Calculs théoriques du spectre de masse d’un composé de formule brute CnNpOqHr

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Absorption et distribution

Les cinétiques d’absorption de la ZEN ont montré qu’elle est très rapidement absorbée au niveau intestinal : entre 80 et 85% chez le porc (Biehl et al., 1993).
L’importante excrétion urinaire de la zéaralénone et de ses dérivés montre que l’absorption est importante chez les rats, les lapins et l’homme (Mirocha et al., 1981; Kuiper-Goodman et al., 1987). Ces phénomènes sont précédés d’une métabolisation par la flore digestive et les entérocytes. Chez le rat, la demi-vie de la ZEN au niveau intestinal est de 5 minutes et seulement 0,0095% de la dose initialement administrée sous forme de perfusion dans l’intestin, sont retrouvés dans l’intestin au bout d’une heure (Ramosa et al., 1996).
Chez le porc, l’utilisation d’un modèle simulant le tractus gastro-intestinal a permis de déterminer que l’absorption de la ZEN s’effectue principalement au niveau du jéjunum1 (70% de la dose absorbée) et de l’iléum2 (30% de la dose absorbée) (Avantaggiato et al., 2003).
Du point de vue de la distribution, la ZEN franchit la barrière placentaire chez le porc et les rongeurs (Bernhoft et al., 2001). Néanmoins, la ZEN et ses métabolites se concentrent principalement dans le foie et la bile de manière dose-dépendante ainsi que dans les organes possédant des récepteurs oestrogéniques (utérus, follicules ovariens, tissus adipeux et cellules interstitielles des testicules) (Appelgren et al., 1982; Kuiper-Goodman et al., 1987). Ceci laisse supposer une élimination progressive des tissus, résultant de l’excrétion biliaire importante de la ZEN et de ses métabolites (Biehl et al., 1993).
Enfin, chez l’homme, la demi-vie plasmatique de l’ -zéaralénol tritié (administré par voie orale) est d’environ 22 heures. Le pic de concentration obtenu est beaucoup plus important chez l’homme que chez les autres espèces étudiées (dont le singe) (Kuiper-Goodman et al., 1987).

Élimination

L’excrétion de la zéaralénone et de ses dérivés peut se faire par voie biliaire, urinaire, mais aussi lactée. Les urines et les matières fécales sont les principales voies d’élimination de la ZEN (JECFA, 2000). Un résumé de l’excrétion de la zéaralénone et de ses métabolites dans l’urine et dans les matières fécales de bovins, de porcins et de rats est présenté dans le Tableau I.5 (Gaumy et al., 2001). Les taux d’excrétion mesurés indiquent une variabilité inter-espèce.
Si aucune étude sur le passage de la zéaralénone et de ses dérivés dans les œufs n’a été faite, les études s’accordent sur le faible taux de transfert de la ZEN et de ses métabolites dans le lait (Shreeve et al., 1979; Prelusky et al., 1990). La ZEN peut être détectée dans le lait de truie 42 à 44 heures après consommation de l’aliment contaminé avec 40 ppm de zéaralénone, et jusqu’à 5 jours après son retrait (Palyusik et al., 1980). Les analyses des échantillons de lait ont montré la présence de 82 à 86% de -zéaralénol, 13,4 à 15,7 % d’ -zéaralénol et 0,5 à 1,3 % de zéaralénone. La concentration maximale en zéaralénol trouvée dans le lait de truie est de 0,575 à 0,790 ppm. Chez des vaches laitières, un passage de petites quantités de zéaralénone dans le lait a été mesuré (Hagler et al., 1980). Une administration de 25 ppm de zéaralénone dans la nourriture pendant 7 jours est suivie d’une excrétion de zéaralénone et de ses dérivés ( et -zéaralénol) dans le lait (Mirocha et al., 1981). Les composés excrétés sont présents sous forme libre et sous forme conjuguée (glucurono et sulfoconjugués) dans des ordres de grandeur équivalents (Gaumy et al., 2001).
Le devenir dans l’organisme de la zéaralénone est ainsi dominé par l’importante hétérogénéité inter-espèces existant dans son métabolisme. Bien que l’activité de conjugaison de la zéaralénone l’emporte largement sur l’activité de réduction dans la plupart des espèces animales, cette dernière est la plus importante du point de vue toxicologique, avec l’élaboration de dérivés encore plus toxiques que le composé parental (phénomène de bioactivation, cf paragraphe suivant). Voyons à présent la toxicité de cette mycotoxine et de ses dérivés.

Toxicité

C’est une molécule à activité oestrogénique classée dans la catégorie L (preuve limitée d’un point de vue de la carcinogénicité) chez l’animal par l’IARC. D’après la consommation d’aliments contaminés par des animaux domestiques, un hyper oestrogénisme a été observé chez les animaux de la ferme, notamment chez les truies (Liu et al., 1985) et chez les vaches (Diekman et Green, 1992). Des expériences in vivo et in vitro indiquent que la ZEN et ses métabolites sont des substrats de différentes enzymes impliquées dans le métabolisme des stéroïdes. Par conséquent, vue l’interaction avec les récepteurs oestrogéniques, la ZEN est associée aux composés connus comme des perturbateurs endocriniens. Elle est classée comme œstrogène non stéroïdien ou mycoestrogène ou même parfois comme phytoestrogène. En dépit de sa structure non-stéroïdienne, la ZEN active des récepteurs d’œstrogène impliquant le changement fonctionnel et morphologique des organes reproducteurs (Kuiper-Goodman et al., 1987; JECFA, 2000).
Ainsi, la ZEN ressemble suffisamment au 17 -estradiol pour se lier avec une forte affinité aux récepteurs oestrogéniques dans les cellules cibles de mammifères. Parmi les animaux de ferme, des porcs sont considérés comme l’espèce la plus sensible. Les signes cliniques de l’exposition incluent, chez la femelle, l’atrophie ovarienne, une baisse de fertilité, une augmentation des résorptions fœtales, une diminution de la taille des portées, des changements de poids des glandes hypophysaires ainsi que des modifications des niveaux sériques de progestérone et d’estradiol. Une fibrose de l’utérus, des tuméfactions vulvaires et mammaires ainsi qu’une augmentation des follicules vésiculaires au niveau des ovaires ont également été mentionnées (JECFA, 2000). Chez les mâles, la ZEN entraîne une baisse de la capacité de reproduction, une atrophie testiculaire, une inflammation de la prostate, une féminisation des jeunes mâles ainsi qu’une diminution des taux sériques de la testostérone (Zinedine et al., 2007). Des études auto-radiographiques de la [3H]-ZEN chez les souris, ont démontré que la localisation dépendait du statut reproducteur : chez les souris gravides, la zéaralénone et/ou ses métabolites ont été trouvés seulement dans les foetus en fin grossesse, principalement dans les reins, la bile et le tissu conjonctif (Appelgren et al., 1982).
Il est important de noter que la zéaralénone diffère de ses métabolites par son potentiel oestrogénique. La première preuve de cette différence de potentiel a été obtenue lors d’études par Katzenellenbogen et al. en 1979 (Katzenellenbogen et al., 1979) sur les récepteurs hormonaux. Plus récemment, Shier et son équipe (Shier et al., 2001) ont montré la relation entre structure et activité de la zéaralénone sur des expériences cellulaires, utilisant des cellules humaines mammaires d’adénocarcinome1 MCF7 qui nécessitent la présence d’agonistes aux récepteurs d’œstrogène pour proliférer. En mesurant le taux de prolifération de ces cellules, ils ont montré que l’ -zéaralénol a une activité oestrogénique relative 92 fois supérieure à celle de la zéaralénone alors que l’activité oestrogénique relative du -zéaralénol est seulement de 0,44 par rapport à celle de la ZEN (Tableau I.6). C’est pourquoi la conversion de zéaralénone en -zéaralénol doit être vue comme une réaction de bioactivation, alors la conversion en -zéaralénol reflète plus une inactivation du composé parent.

L’acide mycophénolique

Production et activité thérapeutique

L’acide mycophénolique (AMP), produit de fermentation de plusieurs souches de Penicillium (Bullingham et al., 1998) mais aussi de Byssochlamys nivea (Puel et al., 2005), possède des propriétés immunosuppressives mises à profit en transplantation d’organe. Deux formes médicamenteuses ont été développées pour améliorer la biodisponibilité de ce produit. La première forme mise sur le marché est le mycophénolate mofétil (MMF, Cellcept®) ou morpholinoéthyl-ester de l’AMP (Figure I.4). Après administration orale, cette pro-drogue est rapidement hydrolysée en AMP dans le tube digestif et absorbée dans l’estomac. Récemment, une formulation gastro-résistante (comprimés pelliculés) du mycophénolate sodique (Figure I.4) (Myfortic®) a obtenu une autorisation de mise sur le marché (AMM). Après administration orale, l’enrobage gastro-résistant du principe actif permet la libération et l’absorption du mycophénolate dans l’intestin grêle et non dans l’estomac.

Absorption et distribution

Après administration orale, le MMF est rapidement et massivement absorbé. Il subit une hydrolyse précoce et complète en AMP (substance active) par désestérification dans le tube digestif ; le MMF n’est pas mesurable dans le plasma après une administration orale (Fulton et Markham, 1996; Bullingham et al., 1998). La biodisponibilité totale moyenne de l’AMP, évaluée chez 12 volontaires sains par le ratio des aires sous la courbe (AUC) obtenues après administrations orale et intraveineuse de MMF, a été estimée à 94,1% (±16,2%) (Bullingham et al., 1996). Dans le sang, l’AMP est contenu à 99,9% dans le plasma (Nowak et Shaw, 1995), ce qui fait du plasma le milieu de choix pour le dosage de l’AMP. Chez 12 volontaires sains, son volume apparent de distribution moyen était de 3,6 L/kg (Fulton et Markham, 1996).

L’AMP est fortement lié aux protéines plasmatiques et plus particulièrement à l’albumine. Aux concentrations plasmatiques usuelles d’AMP, le taux de fixation protéique moyen est de 97,5% (Shaw et al., 1995; Bullingham et al., 1996; Fulton et Markham, 1996; Bullingham et al., 1998).

Métabolisme et excrétion

Le métabolisme de l’AMP est essentiellement hépatique et rénal et il implique des mécanismes de phases I et II (Figure I.5 ; cf partie II de ce chapitre). Le métabolisme de phase I, minoritaire, fait intervenir un cytochrome P450 (principalement les isoformes CYP 3A et 2C) pour donner un métabolite M3 (Shipkova et al., 1999) récemment identifié par Picard et al. (Picard et al., 2004) comme étant le 6-O-desméthyl de l’AMP. Ce métabolite serait secondairement glucuro – conjugué. L’AMP est principalement métabolisé par des mécanismes de phase II impliquant deux types d’enzymes :

– les UDP-glucuronosyl – transférases, qui catalysent la formation de l’AMP – – phényl – glucuronide (Bullingham et al. , 1998) (ou AMPG ; métabolite majoritaire inactif, fixé à l’albumine à 82%) et de l’AMP – acyl – glucuronide (ou AMPaG ; métabolite minoritaire actif (Schutz et al., 1999; Shipkova et al. , 2002))

– les UDP-glucosyl-transférases, qui catalysent la formation de l’AMP- -phényl-glucoside (inactif) (Schutz et al., 1999) et d’un autre glucoside de l’AMP, supposé être l’AMP-acyl-glucoside. L’activité de ce dernier n’a fait l’objet d’aucune publication.

Aucune donnée concernant des interactions possibles drogue-drogue entraînant des variations de concentration de l’AMPaG actif, potentiellement toxique, n’est disponible. Une meilleure connaissance des voies métaboliques de l’acide mycophénolique est nécessaire pour étudier mieux de telles interactions. Jusqu’ici, au moins 15 formes d’UDP-glucuronosyl-transférases (UGT) ont été identifiées chez l’homme. D’après des similitudes de séquence, elles ont été divisées en deux familles, UGT 1 et UGT 2. Les isoformes UGT impliquées dans la glucuronidation de l’acide mycophénolique en AMPG ont déjà été étudiées par plusieurs équipes : Morissette et al. ont démontré que la glucuronidation de l’acide mycophénolique en AMPG est plus efficace chez les hommes que chez les femmes, suggérant ainsi que l’acide mycophénolique pourrait entrer en compétition avec des œstrogènes pour l’UGT 1A (Morissette et al., 2001). Plus récemment, une méthode de LC-MS/MS permettant l’identification et la détermination des métabolites de l’acide mycophénolique a été développée par Picard et al.(Picard et al., 2004). Les métabolites ont été caractérisés dans des échantillons d’urine et de plasma provenant de patients greffés rénaux suivant un traitement à base de mycophénolate de mofetil et provenant d’incubations in vitro d’acide mycophénolique avec des microsomes humains de foie (HLM), de rein (HKM) ou des microsomes humains intestinaux (HIM). Les isoformes d’UGT impliquées dans la production de l’AMPG ou de l’AMPaG ont été étudiées :

– en utilisant des microsomes induits de foie de rat exprimant chaque UGT de manière hétérologue (Supersomes®) ;

– par inhibition sélective chimique des activités métaboliques des HLM, HKM et HIM.

Les trois préparations microsomales produisent de l’AMPG, de l’AMPaG et deux glucosides de mycophénolate. Parmi les 10 isoformes UGT examinées, l’UGT 1A9 est la plus efficace pour la synthèse de l’AMPG avec un kM de 0,16 mM, proche de celui déterminé pour HLM (0,18 mM). D’après les expériences d’inhibition chimiques, l’UGT 1A9 est apparemment responsable de 55 %, de 75 % et de 50 % de production d’AMPG respectivement dans le foie, le rein et le mucus intestinal. Bien que l’UGT 2B7 ait été la seule isoforme produisant l’AMPaG en quantité significative, l’azidothymidine, inhibiteur sélectif a seulement modérément réduit cette production (approximativement -25%). En conclusion, les UGT 1A9 et 2B7 ont été clairement identifiées comme les principales isoformes impliquées dans la glucuronidation de l’acide mycophénolique, vraisemblablement en raison de leur expression hépatique et rénale élevée (Picard et al., 2004). En outre, deux autres métabolites, AMP-acyl-glucuronide (AMPaG) et AMP-phényl-glucoside (AMPGls), ont été isolés dans le plasma de patients greffés rénaux et identifiés par spectrométrie de masse en tandem (Schutz et al., 1999; Shipkova et al., 1999). Un rapport récent a démontré que l’AMPaG a un effet inhibiteur sur la prolifération des lymphocytes in vitro (Shipkova et al., 2001). Par ailleurs la toxicité de l’acyle-glucuronide est bien connue (Ritter, 2000; Shipkova et al., 2003) : tous deux peuvent se lier covalamment aux protéines et à d’autres macromolécules, ce qui pourrait être à l’origine du mécanisme de leur immunogénicité et de leur toxicité (Wieland et al., 2000).

Les métabolites glucuro-conjugués et gluco-conjugués sont excrétés par voie biliaire. Dans l’intestin, l’AMPG est partiellement déconjugué par la flore bactérienne et réabsorbé sous forme d’AMP, donnant lieu à un cycle entérohépatique se traduisant par un rebond sur les courbes des concentrations en fonction du temps (Bullingham et al., 1998). Le cycle entérohépatique a été étudié au moyen de la cholestyramine, substance qui exerce son action thérapeutique en se fixant de manière non spécifique aux acides biliaires, ainsi qu’aux médicaments acides ou aux métabolites conjugués. L’administration de cholestyramine chez des volontaires sains recevant oralement une dose unique de MMF provoquait une diminution moyenne de la valeur de l’AUC d’AMP totale de 37% (10 à 61%, n=12), ce qui témoignait de l’importance de la contribution du cycle entérohépatique dans la pharmaco-cinétique (PK) de l’AMP (Bullingham et al., 1998). La valeur de l’AUC est la résultante du métabolisme hépatique de l’AMP et de son cycle entérohépatique. Ces processus peuvent être plus ou moins affectés au cours de certaines pathologies, faisant ainsi varier la biodisponibilité apparente totale du médicament. 93% de la dose de MMF administrée est éliminée par voie urinaire, majoritairement sous forme d’AMPG et minoritairement sous forme d’AMP et d’AMPaG, par filtration glomérulaire et sécrétion tubulaire. 6% de la dose est éliminée dans les fèces.

Métabolisme, détoxication et transport

Le métabolisme d’un xénobiotique (médicament, pesticide polluant, toxique, contaminant alimentaire, mycotoxine, etc.) correspond à la transformation par une réaction enzymatique de ce dernier en un ou plusieurs composés, dits métabolites qui peuvent être actifs ou inactifs pharmacologiquement et parfois toxiques.

Le métabolisme est une des phases de l’élimination d’un composé exogène : les différentes étapes du métabolisme conduisent à la formation de substances hydrosolubles plus facilement éliminées par les milieux aqueux que sont les urines, la bile, la salive ou la sueur. Il est important de noter que ce phénomène peut être mis à profit d’un point de vue pharmacologique. Ainsi le métabolisme d’un médicament n’aboutit pas forcément à son inactivation : les prodrogues (ou promédicaments) pharmacologiquement inactifs sont rapidement métabolisées en métabolites actifs.

De nombreux tissus sont le siège du métabolisme des xénobiotiques : foie, rein, poumon, intestin…Le principal étant le foie : les hépatocytes sont riches en enzymes impliquées dans le métabolisme.

On distingue 2 grandes phases dans le métabolisme :

– les réactions de phase I

– les réactions de phase II

Les réactions dites de phase III sont assimilées à des phénomènes d’efflux du composé parent introduit dans la cellule ou de ses métabolites formés au cours des deux précédentes phases (Figure I.6).

Les standards internes et l’enrichissement isotopique

L’étude et le dosage de composés naturels en faibles doses posent plusieurs problèmes expérimentaux de par la complexité des échantillons, la diversité des matrices, la stabilité des composés etc. Afin de faire face à ces difficultés, plusieurs solutions existent :
– l’utilisation de standards externes (molécule rajoutée au moment de l’analyse, après les étapes d’extraction et/ou de purification) ;
– l’utilisation de standards internes (molécule chimiquement proche de l’analyte et rajoutée dans l’échantillon brut avant tout traitement) ;
– l’utilisation de courbes d’étalonnage avec un standard de l’analyte.
L’utilisation d’un standard interne nécessite qu’il réponde à un certain nombre de propriétés telles qu’un comportement physico-chimique proche de celui de l’analyte, qu’il soit analysable dans les mêmes conditions ou qu’il n’y ait pas d’interférence de signal analytique avec l’analyte ni de réaction avec ce dernier.
L’origine des analyses grâce à des standards internes enrichis en isotopes remonte au début du XXe siècle, quand (Soddy, 1913) a découvert l’existence des isotopes et que George Hevesy a utilisé les isotopes radioactifs pour déterminer la teneur en plomb dans des roches et la solubilité des sels de plomb dans l’eau (Hevesy et Paneth, 1913). La plupart des éléments ont des isotopes stables et des isotopes radioactifs. Par exemple, le carbone naturel se compose de 12C (98%), de 13C (1,08%) et de 14C radioactif. Bien qu’ayant des propriétés très semblables, les composés contenant ces isotopes peuvent être enrichis ou appauvris en raison de leur différence de masses. Si un élément ou un composé ayant une distribution isotopique naturelle est mélangé à un composé de composition isotopique différente (Figure I.12), deux masses distinctes apparaîtront sur un spectre de masse, alors que les modifications des autres propriétés physico-chimiques seront faibles ou difficilement détectables (sauf IR).
Après l’addition du standard marqué et de son équilibration avec l’analyte (composé à analyser ou à doser), le rapport (les proportions relatives) des isotopologues1 est stable en raison de leurs propriétés chimiques et physiques proches. La spectrométrie de masse permet la différentiation entre les isotopologues et, avec la quantité connue du standard interne, la teneur de l’analyte peut être calculée.
En revanche, un standard interne structurellement différent (ce qui est encore largement utilisé) aura des propriétés distinctes et, par conséquent, peut être à l’origine d’erreurs ou d’imprécisions. En effet, un standard présentant des propriétés physico-chimiques voisines de celles de l’analyte pourra par exemple avoir un comportement différent vis-à-vis des solvants d’extraction ou un rendement d’ionisation distinct de celui de l’analyte entraînant ainsi des (faibles) erreurs de quantification. En d’autres termes, des pertes de l’analyte au cours de différentes étapes de purification et/ou d’extraction sont complètement compensées par des pertes identiques de l’isotopologue tandis qu’un standard interne structurellement différent ne sera pas forcément extrait et/ou purifié dans les mêmes proportions et donc, sera moins approprié (Figure I.13).
Ainsi, la compensation idéale des pertes rend l’utilisation d’un isotopologue parfaite pour une série d’applications analytiques et particulièrement pour la quantification de composés à l’état de traces. En effet, les analyses de traces exigent souvent des procédures de purification parfois lourdes à mettre en œuvre dues aux interférences de matrice (chaque matrice devant être vérifiée en suivant un protocole très strict préconisé par différents guidelines1), qui causent habituellement des pertes de l’analyte. Quand des standards internes structurellement différents sont utilisés, des expériences supplémentaires de récupération et des bilans de matière sont nécessaires, ce qui augmente la charge de travail et multiplie les risques d’erreurs. Souvent les taux de récupération ne sont pas reproductibles, ce qui est une cause additionnelle d’imprécision. Dans tous ces cas, l’utilisation de standards internes enrichis aux isotopes stables offre des avantages significatifs : ils sont appropriés à des dosages quantitatifs sans se soucier des pertes éventuelles qui peuvent avoir lieu au cours d’étapes de purification ou d’extraction. Leur utilisation augmente la spécificité de la détermination.

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Table des matières

Introduction
Chapitre I État de l’art
I. Métabolites secondaires de champignons filamenteux
I-1. Les mycotoxines
I-2. L’acide mycophénolique
II. Métabolisme, détoxication et transport
II-1. Phase I
II-2. Phase II : Conjugaison
II-3. Transport
III. Les standards internes et l’enrichissement isotopique
IV. Spectrométrie de masse : une technique analytique très sensible
IV-1. Principe de fonctionnement d’un spectromètre de masse
IV-2. L’ionisation
IV-3. Le système dispersif
IV-4. L’analyseur : la trappe d’ion et l’Orbitrap
IV-5. Le détecteur
V. Exemples d’applications d’utilisations d’isotopes stables, développées pour des projets de recherche (en dehors du sujet exposé dans le présent manuscrit).
V-1. Projet AFSSET 2007-063 Environnement-santé-travail « Exposition aurisque mycologique par inhalation. Effets sur le tractus pulmonaire de toxines produites par Aspergillus fumigatus »
V-2. AFSSET 08-27 : Identification des mycotoxines présentes dans des locaux insalubres.
V-3. P2 ANR PCV ISOMODTS : Conception de composés stables à visée antineurodégénerative basée sur les analogues de l’état de transition défini par mesures isotopiques.
Chapitre II Calculs théoriques d’un spectre de masse de composés contenant des t variables en isotopes stables
I. Rappels sur la spectrométrie de masse
II. Calculs théoriques du spectre de masse d’un composé de formule brute CnNpOqHr
II-1. Détails du calcul des probabilités nécessaires à la construction d’un spectre de masse
II-2. Exemples de la construction du spectre de masse de la zéaralénone (C18H22O5).
II-3. Détermination de l’enrichissement optimal en 13C.
III. Formulation et mise en équations du problème de prévision avec plusieurs isotopes d’un point de vue algorithmique
IV. Études des variations des différents paramètres considérés
IV-1. Variation de chaque paramètre séparément
IV-2. Variation des nombres d’atomes d’une part et des enrichissements d’autre part
IV-3. Conclusions
V. Résolution du problème inverse
V-1. Éléments de construction du programme C++ du problème inverse
V-2. Résultats expérimentaux
VI. Conclusions et perspectives
Chapitre III Métabolisme de la ZEN in vitro. Mise en évidence d’un nouveau méta
I. Précisions expérimentales préliminaires
I-1. Conditions expérimentales d’incubations
I-2. Chromatogrammes et aspects quantitatifs préliminaires
II. Activités des déshydrogénases mesurées à pH 4,5
II-1. Conditions expérimentales de formation des ZOLs
II-2. Inhibiteurs des HSDs
II-3. Conclusions
III. Activités mono-oxygénasiques des P450s mesurées à pH 7,4
III-1. Formation d’un nouveau métabolite OH-ZEN
III-2. Conditions optimales de formation de l’OH-ZEN
III-3. Métabolisme de la ZEN par des formes exprimées de cytochromes P450s
III-4. Conclusions
IV. Activité oestrogénique de l’OH-ZEN
IV-1. Les récepteurs oestrogéniques
IV-2. Conditions expérimentales
IV-3. Activité de l’OH-ZEN
IV-4. Conclusions
V. Identification structurale de l’OH-ZEN
V-1. Formation des analogues
V-2. Orbitrap: spectrométrie de masse très haute résolution
V-3. GC-MSn
V-4. Discussion et conclusion
VI. Discussion et conclusions
Chapitre IV Traçage isotopique du 13C
I. Effet isotopique expérimental
I-1. Production des métabolites secondaires
I-2. Métabolisme par les mammifères
I-3. Transport
I-4. Discussion et conclusion sur les effets isotopiques expérimentaux
II. Réactivité théorique
II-1. Approche thermodynamique
II-2. Réaction en phase gazeuse (gaz parfait)
II-3. Résultats dans l’eau
II-4. Résultats dans l’acétonitrile
II-5. Discussion et conclusions
Chapitre V Exemples d’utilisation de standards internes 13C
I. Dosages de zéaralénone dans différentes matrices
I-1. Dosage de la ZEN dans des extraits de céréales
I-2. Dosage de la ZEN naturelle contenue dans des extraits d’animaux traités (foie, plasma, urine)
II. Dosage d’acide mycophénolique
III. Conclusions
Chapitre VI Méthodes expérimentales
I. Incubations
I-1. Traitements des animaux et préparations des enzymes (Radu Duca)
I-2. Provenance des CYP
I-3. Protocole d’incubations de ZEN avec des microsomes hépatiques ou des formes exprimées de CYPs
II. Purifications-extractions
II-1. Extraction de la ZEN d’échantillons biologiques
II-2. Extraction sur phase solide de la ZEN à partir de matrices végétales
II-3. Purification de la ZEN glucuronide et de solutions brutes de ZEN 13C par HPLC semi-préparative
III. Analyse de la ZEN et de ses métabolites par couplage HPLC-MS
III-1. GC-MS (GC-HRMS), Laberca, Nantes.
III-2. LC-MS
IV. Mesure du transport de la ZEN sur Caco2
IV-1. Transport
IV-2. Cytotoxicité
Chapitre VII Conclusions et Perspectives
Références Bibliographiques