Caracterisation de la b-glycosidase de la blatte periplaneta americana

Les plantes possèdent des métabolites dits « secondaires » par opposition aux métabolites primaires que sont les protéines, les glucides et les lipides. Ces composés diffèrent en fonction des espèces et, bien que leurs rôles soient encore mal connus, il est cependant clair qu’ils interviennent dans les relations qu’entretient la plante avec les organismes vivants qui l’entourent. Ils sont probablement des éléments essentiels de la coévolution des plantes avec les organismes vivants, tels que parasites, pathogènes et prédateurs, mais aussi pollinisateurs et disséminateurs. Ces différentes relations ont donné lieu à une extrême diversification des composés secondaires. On peut classer les métabolites secondaires en plusieurs grands groupes: parmi ceux-ci, les composés phénoliques, les terpènes et stéroïdes et les composés azotés dont les alcaloïdes. Chacune de ces classes renferme une très grande diversité de composés qui possèdent une très large gamme d’activités en biologie humaine. Si leur rôle écologique reste encore à préciser, leur utilisation par l’homme dans de nombreuses préparations thérapeutiques est très largement répandue. En effet, ces substances toxiques possèdent, parfois à faible dose, des propriétés médicamenteuses et peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques (Vronen 2003). Les molécules naturelles responsables de ces activités servent aujourd’hui de modèle à la créativité des chimistes et biochimistes qui tentent d’en améliorer les activités ou d’en diminuer les effets secondaires et la toxicité. Parmi ces molécules, se trouvent les glycoalcaloïdes (GA) qui sont des molécules naturelles appartenant à la classe des alcaloïdes métabolisés exclusivement par les plantes. Bien que certaines de ces molécules puissent être isolées des plantes de la famille des Liliaceae, on les trouve essentiellement dans la famille des Solanaceae comprenant des espèces alimentaires telles que la pomme de terre, l’aubergine ou la tomate. Les GA de la pomme de terre sont majoritairement représentés (90 à 95%) par deux composés : l’α-solanine et l’α-chaconine (Friedman and McDonald 1997).

Synthèse bibliographique

Généralité sur les blattes 

Origine

Les blattes sont encore appelées cafards, cancrelats ou coquerelles. Elles sont apparues sur terre il y a environ 400 millions d’années, et leur aspect a peu évolué depuis 320 millions d’années. Les fossiles indiquent qu’elles proliféraient au Carbonifère, ère de leur apparition (Lo et al. 2000). Toutes ces espèces sont plus ou moins cosmopolites et ont colonisé de nombreux pays, à la faveur des transports et des échanges commerciaux internationaux. Les transports maritimes sont à l’origine de l’infestation des grandes zones portuaires, et des villes avoisinantes, par les blattes (Arruda et al. 2001). Plusieurs milliers d’espèces de blattes sont connues de par le monde, mais la plupart d’entre-elles habitent les zones équatoriales et tropicales car ces insectes affectionnent tout particulièrement la chaleur et l’humidité (Grandcolas 1998).

Morphologie

Les 4000 espèces de blattes réparties autour de la planète varient selon la forme, la couleur et la taille (Roth 2003). Les blattes sont des insectes au corps aplati et ovale. La tête, très mobile est presque entièrement cachée sous une partie du thorax en forme de bouclier, appelée pronotum. Elle porte deux antennes filiformes, très mobiles et flexibles, souvent aussi longues que le corps. Les blattes ont deux grands yeux composés et parfois deux ocelles. Leurs pièces buccales sont de type broyeur. Elles comprennent une paire de robustes mandibules fortement dentées. Au thorax sont rattachées trois paires de pattes semblables, robustes, épineuses et bien adaptées à la course (Grandcolas 1996). Les blattes ont généralement deux paires d’ailes, fixées au thorax et posées à plat sur l’abdomen, se chevauchant largement. Les ailes antérieures sont légèrement épaissies et recouvrent les ailes postérieures. Elles sont souvent plus courtes chez la femelle que chez le mâle. Les ailes sont réduites ou absentes chez quelques espèces. L’abdomen porte deux courts appendices plus ou moins développés, appelés cerques. Chez la femelle, il se termine par un ovipositeur, mais celui-ci est peu ou pas visible (Hui et al. 2009) .

Cycle de vie

Les blattes sont des insectes à métamorphose incomplète. Les jeunes ressemblent aux adultes, mais ils sont dépourvus d’ailes à leur naissance (Grandcolas 1999). Chez plusieurs espèces de blattes, une parade nuptiale précède l’accouplement. Le contact entre les deux partenaires s’effectue à l’aide des antennes. Le mâle tapote parfois le corps de la femelle avec ses antennes. Il se retourne ensuite, soulève ses ailes, les fait vibrer et allonge son abdomen. Cet étirement expose les ouvertures de deux glandes dorsales qui sécrètent une substance spéciale. La femelle lèche cette sécrétion. Puis le mâle recule sous la femelle et pousse son pénis dans son ouverture génitale. Sans quitter sa partenaire, le mâle effectue alors une rotation de 180° (Grandcolas 1999). Les deux insectes restent ainsi attachés par l’extrémité de leur abdomen pendant environ une heure, la semence du mâle passant dans le corps de la femelle. Au cours des jours suivants, la génération future se prépare dans le corps de la femelle (Grandcolas 1991; Gautier 1982; Bell, Gorton, and Tourtellot 1979). Quelques dizaines d’œufs sont regroupés sur deux rangées à l’intérieur d’une capsule protectrice. Cette coque aux parois rigides porte le nom d’oothèque. D’abord blanchâtre, l’oothèque tourne ensuite au brun. La majorité des larves éclosent moins de 24 heures après le dépôt de l’oothèque. Selon les espèces, les larves subissent entre quatre et quinze mues avant de devenir adulte, avec parfois une mue supplémentaire pour la femelle. Après chaque mue, le corps de l’insecte est mou et blanchâtre. Au fur et à mesure que les heures passent, le squelette externe durcit et prend la couleur caractéristique de l’espèce. Selon les espèces, il faut de 2 à 24 mois aux blattes pour atteindre la maturité. Chez l’adulte, la largeur du corps est au maximum de 10 mm et sa longueur varie entre 35 et 50 mm (Grandcolas 1999).

Habitat

La blatte a une distribution cosmopolite, la grande majorité des espèces de blattes vit dans la nature, sous les débris, les pierres, les feuilles, les écorces ou les troncs d’arbres couchés au sol ainsi que dans les fissures des rochers. Les espèces domestiques habitent les maisons, les entrepôts, les commerces et tout autre endroit où elles trouvent suffisamment d’humidité et de nourriture (caves, égouts, sous-sols, chaufferie). Sous les tropiques, les milieux de vie des blattes sont beaucoup plus variés (cavernes, nids de fourmis ou de rongeurs, tronc et feuillage des arbres, etc.) (Grandcolas 1998).

Alimentation et rôle écologique

Les blattes sont des insectes omnivores. Elles peuvent manger de la matière végétale en décomposition, du papier ainsi que des animaux morts ou des restes de table. En général, les blattes semblent préférer les hydrates de carbones (Hui et al. 2009). Elles sont particulièrement attirées par la viande, les produits laitiers, les aliments sucrés et amylacés (amidon), mais elles s’alimentent aussi de légumes, fruits, cuir, tissus, cartons, plastiques, insectes morts ou vivants, terreau, aliments pour animaux, cheveux, tissus et papier surtout celui enduit de pâte ou de colle. Les blattes sont particulièrement abondantes et diversifiées dans les régions tropicales et subtropicales (Arruda et al. 2001). Elles jouent un rôle important de décomposeurs dans la nature. En effet, en se nourrissant de végétaux et d’animaux morts, elles participent ainsi au recyclage rapide de la matière organique (Wileyto and Boush 1984).

Généralités sur la blatte Periplaneta americana 

Les blattes constituent l’ordre des Blattopteres (Blattaria) d’après les classifications phylogénétiques récentes (Bell, Gorton, and Tourtellot 1979). Elles appartenaient auparavant à l’ordre des Dictyoptères. La blatte américaine a pour nom commun Cancrelat américain et pour nom scientifique Periplaneta americana (Linnaeus). Elle a été découverte aux Etats-Unis d’Amérique dès 1625 (Roth 2003). Sa classification se présente comme suit:
– Règne: Animal
– Embranchement: Arthropodes
– Sous embranchement: Antennates
– Classe: Insectes
– Sous-classe: Ptérigotes
– Groupe: Néoptères
– Ordre: Blattaria
– Famille: Blattidae
– Genre: Periplaneta
– Espèce: americana .

La blatte Periplaneta americana adulte à une coloration brune rouge luisant avec une tâche jaune pâle sur le pronotum et possède une paire de cerques à l’extrémité de l’abdomen. Chez l’adulte, la largeur du corps est au maximum de 10 mm et sa longueur varie entre 35 et 50 mm. Avec les étapes de vie plus jeune incluses (larve et jeune blatte) la durée de vie de la blatte varie entre 1 à 2 ans selon les conditions environnementales (Grandcolas 1996). Cette blatte représente le plus grand des cancrelats qui infestent les maisons. Elle possède des ailes entièrement développées et des inscriptions de lumière sur le thorax (Wall and Oschman., 1975). Les deux sexes (mâle et femelle) sont presque identiques dans la taille et l’aspect. La femelle a un abdomen plus large que le mâle. Cependant, seul le mâle a un cerci et les stylets . Les ailes du mâle se prolongent de 4 à 8 mm au-dessus de l’extrémité de l’abdomen alors que chez la femelle, elles sont égales (Grandcolas 1996). Comme tous les cancrelats, les œufs de Periplaneta americana sont pondus dans une caisse d’œufs appelée oothèque. Chaque oothèque contient environ 12 à 16 œufs (Fox 2006). La caisse d’œufs est habituellement cachée dans une crevasse où les œufs se développeront pendant 1 à 2 mois. Une femelle simple peut produire environ 12 à 24 caisses d’œufs durant des mois d’été chauds. Les larves subissent 13 mues pendant 6 à 12 mois avant qu’elles n’atteignent la maturité (Ramos et al. 2006).

Les glycoside hydrolases 

Généralités

Les glycosides hydrolases encore appelées glycosidases catalysent aussi bien l’hydrolyse des polysaccharides, des saccharides que les liaisons osidiques des glycoconjugués. Cette hydrolyse permet la libération de molécules non saccharidiques, de monosaccharides ou d’oligosaccharides de plus faible poids moléculaire. Elles sont scindées en deux groupes selon leur spécificité d’action: les α-glycosidases et les β-glycosidases selon qu’elles hydrolysent les liaisons osidiques α ou β. C’est sans doute la propriété la plus caractéristique des glycosidases car si ces enzymes sont peu spécifiques de la partie aglycone du substrat, elles sont toutefois très spécifiques de l’anomérie de la liaison osidique. Selon leur mode d’intervention, elles sont soit des endo ou des exo-glycosidases à l’intérieur de ces deux grands groupes. Les premières interviennent au niveau des liaisons osidiques au hasard à l’intérieur des chaînes polysaccharidiques, tandis que les secondes attaquent les chaînes polysaccharidiques à partir de leurs extrémités non réductrices. Les glycosidases catalysent les réactions d’hydrolyse et de transglycosylation (Crout and Vic 1998).

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I-GENERALITE SUR LES BLATTES
1-1-Origine
1-2- Morphologie
1-3-Cycle de vie
1-4-Habitat
1-5-Alimentation et rôle écologique
1-6-Généralités sur la blatte Periplaneta americana
II- LES GLYCOSIDE HYDROLASES
2-1-Généralités
2-2-REACTIONS CATALYSEES PAR LES GLYCOSIDE HYDROLASES
2-1-1-Réactions d’hydrolyse
2-1-2-Réactions de synthèses enzymatiques de glycoconjugués
2-1-2-1-Réactions de synthèse
2-1-2-2-Réactions de transglycosylation
2-3-Mécanismes d’action
2-3-1-Mécanisme avec inversion de configuration
2-3-2-Mécanisme avec rétention de configuration
2-4-Classification des glycoside-hydrolases
2-4-1-Classification traditionnelle
2-4-2-Classification selon les similarités de séquences
2-4-2-1-Structures des β-glucosidases de la famille GH1
2-4-2-2-Classification des β-glucosidases selon la spécificité de substrat
2-4-2-3-Déterminants structuraux de la spécificité de substrats des β-glucosidases de la famille GH1
2-4-2-4-Fonction et utilisations des β-glucosidases
2-4-2-5-Rôle des β-glucosidases dans la modification des métabolites secondaires des plantes
III-LES GLYCOALCALOÏDES DE LA POMME DE TERRE
3-1-La pomme de terre Solanum tuberosum (L.)
3-2-Métabolites secondaires chez les végétaux
3-2-1-Les alcaloïdes
3-2-2-Les glycoalcaloïdes (GA) de la pomme de terre
3-2-2-1-Facteurs influençant les concentrations en GA de la pomme de terre
a-Le cultivar
b-Les conditions de culture et de récolte
c-La maturité
d-Les conditions de stockage
3-2-2-2-Toxicité des GA de la pomme de terre
3-2-2-3-Etude sur l’homme
3-2-2-4-Structure des GA
3-2-2-5-La biosynthèse des GA de la pomme de terre
IV-RESUME DES TRAVAUX ANTERIEURS
4-1-Résumé des travaux antérieurs effectués sur l’extraction et l’hydrolyse des GA de la pomme de terre
4-2-Résumé des travaux antérieurs effectués sur la β-glycosidase de la blatte Periplaneta americana
CHAPITRE II-MATERIEL ET METHODES
I-MATERIEL
1-1-Matériel biologique
1-1-1-Matériel animal
1-1-2-Matériel végétal
1-2-Plasmides, vecteurs et souches
1-2-1-Souches bactériennes
1-2-2-Souche de levure
1-3-Tampons et milieux de culture
1-3-1-Solutions et tampons
1-3-2-Milieux de culture
1-3-2-1-Milieux de culture pour E.coli
1-3-2-2-Milieux de culture pour Yarrowia lipolytica
II-METHODE
2-1-Techniques de biologie moléculaire
2-1-1-Construction d’une banque d’ADNc
2-1-1-1-Extraction des ARN totaux
2-1-1-2-Purification des ARNm
2-1-1-3-Contrôle de qualité des acides nucléiques
2-1-1-4-Synthèse des ADNc simple brin
2-1-1-5-Amplification des ADNc par LD-PCR
2-1-1-6-Digestion par la protéinase K et purification de l’ADN
2-1-1-7-Digestion par Sfi I
2-1-1-8-Fractionnement des ADNc sur colonne Chroma 400
2-1-1-9-Ligation dans le vecteur TriplEx2
2-1-1-10-Encapsidation des vecteurs recombinants
2-1-1-11-Préparation des cellules XL1-Blue compétentes pour l’étalement de la banque
2-1-1-12-Titrage de la banque
2-1-1-13-Détermination du pourcentage de clones recombinant (screening bleu/blanc)
2-1-1-14-Amplification de la banque
2-1-1-15-Contrôle de la taille moyenne des inserts par PCR
2-1-1-16-Criblage de la banque d’ADNc
2-1-1-16-1-Criblage primaire
2-1-1-17-2-Criblage secondaire
2-1-1-18-Conversion des phages en plasmides par le système cre-lox
2-1-2-Sous clonage du gène codant pour la β-glycosidase et production de la protéine recombinante
2-1-2-1-Essai de production chez E.coli
2-1-2-1-1-Amplification du fragment d’ADNc par PCR
2-1-2-1-2-Purification des produits de PCR
2-1-2-1-3-Double digestion du vecteur et de l’insert par les enzymes de restriction
2-1-2-1-4-Extraction d’ADN à partir du gel d’agarose
2-1-2-1-5-Déphosphorylation du vecteur
2-1-2-1-6-Ligation
2-1-2-1-7-Préparation des cellules compétentes d’E. coli TOP10/ E.coli Dh5α
2-1-2-1-8-Transformation des produits de la ligation
2-1-2-1-9-Extraction d’ADN plasmidique
2-1-2-1-10-Essai de production de la β-glycosidase chez E.coli
2-1-2-2-Essai de production chez la levure Yarrowia lipolytica
2-1-2-2-1-Amplification du fragment d’ADNc par PCR
2-1-2-2-2-Préparation des cellules compétentes de Yarrowia lipolytica JMY1212
2-1-2-2-3-Transformation des produits de la ligation
2-1-2-2-4-Essai de Production
2-1-2-5-Production en cellules d’insectes
a)-Séquence issus de la banque d’ADNc BetaGluc
b) Gène synthétique réalisé à partir de la séquence stockée dans NCBI BetaGluc
2-2-Techniques de Biochimie
2-2-1-Purification et caractérisation de la β-glycosidase native de la blatte Periplaneta americana
2-2-1-1-Préparation de l’extrait brut enzymatique
2-2-1-2-Dosage des activités pNP-glycosidasiques
2-2-1-3-Dosage des activités oligo et polysaccharidasique
a-Préparation du réactif glucose oxydase-péroxydase
b-Technique de dosage
2-2-1-4-Dosage des protéines
2-2-1-5-Technique de purification de la protéine native
2-2-1-5-1-Purification par chromatographie d’échange d’anions sur colonne Q sepharose Fast Flow
2-2-1-5-2-Chromatographie d’exclusion moléculaire sur le gel Sephacryl S-100 HR
2-2-1-5-3-Chromatographie d’interaction hydrophobe sur gel Phényl-Sepharose CL-4B
2-2-1-5-4-Electrophorèse en SDS-page
2-2-1-6-Etude des caractéristiques physico-chimiques des protéines
2-2-1-6-1-Détermination du poids moléculaire de la protéine native parfiltration sur gel de Sephacryl S- 200 HR
2-2-1-6-2-Influence du pH sur l’activité β-glucosidasique
2-2-1-6-2-1-pH optimum d’hydrolyse
2-2-1-6-2-2-Stabilité au pH
2-2-1-6-3-Influence de la température sur l’activité β-glucosidasique
2-2-1-6-3-1-Température optimale d’hydrolyse
2-2-1-6-3-2-Etude de la stabilité thermique ou thermostabilité
2-2-1-6-3-2-1-Inactivation thermique
2-2-1-6-3-2-2-Dénaturation thermique
2-2-1-6-3-3-Influence de quelques agents chimiques
2-2-1-6-3-4-Effet des solvants organiques
2-2-1-6-3-5-Etude de la spécificité de substrat
2-2-1-6-3-6-Détermination de KM et Vmax
2-3-Techniques analytiques
2-3-1-Analyse protéomique de la protéine native
2-3-1-1-Préparation de l’échantillon
2-3-1-2-Les étapes de lavages
2-3-1-3-Réduction-alkylation
2-3-1-4-Digestion trypsique
2-3-1-5-Extraction des peptides
2-3-1-6-Analyse protéomique par spectrométrie de masse Q-TOF
2-3-1-7-Séquençage de novo
2-3-1-8-Séquençage N-terminal par la dégradation d’Edman
2-3-2-Analyse des glycoalcaloïdes (GA) de la pomme de terre Solanum tuberosum
2-3-2-1-Extraction des glycoalcaloïdes (GA)
2-3-2-1-1-Préparation des échantillons
2-3-2-1-2-Préparation des tampons et des solvants
2-3-2-1-3-Extraction des glycoalcaloïdes (GA)
2-3-2-1-4-Purification sur colonne SPE
2-3-2-2-Analyse HPLC
2-3-2-3-Hydrolyse chimio-enzymatique des composés
a)-Hydrolyse partielle
b)-Hydrolyse enzymatique
2-3-2-4-Analyse HPLC-ESI/MS
CHAPITRE III : CARACTERISATION BIOCHIMIQUE DE LA ΒETAGLYCOSIDASE NATIVE DE LA BLATTE PERIPLANETA AMERICANA
1-INTRODUCTION
2-RESULTATS
2-1-Isolement et purification de la β-glycoside hydrolase de la blatte Periplaneta americana
2-2-Caractéristiques physico-chimiques de la β-glycosidase de la blatte Periplaneta americana
2-2-1-Poids moléculaire de la β-glycosidase
2-2-2-pH optimum et stabilité au pH
2-2-3-Influence de la température sur l’activité de la β-glycosidase
2-2-3-1-Température optimale d’hydrolyse
2-2-3-2-Dénaturation thermique
2-2-3-3-Inactivation thermique
2-2-4-Influence des agents chimiques sur l’activité de la β-glycosidase de la blatte Periplaneta americana
2-2-5-Spécificité de substrat
2-3-Séquençage de la β-glycosidase par la spectrométrie de masse LC- MS/MS
2-3-1-Optimisation du protocole de purification pour le séquençage
2-3-2-séquençage de la protéine
CHAPITRE IV: CONSTRUCTION D’UNE BANQUE D’ADNC, CLONAGE DU GENE CODANT POUR LA ΒETA-GLYCOSIDASE DE LA BLATTE PERIPLANETA AMERICANA PRODUCTION ET CARACTERISATION BIOCHIMIQUE DE LAPROTEINE RECOMBINANTE
1-INTRODUCTION
2-RESULTATS
2-1-Construction d’une banque d’ADNc à partir de l’ARNt de la blatte Periplaneta americana
2-1-1-Extraction d’ARN total
2-1-2-Extraction de l’ARNm à partir de l’ARN total
2-1-3-Synthèse du 1er brin ADNc et amplification par LD-PCR
2-1-4-Fractionnement des ADNc
2-1-5-Titrage de la banque non amplifiée
2-1-6-Titrage de la banque amplifiée
2-1-7-Criblage de la banque d’ADNc
2-1-8-Excision des plasmides
2-2-Sous-clonage de l’ADNc codant pour la β-glycosidase de la blatte Periplaneta americana, puis essai de production de la protéine recombinante
2-2-1-Chez E.coli
2-2-1-1-PCR réalisée à partir de la banque d’ADNc
2-2-1-2-Essai de production de la protéine recombinante dans différentes souches d’E.coli
2-2-2-Chez Yarrowia lipolytica
2-2-2-1-PCR réalisée à partir de la banque d’ADNc
2-2-2-2-Vérification de la présence des inserts
2-2-3-Production en cellules d’insectes
2-2-3-1-Production du gène codant pour la β-glycosidase issus de la banque de d’ADNc (BetaGluc1)
2-2-3-1-1-Génération du sctok de virus P1
2-2-3-1-2-Analyse de l’expression de la BetaGluc 1pendant la génération du stock P1
2-2-3-1-3-Amplification et surexpression des virus recombinants
2-2-3-1-4-Test de Purification
2-2-3-2-Production du gène codant pour la β-glycosidase à partir du gène synthétique (BetaGluc 2)
2-2-3-2-1-Clonage du gène dans le vecteur pATXBac1 puis génération du sctok de virus P1
2-2-3-2-2-Amplification et surexpression du virus recombinant
2-2-3-1-3-Test de Purification
2-3-Caractérisation des différentes protéines recombinantes produites
2-3-1-Effet du pH
2-3-1-1-pH optimum
2-3-1-2-Stabilité au pH
2-3-2-Effet de la température
2-3-2-1-Température optimale d’activité
2-3-2-2-Denaturation thermique
2-3-2-3- Inactivation thermique
2-3-3-Effet de quelques effecteurs
2-3-4-Effet des solvants organiques
2-3-5-Etude de la spécificité de substrat
2-3-6-Paramètres cinétiques KM et Vmax des protéines
CONCLUSION GENERALE

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