été ajoutés. Le mélange a ensuite été ramené à 5 mL.
– 100 μL de DMSO ont été versés à la place des solutions d‟extrait afin de servir de témoin. Au bout de 24 heures de test, à la lumière, les nauplii morts ont été dénombrés.

Tests de toxicité du résidu d’extraction

Les tests de toxicité du résidu d‟extraction, obtenu après traitement par Soxhlet des amandes des graines, ont été effectués sur des souris de race SWISS à l‟Institut Malgache des Recherches Appliquées (IMRA), Avarobohitra Itaosy. Le résidu d‟extraction étant insoluble, son administration a été faite par voie orale. Il a été incorporé dans la nourriture. Trois lots de cinq souris ont été nourris avec, respectivement, 10 g, 5 g et 2,5 g de résidu d‟extraction mélangé à de la provende. Le mélange a été laissé pendant deux jours dans le bac jusqu‟à ce que les souris aient tout consommé. Les souris ont été privées de nourriture lors du 3ème jour. Le comportement des souris a été suivi pendant les cinq jours qui ont suivi l‟ingestion du résidu. Le but était d‟observer les effets nocifs que ce résidu pourrait occasionner.

Analyses statistiques des données

Le pourcentage de mort a été corrigé suivant la formule d‟Abbot (WHO, 1981). Les données statistiques des tests biologiques ont été traitées par XLSTAT 2014. Les doses létales DL50 (médiane) et DL90 ont été évaluées à partir de la courbe de régression logprobit. L‟intervalle de confiance a été estimé à 95%. Le test de χ2 a été utilisé dans le traitement des données afin d‟obtenir la valeur de p.

Teneur en eau des graines

L’utilisation des graines, encore humides, nécessite un séchage au préalable pour éviter toute destruction des molécules par prolongation des réactions enzymatiques. Toutefois, avant l‟opération, la détermination de la teneur en eau des graines a été effectuée. Au bout de 29 jours, les graines ont perdu 29,9% de leur masse. Ce qui équivaut à la masse d‟eau dans ces organes. Les graines sèches représentent en moyenne 2,9% du fruit frais.

Proportion en téguments et en amandes des graines

Chaque graine contient une amande (un albumen ruminé) emprisonnée dans le tégument. Asenjo et Goyco (1943) ainsi qu‟Awan et al. (1980) ont désigné ce tégument par « husk ». Ce qui, par abus de langage, peut être traduit par coque. L‟évaluation de la proportion de ces différents organes était nécessaire afin de connaître leur contribution dans le rendement de toute extraction. En moyenne, les amandes représentaient 62,2% des graines sèches et les téguements 37,4%. L‟ordre de grandeur de ces valeurs est voisin de celui rapporté par la littérature : 67% (amandes) contre 33% (téguments) selon Asenjo et Goyco (1943) et 68,55% (amandes) contre 31,45% (téguments) d‟après Awan et al. (1980). La proportion des téguments étudiés dans ce travail reste plus élevée comparée à celle de la littérature. Les figures 9 et 10 montrent respectivement les aspects des téguments et des amandes.

Teneur en eau et en matières volatiles des amandes des graines

La détermination de la teneur en eau des amandes des graines a été nécessaire afin de prendre les mesures adéquates lors des extractions. Les téguments secs étaient assez résistants au toucher mais pouvaient se casser sous la pression des doigts. Ce qui n‟était pas le cas des amandes qui demeuraient souples puisqu‟elles étaient originellement protégées par les téguments imperméables. En effet, les graines de corossol sont catégorisées parmi les « hard seeds » à cause de leurs téguments assez durs (Côme, 1982, cité par Ba et al., 2012). Après neuf heures à l‟étuve, la masse de la poudre d‟amande a été constante. La teneur en eau et en matières volatiles des amandes des graines de corossol est de 8,9%. Cette teneur étant inférieure à 10%, le séchage de la poudre d‟amandes avant les extractions n‟était pas nécessaire (AFNOR, 1993).

Caractérisation des composés des graines entières de corossol

Les travaux sur les graines entières ont été axés sur les extractions des produits au moyen de divers traitements. Des comparaisons au niveau des profils chromatographiques ainsi que des tests biologiques ont été effectués afin d‟identifier la meilleure méthode. Un fractionnement bioguidé a été entrepris afin d‟isoler les produits larvicides. Des modifications chimiques au niveau d‟une des molécules isolées ont été apportées à des fins d‟optimiser les activités de cette dernière.

Teneurs et profil des extraits dans les graines entières

La macération ou la méthode au Soxhlet suivie de fractionnement des extraits obtenus, a été mise à profit. Plusieurs objectifs ont été visés :
– connaître les compositions des divers extraits, en isoler et identifier les composés majoritaires ;
– détecter les extraits ou fractions biologiquement actifs (larvicides, toxiques) ; Choisir la méthode à retenir et qui serait avantageuse pour les industriels s‟avérait important.

Huile des graines entières

Les graines entières de corossol ont été traitées afin d‟extraire les lipides. Au bout de 10 heures d‟extraction à l‟hexane au moyen du Soxhlet, une huile représentant 25,1% des graines entières a été obtenue. Ce rendement est proche de celui rapporté par la littérature : 23,86% en opérant avec l‟acétone (Asenjo et Goyco, 1943). Cependant, il est faible comparé à 40% (extrait à l‟éther de pétrole) obtenu par Kimbonguila et al. (2010). L‟origine, le climat, la variété, le cultivar, la phase de maturation, la période de récolte ou le solvant utilisé sont sûrement les facteurs ayant influencé le rendement. De plus, l‟éther de pétrole est constitué d‟un mélange de composés.

Conclusion générale et perspectives

Les résultats obtenus au cours de ce travail ont montré que les acétogénines courantes dans les graines d‟Annona muricata : annonacine, annonacinone et murisoline n‟ont subi aucune altération. Le même constat est à formuler concernant l‟huile des graines et ce malgré leur conditionnement. Ainsi, leur utilisation peut être recommandée. La méthode proposée pour la valorisation des graines comprend six étapes :
– la séparation mécanique des téguments des amandes,
– le broyage des amandes,
– le traitement des amandes par Soxhlet au moyen de l‟éthanol 95°,
– l‟évaporation de la phase éthanolique,
– le fractionnement par séparation liquide/liquide afin de recueillir l‟huile,
– et enfin la séparation des produits toxiques des oligosaccharides.

La séparation des téguments des amandes est impérative pour ne pas gêner l‟extraction et permettre l‟utilisation ultérieure du résidu d‟extraction. Les téguments, contenant peu de lipides et des traces d‟acétogénines, avec un taux de fibres brutes important et indigestes pour les non ruminants, constituent des alternatives pour le bois de chauffage. La réduction en poudre des amandes est nécessaire pour augmenter les surfaces de contact avec le solvant. L‟utilisation du Soxlhet résout la saturation du solvant occasionnée lors des macérations et minimise les manipulations. L‟éthanol constitue le solvant par excellence puisque sa polarité permet d‟extraire le maximum de produits. De plus il est moins toxique que le méthanol et disponible en grande quantité à Madagascar. La séparation liquide/liquide utilisant le système hexane/méthanol/eau, contrairement au mélange hexane/eau, réduit la formation d‟émulsion stable, le temps d‟extraction et les risques d‟altération des molécules.

L‟huile débarrassée de la majorité des produits toxiques n‟est pas destinée à la consommation mais trouvera son application dans plusieurs secteurs de la lipochimie : en savonnerie, dans l‟industrie des surfactants, des solvants, des lubrifiants pour machines de forage, l‟industrie du biodiesel… L‟acétate d‟éthyle, l‟alternative du dichlorométhane, permet la séparation des produits toxiques des oligosaccharides. L‟activité larvicide de l‟annonacine est limitée par l‟hydrophobicité. Son hydrogénation catalytique a amélioré sa solubilité et donc son activité larvicide. Cependant la transformation n‟a pas diminué sa toxicité. Utilisé comme biolarvicide, l‟extrait AcOEt composé majoritairement d‟annonacine, d‟annonacinone et de murisoline ne nécessite ni de purification ni de réduction de la liaison éthylénique.

Le mélange est plus efficace par rapport à l‟extrait dichlorométhanique et aux acétogénines pures. Son utilisation atténue le risque de développement d‟une forme de résistance des insectes. Cependant sa toxicité doit être réduite. Les acétogénines peuvent également servir de structures de base dans la recherche thérapeutique. Les oligosaccharides dans l‟extrait aqueux peuvent être utiles à l‟industrie sucrière. Le résidu d‟extraction des amandes, non toxique, peut servir dans l‟alimentation animale.

Les étapes de la valorisation des graines de corossol que nous proposons sont résumées dans la figure 66.

Table des matières

Introduction générale
1 Synthèse bibliographique
1.1 La classification botanique de la plante et description du fruit
1.2 Les métabolites primaires des graines de corossol
1.3 Les métabolites secondaires des graines de corossol
1.4 Les acétogénines
1.5 L‟hydrogénation catalytique d‟une acétogénine
1.6 Les tests biologiques
1.7 Les solvants d‟extraction des composés des Annonacées
1.8 Les lipides
2 Matériels et méthodes
2.1 Matériels végétaux
2.2 Solvants
2.3 Extraction des produits dans les graines
2.4 Fractionnement des extraits éthanoliques
2.5 Isolement des produits
2.6 Mesure du point de fusion de l‟acétogénine
2.7 Hydrogénation catalytique d‟acétogénine
2.8 Caractérisation de l‟huile de graines de corossol
2.9 Détermination de la teneur en protéines brutes du résidu d‟extraction
2.10 Analyses chromatographiques et détermination structurale
2.11 Tests biologiques
2.12 Analyses statistiques des données
3 Résultats et discussions
3.1 Caractérisation du matériel végétal
3.2 Caractérisation des composés des graines entières de corossol
3.3 Caractérisation des composés des téguments de graines de corossol
3.4 Caractérisation des composés des amandes de graines de corossol
Conclusion générale et perspectives

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