Biosynthèse du tétrahydrofolate chez les plantes

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Arbre phylogénétique des ADC synthase (GAT-ADCS)

Nous avons construit l’arbre phylogénétique des GAT-ADCS en utilisant les séquences protéiques des espèces disponibles dans les différentes bases de données (figure 27). La méthode algorithme d’alignement utilisée est celle de CLUSTALW et le calcul de l’arbre a été fait selon la méthode du maximum de vraisemblance mise au point par Ronald Fisher vers 1922 (Norton et Pearson 1976). Cette méthode de reconstruction phylogénique évalue l’ordre probable des branchements et la longueur des branches d’un arbre pour un modèle évolutif donnée. Une fois l’arbre phylogénique établie, nous avons évalué par ‘bootstrap’ la confiance que l’on peut avoir en cet arbre : cette méthode, sans doute la plus utilisée en phylogénie, part du postulat que les caractères évoluent de manière indépendante. Elle a été proposée pour la première fois par Bradley Efron en 1979 (Efron et Tibshirani 1994). Cette méthode peut être décrite de la façon suivante :
-Un arbre T est obtenu à la suite d’un alignement des séquences d’origine (de longueur n, n étant le nombre de résidus). Cet alignement définit donc n colonnes
-A partir de cet alignement, on combine de façon aléatoire les n colonnes de l’alignement d’origine (tirage avec remise, c’est-à-dire que la même colonne peut apparaître plusieurs fois dans la combinaison aléatoire) et obtention d’un nouvel alignement A’.
-Estimation du sous arbre obtenu T’ à partir de l’alignement A’.
-L’opération est répétée 100 fois
-Comparaison des arbres T et T’ : pour chaque sous arbre T’, on regarde s’il est présent dans T.
On compte ensuite pour chaque sous arbre le nombre de fois où il est présent dans T. Cette fréquence avec laquelle on retrouve un sous-arbre est la valeur de bootstrap (plus elle est élevée, plus la fiabilité de la branche est importante). Il est important de noter que ce qui est réalisé ici (avec le bootstrap) est la vérification de la qualité de l’alignement.
Comme le montre la Figure 27, les GAT-ADCS de plantes (supérieures et inférieures) forment un bloc compact, illustrant ainsi qu’elles ont bien toutes la même origine. Il est intéressant de constater que le groupe des plantes est proche d’un petit groupe de bactéries qui inclut les cyanobactéries et d’une branche contenant deux apicomplexes appartenant aux genres Toxoplasma et Neospora. Par contre il est étonnant que la branche contenant le genre Plasmodium soit éloignée de celle contenant les autres apicomplexes. Cela est peut-être lié au biais qui existe dans le génome de ces organismes, particulièrement riche en A et T (82 % d A et T chez P. falciparum), et qui se traduit au niveau des protéines par des séquences riches en résidus N, K, I L, E, et D (ces six acides aminés représentant 51 % du total des acides aminés des protéines chez P. falciparum (Bastien et al. 2004).

Surproduction des GAT-ADCS recombinantes

Surproduction de la GAT-ADCS de P. falciparum

Sur le site plasmoDB (http://plasmodb.org/plasmo/) le gène de la GAT-ADCS a été identifié et annoté, il s’agit du gène PFI1100w. A l’aide du logiciel en ligne Globplot (http://globplot.embl.de/) qui permet de prédire les domaines globulaires stables et les régions désordonnées d’une protéine, nous avons prédit que la séquence protéique de PfGAT-ADCS n’est pas désordonnée et quelle possède deux grands domaines globulaires correspondant aux domaines GAT et ADCS. Les logiciels dédiés ne prédisent pas non plus de séquence d’adressage vers un compartiment cellulaire spécifique. L’ensemble de ces prédictions nous ont décidés à cloner l’intégralité du gène concerné. A partir d’une banque d’ADNc de P. falciparum nous avons amplifié par PCR, puis cloné dans le plasmide Pet28b+ le gène PFI1100w. La taille attendue du gène PFI1100w est de 2940 pb, et nous avons vérifié par séquençage la qualité du clonage effectué. Compte tenu du biais existant dans le génome de cet organisme, nous avons aussi fait construire un gène de synthèse, optimisé pour l’usage des codons d’E. coli.
La surexpression de la PfGAT-ADCS a été faite dans E. coli (souche BL21). Malheureusement, nous n’avons jamais pu produire la protéine que se soit avec le gène de synthèse où le gène obtenu à partir de la banque d’ADNc. Cela est peut être lié à l’instabilité de la protéine, ou au fait que la protéine est produite mais que la bactérie la détruit au fur et à mesure de la traduction. A ce stade, nous ne pouvons qu’émettre des hypothèses. Nous n’avons pas eu le temps d’entreprendre une transcription et une traduction in vitro, approche qui aurait peut-être pu nous permettre de comprendre où se situe le problème d’expression : au niveau de la transcription en ARN messager ou au niveau de la traduction en protéine.

Surproduction de la GAT-ADCS de T. gondii

Nous avons effectué les mêmes approches in silico avec la GAT-ADCS de T. gondii (TgGAT-ADCS). L’analyse par Globplot de la TgGAT-ADCS indique une protéine très instable, avec de nombreuses régions désordonnées (dont les 100 premiers acides aminés). Par ailleurs, nous avons noté qu’il existait chez T. gondii une trentaine de résidus en amont de la zone conservée (base de données ToxoDB. http://toxodb.org/toxo/). Ces trente résidus ne sont apparemment pas impliqués dans l’adressage de l’enzyme dans un compartiment intracellulaire particulier. Lorsque nous avons voulu amplifier le gène par RT-PCR, nous n’avons jamais réussi à obtenir un amplicon complet, par contre nous avons pu amplifier un fragment qui débutait cinq acides aminés avant la zone conservé (25 acides aminés après le début de la séquence prédite sur ToxoDB). La séquence de TgGAT-ADCS que nous avons obtenu étant différente de celle annotée sur ToxoDB, nous avons conclu de ce travail que la séquence proposée dans la base de données était sans doute erronée. Il y a eu divers remaniement de la base de données ToxoDB au cours des 3 années de mon travail, et la séquence du gène TGME49_002920 a changé à plusieurs reprises. Aujourd’hui la dernière annotation du gène dans la base ToxoDB montre que la séquence codante prédite correspond à la séquence que j’avais amplifiée.
Le clonage a été réalisé dans le plasmide pet28b+ qui à servi à transformer la souche BL21 de E. coli. La croissance des bactéries est faite dans le milieu M9 avec 0.2% (p/v) de glucose, et à 17° C comme pour l’AtGAT-ADCS. Nous avons réussi à produire la protéine, mais celle-ci était essentiellement présente sous la forme de corps d’inclusion (figure 28)

Surproduction de la GAT-ADCS d’A. thaliana 1. Surexpression dans un système d’expression bactérienne

Dans un premier temps nous avons voulu réaliser le clonage du gène de la GATADCS d’A. thaliana (AtGAT-ADCS) sans les quatre-vingt premiers acides aminés car, en se basant sur l’alignement de séquence avec PabB d’E. coli, ces acides aminés pourraient correspondre au peptide de transit. Nous nous sommes rendu compte que la protéine produite était active mais peu stable au cours du temps. En analysant la séquence en acides aminés de l’AtGAT-ADCS avec le logiciel Globplot, nous avons constaté que la suppression des 80 premiers acides aminés conduit à une protéine prédite comme désordonnée au niveau du domaine GAT. En ne supprimant que 43 acides aminés, le logiciel Globplot prédit une protéine avec un domaine globulaire supplémentaire dans la région N-terminale, donc a priori plus stable. Le logiciel d’identification des peptides de transit Target P nous prédisait quant à lui une séquence d’adressage d’une quarantaine d’acides aminés. Nous avons donc produit et comparé les deux formes de l’AtGAT-ADCS : la forme longue (protéine native moins les 43 acides aminés) et la forme courte (protéine native moins les 80 acides aminés).

Propriétés cinétiques de la GAT-ADCS d’A.thaliana

Nous avons cherché à compléter les données cinétiques précédemment obtenues avec la GAT-ADCS (forme courte) d’A. thaliana (Sahr et al. 2006b). En effet, cette première version de l’enzyme recombinante n’était produite qu’en faible quantité et présentait une grande instabilité dans le temps. Au cours de cette première étude l’activité du domaine ADCS avait été peu étudiée. De même, le couplage entre les activités GAT et ADCS ou le couplage entre les activités GAT-ADCS et ADCL n’avaient pas été abordés. Disposant à présent d’une enzyme plus stable et produite en grande quantité, nous avons pu envisager d’autres types d’expériences. Par exemple, nous avons pu utiliser une approche de 15N-RMN (technique peu sensible qui exige de grandes quantités de protéine) pour mesurer simultanément à un instant donné les quantités de produits et substrats présents dans le milieu réactionnel.
Les données cinétiques de la GAT-ADCS peuvent être influencées par la présence d’ADCL qui évite que l’ADC, produit final de la réaction catalysée par la GAT-ADCS, ne s’accumule. Nous avons donc cherché à surexprimer l’ADCL d’Arabidopsis dont le gène a été identifié il y a quelques années (Basset et al. 2004d) . Malheureusement, toutes nos tentatives pour obtenir de l’enzyme recombinante active ont échoué. La protéine était bien exprimée, soluble et en quantité importante, mais non fonctionnelle. Nous avons donc alors cloné et surexprimé l’enzyme PabC d’E. coli (EcADCL). L’enzyme recombinante a pu être produite active et en grande quantité. Le couplage des activités GAT-ADCS et ADCL a donc été étudié à l’aide d’un système hétérologue, AtGAT-ADCS et EcADCL.
Les résultats obtenus ont fait l’objet d’une publication dans Archives of Biochemistry and Biophysics (Camara et al.2011) et sont décrits dans les pages suivantes.

Recherche d’inhibiteurs spécifiques de la GAT-ADCS par des approches de criblage à haut débit

Le criblage

La recherche d’inhibiteurs par criblage enzymatique à haut débit nécessite de disposer d’un test d’activité qui soit fiable, simple et compatible avec la plateforme robotisée. Le test que nous avons utilisé mesure l’activité GAT de la GAT-ADCS. Il met donc en œuvre le couplage de deux activités : la GAT-ADCS et la GDH (voir Matériel et Méthodes). Nous avons mis au point un test adapté aux petits volumes (80 µl) qui permet d’utiliser des plaques à 96 puits et qui ne consomme que de petites quantités de protéines. Dans un premier temps nous avons testé la fiabilité et la reproductibilité du test, en cherchant à obtenir un rapport signal sur bruit de fond optimal. Les paramètres que nous avons déterminés (concentrations en substrats, concentrations en enzyme, temps d’incubation précédant la mesure, nombre de points au cours de la cinétique) sont ceux qui nous ont permis d’obtenir la meilleure valeur de Z’, paramètre statistique qui doit être supérieur à 0.5 pour garantir une différence significative entre molécules actives et inactives (voir Matériel et Méthodes). Les paramètres que nous avons retenus (par puits : 80 µl 0.1 M Tris pH 8 ; 5 mM MgCl2 ; 25 µM chorismate ; 600 µM NAD ; 800 µM glutamine ; 0.7 µg GAT-ADCS ; 0.4 unité GDH ; mesure de l’activité après 5, 15 et 25 min) nous permettent de calculer un facteur Z’ compris entre 0.68 et 0.84.
Le criblage à haut débit a été réalisé avec la chimiothèque Prestwick® qui a la particularité d’être composée de molécules déjà répertoriées et pour la plupart disponibles dans le commerce. Nous avons obtenus à la suite du criblage primaire, une centaine de molécules bioactives qui inhibaient à plus de 50% la production de NADH. Un criblage secondaire à permis de confirmer l’action d’une trentaine de ces molécules, et un troisième passage effectué en présence de glutamate et sans GAT-ADCS a permis d’éliminer les molécules spécifiquement active sur la GDH (figure 35). Les concentrations utilisées pour ces criblages étant relativement élevées (100 µM), nous avons ensuite testé manuellement les molécules (une dizaine) qui nous semblaient les plus prometteuses afin de sélectionner celles qui étaient le plus actives (tableau 8).

La rubreserine inhibiteur de la GAT-ADCS

L’observation approfondie de l’effet de l’eseroline sur l’activité GAT-ADCS, indique que le potentiel inhibiteur de la solution d’eseroline augmente avec l’âge de la solution (figure 36A). Cette augmentation d’inhibition est concomitante avec l’apparition d’une coloration rouge, la solution d’eseroline évoluant d’une couleur rose pale au moment de sa préparation dans un tampon Tris/HCl pH 8, à rouge sang en quelques heures. Cette évolution de couleur est aussi caractérisée par le changement du spectre d’absorption de la solution d’eseroline (figure 36B) : un pic d’absorption à 475 nm apparait au cours du temps et se développe en 6 h environ. Ce pic apparait d’autant plus rapidement que la solution est agitée (oxygénée), mais n’apparait pas lorsque le pH de la solution est maintenu < 4 (figure 36B). Nous concluons de ces observations qu’un produit d’oxydation de l’eseroline se forme à pH alcalin, et que ce produit est vraisemblablement responsable de l’inhibition. En fait, la conversion pHdépendante de l’eseroline en rubreserine est relativement bien décrite dans la littérature (voir chapitre suivant). La différence entre l’eseroline et la rubreserine est caractérisée par la présence sur cette dernière de deux fonctions carbonyles portées par le cycle aromatique (voir figure 38). En effet, nous avons pu vérifier par spectroscopie 13C-RMN (figure 34C) la présence dans une solution d’eseroline à pH 8 de deux raies dans la région des carbonyles, raies qui sont absentes lorsque la solution est maintenue à pH 3.5. Enfin, nous avons vérifié par chromatographie HPLC en phase reverse (figure 34D) que la conversion de l’eseroline en rubreserine est effectivement complète en moins de 24 h. En effet, une solution d’eseroline à pH 8 préparée 24 h plus tôt présente un pic majeur (représentant plus de 90 % des pics détectés à 300 nm) avec un spectre sous le pic correspondant à celui de la rubreserine.

Table des matières

INTRODUCTION et SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Folate et métabolisme C1 chez les plantes
A. Folates
1. Biosynthèse du tétrahydrofolate chez les plantes
a. Biosynthèse des précurseurs
a1. Noyau ptérine
a2. Acide para-aminobenzoïque
b. Assemblage des précurseurs
c. Réduction et polyglutamination
2. Catabolisme et recyclage
a. Recyclage du pABA-glu
b. Recyclage du noyau ptérine
3. Trafic intracellulaire
B. Métabolisme C1
1. Origine des unités monocarbonées
a. Sérine et glycine
a1. Sérine
a2. Glycine
b. Formate
2. Interconversion des unités monocarbonées
3. Les principales voies métaboliques impliquant le métabolisme C1
a. La synthèse de méthionine
b. Le cycle des méthylations
c. La synthèse des nucléotides
c1. AMP et GMP
c2. Thymidilate
II. Biosynthèse du THF : les applications
A. Conséquences d’une carence en folate……
B. Comparaison des voies de biosynthèse du THF chez diverses espèces modèles
C. La filiation plante-apicomplexes
1. Définition des apicomplexes
2. La théorie de l’endosymbiose
3. Extrapolation du modèle plante vers les apicomplexes
D. La voie de biosynthèse du THF : une cible antibiotique, herbicide et antiparasitaire
1. La toxoplasmose et le paludisme : deux maladies causées par des parasites du phylum apicomplexe
a. La toxoplasmose
2. Les enzymes ciblées et les molécules efficaces
a. Inhibiteurs de la dihydroptéroate synthase
b. Inhibiteurs de la dihydrofolate reductase
3. La résistance aux inhibiteurs
III. La voie de biosynthèse du pABA : une cible potentielle
A. Les enzymes impliquées
1. L’ADC synthase
2. L’ADC lyase
B. Recherche d’inhibiteurs de l’ADC synthase
IV. Objectifs de ce travail
MATERIEL ET METHODES
I. Surexpression et purification des protéines recombinantes en système bactérien
A. Clonage dans les vecteurs d’expression pet28b+ et pet21b+
B. Surexpression des protéines recombinantes en système bactérien
1. Expression des ADC synthase (GAT-ADCS)
2. Expression de l’ADC lyase (ADCL)
3. Expression des protéines à domaines GAT
C. Purification et dosage des protéines recombinantes
1. Purification sur résine Ni-NTA
2. Purification par chromatographie de partage
3. Dénaturation des protéines à l’urée 8M
4. Renaturation des protéines sur boudin de dialyse
5. Dosage de la quantité de protéine
6. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS-page
II. Mesure de l’activité enzymatique des GAT-ADCS et ADCL
A. Mesure des activités GAT-ADCS et ADCL par absorbance
1. Mesure de l’activité du domaine GAT de la GAT-ADCS couplée avec l’activité de la glutamate déshydrogénase(GDH)
2. Mesure des activités GAT-ADCS et ADCL couplées avec celle de la lactate déshydrogénase (LDH)
B. Mesure des activités GAT-ADCS et ADCL par fluorescence
1. Mesure de l’activité du domaine GAT de la GAT-ADCS couplée avec
celle de la glutamate déshydrogénase
2. Mesure du couplage des activités GAT-ADCS et ADCL
C. Mesure de l’activité GAT-ADCS et ADCL en RMN
III. Criblage à Haut débit
A. Mesure de l’activité
2. Mise au point du test pour le criblage à haut ébit
B. Criblage primaire et secondaire
IV. Organismes modèles étudiés et méthodes de culture : A. thaliana, T. gondii, P. falciparum et fibroblastes humains
A. Préparation de la solution d’éseroline
B. Arabidopsis thaliana
1. Culture de plantules d’A. thaliana
2. Culture de cellules d’A. thaliana
C. Fibroblaste humains et Toxoplasma Gondii
1. Invasion synchronisée des cellules hôtes par T. gondii
2. Traitement en présence de composés candidats antiparasitaire
a. Le test d’invasion
b. Le test de prolifération
D. Plasmodium falciparum
V. Dosage de la teneur en folate et en pABA dans des cellules d’Arabidopsis thaliana en culture
A. Dosage de la teneur en pABA dans les cellules par HPLC
1. Préparation des échantillons de cellules
2. Conditions du dosage HPLC et détection du pABA
B. Dosage de la teneur en folate dans les cellules par LC-MS/MS
1. Préparation des échantillons.
2. Dosage du folate par LC-MS/MS
RESULTATS
Chapitre I : la synthèse de l’acide para-aminobenzoïque : mécanisme réactionnel et propriétés biochimiques de l’enzyme bifonctionnelle glutamine amidotransferase/aminodeoxychorismate synthase
I. Comparaison des séquences des ADC synthases de différentes espèces…….
A. Analyse et comparaison des séquences
B. Arbre phylogénétique des ADC synthase (GAT-ADCS)
II. Surproduction des GAT-ADCS recombinantes
A. Surproduction de la GAT-ADCS de P. falciparum
B. Surproduction de la GAT-ADCS de T. gondii
C. Surproduction de la GAT-ADCS de A. thaliana
1. Surproduction dans un système d’expression bactérien
2. Etude de la stabilité par thermo-fluorescence des formes courte et longue de la GAT-ADCS d’A. thaliana
3. Etude de la stabilité au cours du temps par dosage d’activité des formes courte et longue de la GAT-ADCS d’A. thaliana
4. Discussion
IV. Conclusion
Chapitre II Inhibition de la biosynthèse de l’acide para-aminobenzoïque et impact sur la croissance des plantules d’A. thaliana et des parasites T. gondii et P. falciparum
I. Recherche d’inhibiteurs spécifiques de la GAT-ADCS par des approches de criblage à haut débit
A. Le criblage
B. La rubreserine inhibiteur de la GAT-ADCS
C. L’éseroline et la rubreserine sont des produits de dégradation de la physostigmine
II. Inhibition de la biosynthèse du pABA par la rubreserine chez les plantes et les apicomplexes : conséquences pour la croissance des plantes et la prolifération des parasites
III. Conclusion
PERSPECTIVES
I. La voie de biosynthèse du pABA
II. L’inhibition de la biosynthèse du pABA
REFERENCES

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