Biominéralisation osseuse

Le Tissu Osseux

Généralités, Composition Le tissu osseux est un tissu conjonctif qui, avec le cartilage, constitue l’endosquelette des vertébrés [1], [2]. D’un point de vue mécanique, il supporte le poids du corps permettant ainsi son déplacement en conjonction avec les muscles et les articulations, et fournit également une protection aux organes internes. D’un point de vue métabolique, il sert comme réservoir ionique prenant ainsi part à l’homéostasie du fluide extracellulaire. Il est également connu pour son rôle hématopoïétique [3] (i.e. la sécrétion et le renouvellement des cellules sanguines) puisqu’il renferme la moelle osseuse. Enfin, d’un point de vue de la science des matériaux, le tissu osseux est un matériau hybride minéral-organique (ce qui le classe ainsi dans la catégorie des tissus durs) qui possède une organisation très sophistiquée. La constance requise pour assurer les propriétés mécaniques du tissu osseux paraît en contradiction avec son besoin de versatilité afin d’assurer ses fonctions métaboliques ; ce qui traduit la grande complexité de ce tissu. Les constituants élémentaires du tissu osseux,  sont les suivants :
(i) Le composé majoritaire en masse est un minéral de phosphate de calcium carbonaté (~64 % en masse), lequel cristallise sous la forme de nanocristaux adoptant une structure d’apatite. Il s’agit de la phase cristalline la plus stable thermodynamiquement dans des conditions physiologiques parmi tous les phosphates de calcium [5], [6].
(ii) Le second constituant est une protéine polypeptidique, le collagène de type I (~22 % de la masse totale et ~90 % de la masse protéique) qui adopte un arrangement fibrillaire.
(iii) Le troisième constituant est l’eau (~9 % en masse). Cette eau se trouve aussi bien sous forme d’eau dite libre au sein du fluide extracellulaire, que sous forme d’eau physisorbée à la surface du minéral ou bien en interaction avec des molécules organiques, mais également en tant qu’eau de structure incorporée dans le réseau cristallin de l’apatite. Ces trois constituants majoritaires que sont le minéral, le collagène de type I et l’eau seront présentés de manière plus approfondie dans la suite de ce manuscrit.
(iv) Vient ensuite une multitude de macromolécules appelées protéines noncollagéniques (PNCs) (~3 % en masse). On distingue plusieurs sortes de PNCs, dont environ 25 % d’entre elles sont de nature exogène puisqu’elles proviennent principalement du plasma sanguin, et sont ainsi appelées protéines plasmatiques comme l’albumine, la transferrine ou encore l’hémoglobine-β par exemple [7]. Le reste est au contraire produit par des cellules ostéoformatrices (i.e. les ostéoblastes). Ainsi ces PNCs endogènes sont localisées au sein même de la matrice extracellulaire où elles sont en interaction intime avec tous les acteurs de la minéralisation osseuse. Il n’est pas étonnant dès lors qu’on les suspecte de jouer des rôles multiples et distincts à chaque étape, de la nucléation à la croissance du minéral, à la façon avec laquelle le minéral se dépose puis s’organise au sein de la matrice de collagène, ou bien même d’avoir également un rôle d’inhibition envers la précipitation du minéral [8]–[10]. De plus, ces PNCs endogènes sont tellement nombreuses, de l’ordre de 200 au sein d’un os bovin par exemple [11], qu’il est difficile d’en dresser une liste exhaustive. On peut néanmoins les classer selon trois catégories principales [7], [9] :
– Les protéines GLA, appelées de cette façon car elles possèdent un domaine riche en résidus glutamate gamma-carboxylé (ou résidus GLA). Elles sont au nombre de trois : l’ostéocalcine, la MGP (pour Matrix GLA Protein), et la GRP (pour GLA-Rich Protein).
– Les glycoprotéines, sont des hétéroprotéines constituées d’une partie polypeptidique sur laquelle sont greffés des chaînons formés de plusieurs oses ou dérivés d’oses. Cette catégorie de PNC comprend l’ostéonectine, l’ostéopontine, la BSP (pour Bone SialoProtein) ou la DMP-1 (pour Dentin Matrix Protein-1) par exemple. Les trois dernières sont appelées SIBLINGs (pour Small Integrin-Binding LIgand, N-linked Glycoproteins).
– Les protéoglycanes, sont constituées d’une chaîne polypeptidique sur laquelle sont greffées des chaînes linéraires glycosaminoglycanes (ou GAGs). Cette catégorie de PNC comprend la décorine par exemple. Les protéines GLA sont connues pour leur forte affinité à l’égard du calcium des cristaux d’apatite via leurs résidus glutamate gamma-carboxylé [12]. De manière plus inattendue, il a été décelé récemment qu’une protéine GLA comme l’ostéocalcine, exclusivement sécrété par les ostéoblastes au sein de l’os, a également une fonction endocrinienne régulant des fonctions physiologiques qui n’ont rien à voir avec le tissu osseux ; comme stimuler la sécrétion d’insuline [13] ou encore favoriser la production de testostérone [14]. De leur côté, les SIBLINGs, appelées également protéines acides car riches en résidus acides aspartique et acides glutamique, jouent notamment un rôle dans l’adhésion des cellules à la matrice extracellulaire (MEC, voir ci-dessous), ainsi que comme support de nucléation pour le minéral [8]. Un protéoglycane comme la décorine est connu pour sa capacité à se lier au collagène, régulant ainsi potentiellement l’agencement tridimensionnel des fibrilles. Parmi ces PNCs produites de façon endogène, on trouve également un grand nombre de ce que l’on appelle des facteurs de croissance. Parmi eux, par exemple, les BMPs (pour Bone Morphogenetic Proteins) ou les TGF-beta (pour Transforming Growth Factors), lesquels ont des actions spécifiques sur l’ostéogénèse. L’ostéogénèse correspond à la l’élaboration du tissu osseux, depuis l’activation des cellules progénitrices jusqu’à l’étape finale de minéralisation. Enfin, on trouve également plusieurs enzymes, comme la phosphatase alcaline et la lysyl oxydase par exemple, lesquelles ont des rôles importants dans la fabrication des composants de la matrice extracellulaire.
(v) Puis finalement des cellules (~2 % en masse), dont certaines sont des cellules osseuses en charge de la formation (les ostéoblastes) et de la résorption (les ostéoclastes) du tissu alors que d’autres assurent la vascularisation et l’innervation de l’édifice (cellules endothéliales…), toutes alimentées par un réseau complexe de canalicules (i.e. canaux de Havers et de Volkmann). L’apatite (i), dont la caractérisation structurale et chimique sera l’objet principal de cette thèse, constitue à lui tout seul ce que l’on appelle la matrice inorganique ; alors que le collagène (ii) et les PNCs (iv) constituent eux la matrice organique. Les constituants (i), (ii), (iii) et (iv) composent ensemble la matrice extracellulaire (MEC). Au sein de cette MEC, on peut noter également la présence de petits composés ioniques tel le citrate, bien connu pour son fort pouvoir chélatant envers les ions calcium. Les proportions massiques regroupées dans le Tableau 1 sont des valeurs moyennes au sein de la partie médiane d’un os long (os cortical) de mammifère tel que l’homme chez un individu adulte. Ces valeurs sont indiquées à titre informatif et ne sont assurément pas des valeurs absolues. En effet, la composition du tissu osseux peut être très disparate et varier en fonction de l’espèce, de l’âge et du régime alimentaire de cette dernière, de la localisation du tissu ainsi que d’une éventuelle pathologie. Ces disparités, quand elles sont naturelles et non pathologiques, rendent compte de la forte adaptabilité du tissu osseux à sa fonction biologique ou mécanique. A titre d’exemple, un animal comme la gazelle a besoin d’être agile afin de fuir face aux prédateurs. Cela nécessite d’avoir des os plutôt légers et souples lesquels sont ainsi peu minéralisés, de l’ordre de 50 % en masse [15]. De ce fait, ce type d’os gagne en flexibilité [15], mais également en légèreté (la densité du collagène est approximativement deux fois moindre que celle de l’apatite i.e. ~1.3g/cm3). Au contraire, les os qui composent le museau d’une baleine ont une proportion en minéral impressionnante proche de 96 % en masse [16], taux record au sein des vertébrés. Ceci les rend donc beaucoup plus lourds afin de, on peut l’envisager, favoriser leur immersion. Cependant, de manière générale, les tissus osseux des mammifères et des oiseaux présentent de fortes similitudes. En revanche, chez les téléostéens (classe regroupant les poissons possédant un squelette), les cas de figure sont bien plus complexes. En effet, par exemple, il se trouve que la plupart de ces derniers possèdent des arrêtes qui ne contiennent pas ou plus de cellules osseuses [16]. Tel est le cas pour le rostre (le prolongement rigide de la tête) chez l’espadon par exemple [16]. On se retrouve dans un cas particulier où le tissu osseux est quasiment inerte et la façon avec laquelle le tissu fait fi de cette absence de cellules est encore très obscure. Ce n’est pas tout, certaines espèces de reptiles, dont les lepidosauria par exemple, possèdent des os peu, voire pas du tout vascularisés [17]. Trêve de cas particuliers, place maintenant aux tissus osseux des mammifères, lesquels sont dits vivants car vascularisés et riches en cellules osseuses. Cela se traduit dans un premier temps par une perpétuelle évolution du tissu afin de s’accommoder à la croissance de l’individu. Ensuite, une fois que l’individu a atteint sa taille adulte, le tissu osseux subit un renouvellement constant afin de : colmater de potentielles lésions (propriétés d’autoréparation de micro-fractures) ; d’assurer la libération de certains ions (Ca2+, HPO42-…) en fonction des besoins du métabolisme ; ou bien même de contrer le phénomène de maturation des cristaux d’apatite (lequel sera discuté ultérieurement). Ce phénomène est appelé remodelage osseux, et il s’effectue par le biais de réactions de résorption, puis de formation (ostéogénèse) incessantes sous l’action des cellules osseuses spécifiques : les ostéoclastes (cellules résorptrices) et les ostéoblastes (cellules formatrices). Pour un lieu donné au sein du tissu, il se produit tout d’abord la phase de résorption, puis ensuite, celle de formation, le tout suivi par une phase de quiescence, et ainsi de suite. Il est estimé que pour un être humain de jeune âge (c’est à dire moins de 30 ans), la totalité de son squelette est résorbé et reformé tous les 5 à 6 ans [2]. Ce mécanisme est ininterrompu, et il ne s’effectue pas à la même vitesse au sein des différents tissus osseux d’un individu (ni même d’ailleurs au sein d’un unique tissu donné). Il conduit ainsi à une disparité en terme de composition, et ceci notamment car l’os néoformé se minéralise progressivement. De plus, au sein du squelette humain par exemple, on dénombre 206 os constants avec des formes et des tailles variables (cf. Figure 1). Ces pièces osseuses se classent selon trois catégories en fonction de leurs morphologies : les os longs (fémur, tibia…), les os courts (os du carpe) et les os plats (sternum, os du crâne…). On trouve également une douzaine d’os dits sésamoïdes (paletta, fabella…). Ces derniers sont des cas particuliers puisqu’ils proviennent de la minéralisation initiale d’un tendon. Certains de ces os sésamoïdes ne sont pas répertoriés parmi les 206 pièces osseuses du squelette, car ils ne sont pas constants d’un individu à l’autre et sont appelés os surnuméraires (telle la fabella par exemple).

Le minéral : l’apatite biologique

Généralités Au même titre que le collagène, l’apatite est un minéral ubiquitaire. Effectivement, on trouve l’apatite comme composante minérale au sein de nombreux tissus minéralisés, tels : l’os [35], l’émail et la dentine [36] ; mais également le tendon minéralisé chez la dinde [18] ; la défense de certains mammifères comme l’ivoire chez l’éléphant [37] ou bien les bois de cerf [38] ; les pattes ravisseuses de certains crustacés comme la squille odontodactylus scyllarus [39] ; l’écaille de certains poissons comme celles des requins [40]… L’apatite se retrouve également sous la forme de calcifications pathologiques, comme par exemple dans les calculs rénaux ou les plaques de Randall [41]. Mais l’apatite n’est pas seulement rencontrée au sein du vivant puisqu’il s’agit également d’un minéral géologique, qui peut être à la fois de source volcanique ou sédimentaire. Ainsi, pour les amateurs de lithothérapie, une apatite géologique telle l’apatite bleue est supposée posséder diverses vertus, comme accroitre la communication et la solidarité de son détenteur. Il faut savoir également que d’autres phases de phosphate de calcium ont été suspectées par le passé de rentrer dans la composition du minéral osseux mature. Une chose est néanmoins certaine aujourd’hui, c’est que la biominéralisation osseuse conduit uniquement à l’apatite. Ce résultat n’est pas forcément intuitif puisque le fluide extracellulaire au sein du tissu osseux est en sursaturation à l’égard de nombreuses phases cristallines [42]. Ceci inclut l’apatite, mais également d’autres phosphates de calcium (tel le phosphate octocalcique, OCP, de formule Ca8(HPO4)2(PO4)4.5H2O), ou bien même des carbonates de calcium (telle la calcite, un polymorphe de CaCO3) par exemple. Attention toutefois, puisque le concept de sursaturation n’est valable seulement que dans le cas d’un mécanisme de croissance par nucléation homogène.

Nucléation homogène au sein des vésicules matricielles

  L’un des objectif majeur des études portant sur la biominéralisation osseuse est de comprendre où et comment se déroule la déposition du minéral (ou calcification) au sein de la MEC ; alors que dans le même temps, aucun minéral ne se dépose au sein des tissus nonminéralisés (à l’exception des calcifications pathologiques). Cette question se pose à juste titre car les tissus minéralisés (os, dent…) et les tissus non-minéralisés (le tissu pulmonaire par exemple) sont tous baignés par le même fluide extracellulaire [2], lequel est sursaturé à l’égard de nombreuses phases cristallines dont l’hydroxyapatite [6]. Les premières hypothèses émises à partir des années 1920-1930 afin de décrire la déposition du minéral osseux, se sont orientées vers une possible activité cellulaire propre au tissu osseux via les ostéoblastes [74]. Plus précisément, il fut proposé que la nucléation de l’apatite se produit à l’intérieur de vésicules extracellulaires (appelés vésicules matricielles) provenant de la membrane plasmique externe des ostéoblastes [75], [76]. En effet, l’activité biologique à l’intérieur de ces dernières conduit à l’augmentation locale de la concentration en précurseurs ioniques du minéral (Ca2+, PO43-…), qui serait telle qu’elle conduirait en une sursaturation élevée pouvant induire spontanément la nucléation homogène de l’apatite [74]. Dans les faits, dans le cas des phosphates, cette augmentation de la concentration vient de la transformation de phosphates organiques en phosphates inorganiques (résultante de l’hydrolyse d’esters phosphoriques contenus dans le sang sous l’action de certaines enzymes, telle que la phosphatase alcaline [77]–[79]). Dans le cas des ions calcium qui sont principalement extracellulaires, leur acheminement au sein de la vésicule matricielle est supposé être favorisé par des canaux élaborés par des protéines transmembranaires, telles que les annexines [80]. Enfin, suite à l’augmentation de la taille des germes devenus cristaux, les vésicules matricielles vont se dégrader. Ces cristaux seraient ainsi expulsés au sein du fluide extracellulaire, et viendraient finalement se déposer sur la matrice extracellulaire [75].

Mécanismes de nucléation/croissance du minéral osseux

   Le ou les mécanismes de croissance qui permettent aux précurseurs ioniques en solution de s’assembler pour former des cristaux matures d’apatite osseuse sont encore très méconnus. En effet, il n’existe pas de technique permettant d’observer la croissance in situ et in vivo du minéral. Cependant, plutôt qu’une limitation due à la technique, le fait que le renouvellement osseux des mammifères s’effectue de manière global sur l’organe, et non pas au sein d’un lieu spécifique résolu spatialement, est l’obstacle majoritaire qui freine la compréhension des phénomènes de formation du minéral. Dans le paragraphe I-4-3, il a été discuté du fait qu’il est communément proposé que la nucléation des premiers germes d’apatite ait lieu à l’aide d’interactions spécifiques avec certaines PNCs in vivo (ou avec des polyélectrolytes de synthèse in vitro) ; avant une croissance le long de l’axe des fibrilles de collagène, d’abord au sein des zones de gap puis d’overlap des fibrilles de collagène (cf. Figure 21). Enfin, rappelons également que les travaux de W. Landis ont permis de proposer également de la nucléation extra fibrillaire même si ce n’est pas un consensus dans la littérature [126].

Phénomène de maturation du minéral osseux

   Le phénomène de maturation concerne l’évolution que subit une apatite biologique lors de son vieillissement, laquelle correspond à une diminution de la proportion en environnements chimiques non-apatitiques, et au contraire à une augmentation de la proportion en environnements chimiques cristallisés sous forme d’apatite [150], [151]. Afin de mettre en lumière cette évolution naturelle des apatites biologiques, citons les travaux de Nicolas Vandecandelaere, Christian Rey et Christophe Drouet, qui ont mimé expérimentalement cette évolution en introduisant des apatites carbonatées de synthèse en solution aqueuse entre 20 min et 20 jours [154]. En décomposant, puis en intégrant les spectres infrarouge enregistrés à partir des différents échantillons obtenus, ils se sont rendus compte que : (i) la proportion en ions HPO42- (qui composent le domaine non-apatitique désordonné) avait largement tendance à diminuer au cours du temps ; alors que (ii) la proportion en ions OH- (qui composent le domaine apatitique) avait au contraire tendance à fortement augmenter (cf. Figure 25-A). Par ailleurs, cette diminution progressive du taux d’ions HPO42- a également été mise en évidence lors du vieillissement d’apatites osseuses (provenant de fémurs de rats) [63], [140]. Cette tendance rend clairement compte de la transformation progressive du domaine désordonné vers une structure cristalline apatitique plus stable (cf. Figure 25-B) ; ce qui pourrait expliquer le gain substantiel de cristallinité des cristaux d’apatite osseuse au cours du temps (cf. Figure 23).

Table des matières

Introduction Générale
Chapitre I / Le tissu osseux : le collagène, l’apatite, la minéralisation
I-1-1) Généralités, Composition
I-1-2) Organisation multi-échelle
I-2 / Le Collagène
I-2-1) Généralités
I-2-2) Composition
I-2-3) Structure
I-2-4) Formation
I-2-5) Organisation du collagène de type I
I-3 / Le minéral : l’apatite biologique
I-3-1) Généralités
I-3-2) Structure cristalline
I-3-3) Substitutions ioniques
I-3-4) Composition chimique
I-4 / Biominéralisation osseuse
I-4-1) Morphologie des cristaux du minéral osseux
I-4-2) Déposition au sein de la MEC & Organisation 3D du minéral osseux
I-4-2-a) Nucléation homogène au sein des vésicules matricielles
I-4-2-b) Localisation & Organisation 3D
I-4-2-c) Nucléation hétérogène au sein des fibrilles de collagène
I-4-3) Rôles des protéines non-collagéniques
I-4-4) Mécanismes de nucléation/croissance du minéral osseux
I-4-4-a) Nucléation
I-4-4-b) Croissance
I-4-5) Surface des cristaux d’apatite carbonatée
I-4-6) Phénomène de maturation du minéral osseux
I-5 / L’eau
I-6 / Problématiques & Plan du manuscrit
I-6-1) Problématiques
I-6-2) Plan du manuscrit
Références bibliographiques
Chapitre II / Le caractère hydrophile du minéral osseux
Introduction
II-1 / Etat de l’art : Spectroscopie RMN à l’état solide
II-1-1) Caractérisation d’apatites de synthèse et biologique par RMN simple impulsion des noyaux 1H & 31P
II-1-1-a) L’hydroxyapatite
II-1-1-b) Le minéral osseux
II-1-2) RMN CP MAS 1D du noyau 31P
II-1-3) Proposition de l’existence d’un domaine non-apatitique  : RMN 2D 1H-31P
II-2 / Etude de l’os frais : caractère hydrophile du minéral osseux
II-2-1) Os frais
II-2-1-a) RMN simple impulsion des noyaux 1H & 31P
II-2-1-b) Spectre 2D HetCor 1H-31P
II-2-1-c) Dynamique de transfert de polarisation croisée 1H-31P
II-2-1-d) Echange chimique H2O/D2O
II-2-2) Quantification du domaine non apatitique
II-2-3) Conclusion
II-3 / Continuité entre le domaine apatitique et le domaine non-apatitique
II-3-1) Os sec
II-3-2) Mélange physique HA + ACP
II-3-3) Conclusion
II-4 / Propriétés d’hydrophilie de plusieurs phosphates de calcium de référence
II-4-1) Les apatites biomimétiques
II-4-1-a) Caractérisation standard par DRX, MET et ATG
II-4-1-b) Caractérisation par RMN
– RMN simple impulsion 1H & 31P
– RMN 2D 1H-31P
II-4-1-c) Echange d’aimantation 1H-1H par diffusion de spin
II-4-1-d) Quantification du domaine non apatitique
– CHA
– CHA-SBF
II-4-1-e) MET-HR
– Os déprotéiné
– Apatites biomimétiques
II-4-2) Apatite stœchiométrique
II-4-3) Brushite et monétite
II-4-4 / Conclusion & Discussion
Références bibliographiques
Chapitre III / Etude du domaine non-apatitique de surface
Introduction
III-1 / Comparaison avec un phosphate de calcium amorphe
III-1-1) Comparaison par RMN 31P
III-1-2) Comparaison par RMN 1H
III-1-3) Caractère hydrophile de l’ACP
III-1-4) Conclusion & Discussion
III-2/ Etude de la composition chimique du domaine non-apatitique
III-2-1) Etude des ions HPO42-
III-2-2) Etude des ions CO32-
III-2-2-a) Spectroscopie infrarouge
III-2-2-b) RMN 2D 1H-13C
III-2-3) Etude des ions Ca2+
III-3 / Conclusion
Références bibliographiques
Chapitre IV / Organisation 3D des cristaux d’apatite
Introduction
IV-1 / Les techniques utilisées : Cryo-MET & WAXD
IV-1-1) Cryo-MET
IV-1-2) WAXD
IV-2 / Rôle de l’eau à l’interface minéral-minéral
IV-2-1) Comportement de CHA et CHA-SBF en milieu aqueux
IV-2-1-a) Observations par cryo-MET
IV-2-1-b) Analyses par WAXD
IV-2-2) Comportement de HA en milieu aqueux
IV-2-3) Comportement de CHA-aiguilles en milieu aqueux
IV-2-4) Obtention de plaquettes d’apatite dépourvues de domaine non apatitique de surface
IV-2-4-a) Les différents protocoles expérimentaux
IV-2-4-b) Les différentes caractérisations : DRX, MET et RMN
IV-2-5) Comportement de CHA-200 en milieu aqueux
IV-2-5-a) Etude par RMN
IV-2-5-b) Observations par cryo-MET
IV-2-5-c) Analyses par WAXD
IV-2-6) Comportement de CHA sous vide
IV-2-7) Organisation 3D des cristaux d’apatite osseuse
IV-2-7-a) Comparaison avec la structuration de CHA et CHA-SBF dans l’eau
IV-2-7-b) Etude d’un échantillon de minéral osseux extrait chimiquement
– Etude des propriétés d’hydrophilie par RMN
– Observations par MET
– Observations par cryo-MET
– Analyses par WAXD
IV-3 / Mécanisme de formation des agglomérats orientés de plaquettes
IV-4 / Conclusion
Conclusion Générale
Matériels et méthodes
I / Protocoles de synthèse
I-1) L’apatite stœchiométrique HA
I-2) L’apatite biomimétique CHA
I-3) L’apatite biomimétique CHA-SBF
I-4) L’apatite carbonatée CHA-aiguilles
I-5) L’apatite carbonaté CHA-13C
I-6) L’apatite carbonaté CHA-43Ca
I-7) Le phosphate de calcium amorphe
I-8) La brushite
II / Extraction du minéral osseux
III / Retrait du bruit de fond des diffractogrammes WAXD 1D
IV / Appareils utilisés
Références bibliographiques

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