Biologie moléculaire des mélanomes

Biologie moléculaire des mélanomes

Visualisation du produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose 

Principe

 Le contrôle des produits amplifiés se fait par électrophorèse sur gel d’agarose. L’ADN est une macromolécule chargée négativement, de ce fait, elle peut migrer dans un champ électrique de la cathode (-) vers l’anode (+) dans un tampon de migration TAE (TrisAcétate-EDTA).
Les échantillons sont mélangés au bleu de bromophénol, colorant qui possède une masse moléculaire faible et qui permet de détecter le front de migration. Lors de la préparation du gel d’agarose, le BET (Bromure d’éthidium), agent intercalant qui se fixe entre les bases nucléiques à l’intérieur du double hélice, est ajouté. Cette molécule est fluorescente sous UV et permet de détecter les fragments d’acides nucléiques.

Protocol expérimental

Dans un premier temps, le gel d’agarose 2% est préparé. Pour ceci, dans un récipient, 1g de poudre d’agarose et 50 ml de TAE 1X est mélangés, on porte à ébullition puis on ajoute 2 µl de BET. On coule le gel dans le moule à électrophorèse, on y installe un peigne qui sera retiré après refroidissement du gel en laissant à sa place des puits où sera déposé l’ADN. Après refroidissement, on installe le moule dans la cuve qui est remplie du tampon de migration (TAE 1X), on dépose dans chaque puits un mélange de 6 µl de produit PCR et de 2 µl de solution de charge qui a pour rôle de stabiliser l’ADN au fond du puits et la migration est lancée à 100 V.
Finalement, les bandes d’ADN fluorescentes sont visualisées sous UV.

 Réaction de séquence 

Principe

Cette technique comme la PCR, est basée sur la copie d’un fragment d’ADN que l’on désire séquencer par une Taq polymérase. Sauf que dans cette réaction on ajoute en plus des 4 dNTP une faible quantité des 4 ddNTP (didésoxyribonucléotides) dont le groupement OH du carbone 3′ du désoxyribose est remplacé par un atome d’hydrogène de façon à bloquer la réaction d’élongation chaque fois incorporé. Chaque type de ddNTP est marqué par un fluorochrome différent qui servira à la détection des bases au niveau du séquenceur.

Réactifs nécessaires : o Kit de la réaction de séquence ABI®BigDye® Terminator, Kit qui contient principalement:  Taq polymérase ;  dNTP ;  ddNTP marqués ;  tampon ;  MgCL2. o Produit PCR purifié o Amorces spécifiques o Eau stérile.

Protocole expérimental : On prépare dans des tubes eppendorff de 0.2 ml, le mélange illustré dans le tableau 7, soit 2 tubes pour chaque patient. Tableau 7 : Volumes des réactifs du mélange de la réaction de séquence.

Purification du produit de la réaction de séquence :

Principe 
Le kit BigDye® Xterminator™ permet la purification des produits de réaction de séquence. Cette purification consiste à éliminer l’excès des réactifs pour ne pas gainer le séquençage.

Réactifs nécessaires : o Kit « BigDye® XTerminator™ purification Kit » contenant:  SAM™Solution (tampon) ;  BigDye®XTerminator™Solution (résines).

Protocole expérimental 

45µl du produit SAM™Solution et 10 µl du produit BigDye®XTerminator™Solution préalablement vortexés pour suspendre les résines et 10 µl du produit de la réaction de séquençage sont déposés dans les puits de la plaque. La plaque est mise ensuite sous agitation légère pendant 30 min, puis une centrifugation à 1000 tr/min pendant 2 minutes est réalisée. Le surnageant contenant les fragments à séquencer est transféré dans les puits de la plaque du séquenceur. 4. Chargement de l’appareil :La plaque est placée dans le séquenceur , qui est un automate d’électrophorèse capillaire. Ce dernier lance un flux électrique d’ions à travers un capillaire, ce qui entraine la migration des fragments d’ADN. Une fois arrivés au site de détection, les quatre fluorochromes des ddNTP terminaux seront excités. Suite à cette excitation, chaque fluorochrome émettra une lumière à une longueur d’onde différente qui sera détectée puis convertie en séquence par le logiciel d’analyse des séquences.

Table des matières

Présentation de l’établissement
Introduction
Partie1 : revue bibliographique
1. Bases clinique et histologique du mélanome
a) Mélanome
b) Epidémiologie
c) Facteurs de risque
d) Diagnostic clinique
e) Histogenèse du mélanome
2. Biologie moléculaire des mélanomes
a) Généralités
 Cancer
 Mutations
b) Définition médicale du gène BRAF
c) L’apport de la biologie moléculaire dans le diagnostic
Partie 2 : Matériel et méthodes
A. Matériel utilisé
1. Echantillonnage
a) Patients
2. Stratégies de travail
B. Méthode
I. Extraction d’ADN
a) Principe
b) Protocole expérimental
II. Dosage des acides nucléiques
a) Principe
b) Protocole expérimental
III. Amplification de l’ADN extrait par PCR
a) Principe
b) Les acteurs de la PCR
c) La réaction de la PCR
d) Protocole expérimental
IV. Visualisation du produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose
a) Principe
b) Réactifs nécessaires
c) Protocole expérimental
V. Séquençage des produits du gène BRAF
a) Principe
1. Purification de produit PCR
a) Principe
b) Réactifs nécessaires
c) Protocole expérimental
2. Réaction de séquence
a) Principe
b) Réactifs nécessaires
c) Protocole expérimental
3. Purification du produit de la réaction de séquence
a) Principe
b) Réactifs nécessaires
c) Protocol expérimental
4. Chargement de l’appareil
5. Les outils de la bio informatique
Partie 3 : Résultats et discussions
A. Paramètres épidémiologiques
1. Sexe
2. L’âge
3. Phototype
B. Paramètres cliniques
1. Type anatomopathologie
C. Etude moléculaire
1. Dosage et qualité d’ADN extrait
2. Amplification de l’exon 15 du gène BRAF
3. Résultats de séquençage
Conclusion et perspectives
Référence Bibliographique

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