Biopuces sans marquage

Biopuce

Définition Une biopuce est un dispositif destiné à caractériser des interactions biochimiques ayant lieu entre deux espèces, l’une étant immobilisée à la surface de la puce, et l’autre en solution, (« l’analyte ») étant mise en contact dans un second temps. L’immobilisation est réalisée de telle sorte que le site de « reconnaissance » spécifique des molécules d’intérêts introduites dans la solution soit stériquement accessible pour les analytes. La détection est basée sur la mesure du résultat des réactions, biochimiquement spécifiques, qui ont lieu à la surface de la puce. Cette reconnaissance biochimique est transformée en un signal mesurable macroscopiquement par l’utilisation d’un transducteur, qui permet de déterminer le taux de reconnaissance et de quantifier les éléments biologiques d’intérêt dans la solution. L’usage de plusieurs espèces en parallèle à la surface de la puce permet de réaliser une détection multiplexe particulièrement intéressante. Les espèces sont ainsi immobilisées sous forme de plots ou « spots » de taille typique 10-150 µm de diamètre. La Figure 1.1 donne en coupe le schéma d’une biopuce générique. Différents protocoles existent pour immobiliser les espèces à la surface de la puce, aboutissant à un attachement physico-chimique ou chimique covalent. Les interactions pouvant être étudiées sont diverses. On distingue les puces à ADN et les puces à protéines. Dans le cas des biopuces à ADN, la molécule greffée à la surface de la puce est le brin d’ADN complémentaire au brin que l’on cherche à détecter. Les puces à ADN permettent, par exemple d’analyser le niveau d’expression des différents gènes d’une cellule, de détecter des mutations génétiques, de déceler la présence de pathogènes dans l’environnement et dans les aliments… Par comparaison avec l’expression génétique, le comportement des protéines est plus complexe. En contrepartie, les puces à protéines permettent une compréhension fondamentale de l’origine d’une maladie ou de l’action d’un médicament par exemple. Les puces à protéines peuvent être appliquées pour différents types de couples ligand/récepteur. On peut ainsi analyser les interactions antigène/anticorps, enzyme/substrat, protéine/ADN, protéine/ARN… La molécule greffée sur la puce sera alors l’un des deux partenaires du couple ligand/récepteur. Par exemple, pour identifier un antigène donné dans une solution, on greffe à la surface de la puce un anticorps spécifique de cet antigène. Pour la détection de virus ou de bactéries entières, on greffe à la surface de la puce des anticorps dirigés contres des protéines qui se trouvent sur leur paroi. Le Tableau 1.1 donne la taille typique des éléments à détecter. Par interaction moléculaire, si les antigènes sont présents dans la solution, ils viennent s’associer de manière spécifique à leur partenaire immobilisé à la surface de la puce.  Les applications des biocapteurs sont très vastes : domaine médical, synthèse de composés pharmaceutiques, environnement (détection de pesticides), pollution, défense et sécurité … Les applications les plus intéressantes pour Thales sont la défense (détection de bactéries ou autres composés biologiques dans les attaques bioterroristes ou en cas de guerre bactériologique) ainsi que le risque pandémique pour les applications de santé publique.
Propriétés Les caractéristiques importantes que doivent satisfaire les systèmes de biodétection sont :
• la spécificité : la reconnaissance est basée sur la complémentarité entre l’élément biologique à la surface de la biopuce, et l’élément biologique d’intérêt dans la solution. Il est important que des éléments non spécifiques ne viennent pas s’accrocher à la surface du capteur pour ne pas gêner la reconnaissance des espèces recherchées ou conduire à des analyses de « faux positifs ».
• la sensibilité : elle doit être élevée afin de pouvoir détecter des variations d’éléments biologiques les plus faibles possibles. En ce qui concerne les capteurs immunologiques, une sensibilité de l’ordre de 10 pg/mm² est adéquate. Ceci correspond à 10-12 moles de carbone par mm² soit 1 atome de carbone C par nm² dans une géométrie à 2D répartie uniformément.
• le caractère multiplexe : la détection de plusieurs analytes en parallèle est particulièrement intéressante. Pour ce faire, le dispositif de détection doit être commun pour tous les sites de la puce.
• la détection en continu (ou à intervalles de temps réguliers) : ceci permet au capteur d’être utilisé tant qu’il n’a pas reconnu l’élément biologique d’intérêt et de pouvoir déterminer des constantes cinétiques de réaction.
• le coût : d’une part en ce qui concerne la biopuce, et d’autre part en ce qui concerne l’appareil de mesure (transducteur).
• la rapidité de la détection : elle doit être compatible avec la mise en place d’actions rapides et doit permettre une réponse dans des constantes de temps de l’ordre de la minute pour l’étape d’identification. Ce paramètre est surtout lié au transport de masse dans le milieu environnant, mais la sensibilité du système permet de diminuer le temps nécessaire à la mesure.
• la compacité du système (poids et encombrement).
• l’absence de marquage : les méthodes de détection ne nécessitant pas de lier un marqueur sur la molécule à détecter sont particulièrement avantageuses. En effet, le marquage (particules radioactives, marqueurs fluorescents, particules absorbantes) constitue une étape supplémentaire, coûteuse en temps et en réactif et peu compatible avec les mesures en temps réel. De plus, les marqueurs peuvent parfois interférer avec les interactions moléculaires en se liant de manière non spécifique sur un site de liaison, et ainsi provoquer des « faux positifs ».

Méthodes optiques à ondes guidées

   Nous donnons ici un aperçu des différentes méthodes à ondes guidées et commentons notamment leur capacité de multiplexage (détection de plusieurs éléments en parallèle), ainsi que leur limite de sensibilité.
Méthodes basées sur une onde guidée :Ces méthodes sont basées sur l’interaction de cette onde guidée avec un milieu contenant les éléments biologiques dont on cherche à déterminer la variation d’indice effectif. Généralement, elles exploitent uniquement la variation de la partie réelle de l’indice optique sondée par l’onde guidée. Certaines exploitent aussi la partie imaginaire de l’indice optique, témoin de l’absorption. L’onde guidée peut être mesurée directement par transmission au bout d’un guide d’onde, ou en exploitant la modification des conditions de résonance induite par les éléments biologiques à la surface.
Méthodes basées sur la mesure directe de l’onde guidée : Les méthodes interférométriques (interféromètres Mach-Zehnder [Heidemann, 1993], Young [Schmitt, 2007]…) exploitent l’interférence entre deux ondes guidées. L’une sert de référence, alors que la seconde est déphasée du fait de l’interaction entre le champ de l’onde guidée et le milieu biologique. Pour plus de précisions, plusieurs longueurs d’onde peuvent être utilisées. La mesure du déphasage entre le bras de référence non fonctionnalisé, et le bras fonctionnalisé permet de déterminer la quantité de biomolécules qui se sont accrochées à la surface du guide d’onde. La spectroscopie de réflexion totale atténuée est basée sur la partie imaginaire de l’indice optique; elle exploite l’absorption de la couche biologique [Mendes, 1999]. Pour être mise en œuvre, le milieu biologique à étudier doit être absorbant [Araci, 2007]. Cette méthode peut être utilisée à une longueur d’onde donnée ou bien sur un large domaine de longueurs d’onde pour obtenir le spectre d’absorption, mais avec un dispositif de faible taille. Pour une propagation de 1.6 cm à une longueur d’onde centrale de 550 nm, le système permet d’amplifier l’absorption par un facteur . On aura donc typiquement un seuil de détection de 1 pg/mm² pour une protéine de coefficient d’absorption typique de 2×10-3 cm²/µg. Cependant, la condition d’absorption limite le nombre de molécules auxquelles on peut appliquer cette technique. Des projets de recherche sont en cours pour appliquer cette méthode au domaine ultraviolet, de 190 à 450 nm [Mendes, 2009]. Cependant, l’absorption des matériaux constituant le guide est problématique puisque la longueur de propagation recherchée ici est de l’ordre du centimètre.
Méthodes basées sur une résonance :D’autres méthodes sont basées sur la modification du comportement résonant d’une onde guidée. L’adsorption des molécules biologiques à la surface de la puce modifie l’indice effectif de l’onde guidée et influence le comportement résonant de cette onde. Ceci se traduit par une modification de la phase et de l’amplitude de l’onde transmise/réfléchie. On distingue les couplages par plasmon de surface et les couplages dans les guides d’ondes diélectriques. La méthode optique la plus répandue et commercialisée est la résonance par plasmon de surface (Genoptics, BIACORE, Applied Biosystems…). Les interactions biologiques à la surface de la puce sont analysées en observant le comportement résonant de l’onde guidée à l’interface métal/diélectrique. De manière similaire à la SPR, il est possible d’utiliser les propriétés de couplage d’une onde guidée avec les éléments biologiques en utilisant des structures guidantes diélectriques [Schmitt, 2008]. Dans ce cas, le guide d’onde diélectrique est conçu pour pouvoir guider une onde localisée près de l’élément biologique. Ceci permet d’obtenir une interaction plus importante et une meilleure sensibilité. Que ce soit avec les résonances plasmoniques ou avec les modes guidés dans les diélectriques, la mesure est basée sur la modification des conditions de résonance. La sensibilité maximale à la présence d’un élément biologique est obtenue à la résonance. Pour qu’il y ait couplage avec l’onde guidée, la projection du vecteur d’onde de l’onde incidente sur la surface de la puce doit être égale au vecteur d’onde du mode guidé.

Détection UV

   Le montage utilisé doit comporter une source émettant en UV aux longueurs d’ondes 260-280 nm, une biopuce et un détecteur sensible à ces longueurs d’onde qui va permettre de faire l’image de la puce. Le montage utilisé est un montage en réflexion (Figure 1.12). Des configurations en transmission sont aussi possibles, à condition de disposer de substrats transparents dans l’UV. Ce schéma donne aussi la distribution typique du champ électrique dans la structure pour une structure multicouche (vert) et pour une structure résonante (rouge). Ceci sera revu dans la suite du manuscrit. Les spectres d’absorption des éléments biologiques sont relativement larges (~20-30 nm) (Tableau 1.3 et Tableau 1.4). De manière à être sensible uniquement à la bande d’absorption des molécules biologiques, une sélection en longueur d’onde sera nécessaire. Celle-ci peut être obtenue soit en insérant un spectroscope après une source large, soit en utilisant une instrumentation sensible uniquement au domaine d’intérêt, via l’utilisation de sources à spectre étroit (DEL ou laser), de filtres, ou bien de détecteurs spectralement sélectifs. Selon qu’on souhaite faire de l’imagerie sur puce quart d’onde ou bien en conditions résonantes, on utilisera un filtrage plus ou moins exigeant. Dans le cas d’un spectre large, on bénéficie de plus de flux, mais l’imagerie en conditions résonantes implique un filtrage exigeant (λr, θr). Le domaine UV suscite depuis quelques années un intérêt croissant avec l’apparition sur le marché de composants à base d’AlGaN permettant intrinsèquement une sélectivité spectrale. Nous décrivons ici les éléments pouvant être utilisés en imagerie UV.

Absorption imagée en réflexion

  La réflectivité de la structure est obtenue en utilisant les coefficients de Fresnel. Afin de suivre un chemin analogue à ce qui sera présenté pour les structures résonantes, nous explicitons ici le calcul des grandeurs optiques de transmission, réflexion et absorption à partir des expressions des coefficients de Fresnel. Les coefficients de Fresnel dépendent de la polarisation du champ électromagnétique. On considère les ondes transverses électriques (TE) pour lesquelles le champ électrique est polarisé perpendiculairement au plan d’incidence, et les ondes transverses magnétiques (TM), pour lesquelles le champ magnétique est polarisé perpendiculairement au plan d’incidence.

Spectre de réflectivité

   Comme nous le confirmerons par la suite en nous intéressant au profil des harmoniques, les conditions les plus sensibles à la présence d’une couche biologique sur la puce correspondent à l’excitation du mode guidé dans le nitrure. Le couplage se traduit par une forme résonante sur le spectre de réflectivité. Nous donnons Figure 2.14 l’efficacité de diffraction (a) dans l’ordre 0 et (b) dans l’ordre –1 obtenu pour une condition d’éclairage de 38°, correspondant à l’excitation du mode guidé dans le nitrure à la longueur d’onde de 280 nm. L’efficacité de diffraction est déterminée en l’absence et en présence d’une couche biologique d’épaisseur 0.5 nm, et d’indice de réfraction n=1+0.2i, correspondant à une absorption de 5×10-3. On observe que l’efficacité de diffraction est diminuée en présence d’éléments biologiques à la surface de la puce. Par contre, les conditions de résonance (λr, θr) ne sont pas modifiées. A partir des spectres de réflectivité, il est possible de déterminer le contraste C=∆R/R puce, ainsi que l’amplification de contraste Γ=C/(αl). Le contraste est donné sur l’ensemble du spectre Figure 2.14. A l’ordre 0, on obtient un contraste de 0.3, correspondant à une amplification de contraste de Γ=60. A l’ordre –1, on obtient un contraste de 0.11 soit une amplification de contraste de 23. Notons que l’amplification de contraste est moins bonne sur l’ordre –1 que sur l’ordre 0. Ceci s’explique par la définition du contraste, où l’on normalise par la réflectivité. L’amplification de contraste maximale est ainsi  obtenue au minimum de réflectivité.

Table des matières

Introduction
Chapitre I : Etat de l’art en biodétection optique et composants dans l’ultraviolet
I – Biopuce
I-1. Définition
I-2. Propriétés
I-3. Interactions biologiques
I-3. a) Structure de l’ADN
I-3. b) Structure des protéines
I-3. c) Interactions
I-4. Modèle biologique considéré dans ce travail
I-5. Méthodes de détection
II – Biodétection optique
II-1. Critères de comparaison
II-2. Détection avec marquage
II-2. a) Tests Elisa
II-2. b) Fluorescence
II-2. c) Marqueurs absorbants
II-3. Méthodes optiques sans marquage
II-3. a) Méthodes optiques réflectométriques directes
II-3. b) Méthodes optiques à ondes évanescentes
III – Détection en absorption dans l’ultraviolet
III-1. Généralités
III-2. Absorption UV de l’ADN et des protéines
III-2. a) Absorption de l’ADN à 260 nm
III-2. b) Absorption des protéines à 280 nm
III-2. c) Absorptions surfaciques
III-2. d) Sensibilité
IV – Détection UV
IV-1. Détecteurs
IV-2. Filtres
IV-3. Différents types de sources
IV-3. a) Les lampes
IV-3. b) Diodes électroluminescentes (DEL)
IV-3. c) Lasers
IV-3. d) Comparaison de la puissance des différentes sources
IV-4. Sensibilité limite
V – Discussion
Chapitre II : Théorie des renforcements de contrastes
I – Contraste sur structures multicouches
I-1. Définition du contraste
I-2. Absorption
I-2. a) Approche dipolaire
I-2. b) Absorption en transmission
I-2. c) Absorption imagée en réflexion
I-2. d) Exaltation du contraste d’absorption
I-3) Absorption /Partie réelle de l’indice optique
II – Structures résonantes
II-1. Réseau résonant
II-1. a) Guide d’onde asymétrique
II-1. b) Réseau de couplage
II-1. c) Condition de résonance
II-2. Propriétés des réseaux résonants
II -2. a) Modes de Bloch
II-2. b) Matrices de diffusion
III – Contraste sur structures résonantes
III-1. Structures définies
III-1. a) Caractéristiques requises
III-1. b) Influence des différents paramètres du réseau
III-1. c) Propriétés
III-2. Contraste d’absorption en réflectivité
III-2. a) Spectre de réflectivité
III-2. b) Modes guidés
III – 3. Effet partie réelle/absorption de l’élément biologique
IV – Finesse de la résonance
IV-1. Position du problème
IV-2. Limites dues aux résolutions expérimentales
IV-3 Finesse et résolution instrumentale
IV-4. Finesse et résolution spatiale
V – Conclusion
Chapitre III : Résultats expérimentaux
I – Préparation de la puce
I-1. Etapes de fabrication
I-2. Caractérisation par ellipsométrie
I-2. a) Ellipsométrie
I-2. b) Mesures
I-2. c) Modèle de Lorentz
I-2. d) Loi de dispersion des matériaux de la puce
I-2. e) Structures fabriquées
I-3. Biopuce structurée
I-3. a) Réseau de diffraction
I-3. b) Structure réseau
II – Préparation biologique
II-1. Absorption de la protéine
II-2. Greffage de la protéine
II-2. a) Préparation de la surface
II-2. b) Silanisation
II-2. c) Immobilisation de la protéine
II-3. Caractérisation en ellipsométrie et loi de dispersion de la protéine
II-4. Caractérisation AFM des spots biologiques
II-4. a) Epaisseur et homogénéité des spots
II-4. b) Spots de protéines sur réseau
III – Imagerie sur puce quart d’onde
III-1. Rappels des résultats sur puce silice/aluminium
III-1. a) Calibration avec spots de dioxyde de titane
III-1. b) Premières expériences biologiques
III-2. Puce silice sur silicium
III-2. a) Montage optique
III-2. b) Détermination des contrastes attendus
III-2. c) Analyse des images
III-3. Résultats expérimentaux
IV – Imagerie sur puce guide d’onde
IV-1. Puce utilisée
IV-2. Analyse spectroscopique
IV-2. a) Montage goniométrique
IV-2. b) Mesures spectroscopiques
IV-2. c) Modification des conditions de résonance
IV-2. d) Imagerie en conditions résonantes
IV-2. e) Imagerie dans l’ordre 0
IV-2. f) Imagerie dans l’ordre-1
V- Conclusion
Chapitre IV: Intégration sur la résonance
I – Achromatisation
I-1. Intégration
I-2. Condition de résonance
I-3. Relation de dispersion
I-3. a) Caractéristiques spectrales
I-3. b) Pré-dispersion de l’éclairage à obtenir
II – Compensation de dispersion
II-1. Eléments dispersifs
II-1. a) Prisme
II-1. b) Réseau
II-1. c) Association d’éléments dispersifs
II-2. Couplage au mode guidé avec un réseau pré-disperseur
II-2. a) Réseau coupleur
II-2. b) Configuration avec réseau sur mesure
II-2. c) Réseau commercial utilisé au 3eme ordre
III – Gain en rapport signal sur bruit
III-1. Gain en signal
III-2. Gain en sensibilité
III-2. a) Dispositif considéré
III-2. b) Gain en rapport signal sur bruit
III-3. Application à l’imagerie
III-3. a) Biopuce de finesse F~200
III-3. b) Images obtenues pour différentes finesses
IV – Conclusion
Conclusion
Annexe A : Dispositif de détection
Eclairage
Optique d’imagerie
Résolution
Détecteur
Bruit du dispositif
Limite de sensibilité
Annexe B : Detection of biologic macromolecules on a chip dedicated to UV specific absorption
Annexe C : Fabrication des réseaux résonants
Annexe D : Expériences préliminaires de fluidique

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