Biologie cellulaire

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Signaux « eat-me » : Reconnaissance de la cellule apoptotique

Une fois à proximité de la cellule apoptotique, le phagocyte doit être capable de la reconnaître et de la distinguer d’une autre cellule vivante. Cette reconnaissance se fait via des signaux appelés « eat-me » que la cellule en apoptose, expose à sa surface et qui sont reconnus par les récepteurs de surface du phagocyte. Parallèlement, la cellule normale dispose de signaux répulsifs nommés « don’t eat-me » qui empêchent son élimination par le phagocyte. Le CD31 et le CD47 sont les candidats « don’t eat-me » les mieux décrits jusqu’à présent (Brown et al., 2002 ; Gardai et al., 2005). Ainsi, l’interaction homotypique entre le CD31 de la surface du neutrophile viable et celui de la surface du phagocyte favorise la dissociation des deux cellules (Brown et al., 2002). En ce qui concerne le CD47, il a été démontré que des érythrocytes déficients en cette molécule injectés chez la souris, sont rapidement éliminés par les macrophages contrairement aux érythrocytes CD47 positifs (Oldenborg et al., 2000). De plus, Gardai et ses collègues ont proposé que le CD47 à la surface des cellules viables est reconnu par la protéine SIRPα (Signal Inhibitory Regulatory Protein α) présente à la surface du phagocyte et que cette reconnaissance bloque l’élimination via l’activation des tyrosines phosphatases inhibitrices (Gardai et al., 2005 ; 2006).
De nombreux signaux « eat-me » sont identifiés à nos jours. Ils incluent le changement du profil de glycosylation des protéines de surface, la modification de la charge de surface, l’expression de la molécule ICAM3 (InterCellular Adhesion Molecule 3) et l’exposition du matériel nucléaire et de certaines protéines intracellulaires comme la calréticuline et l’annexine I (pour revue Hochreiter-Hufford et Ravichandran, 2013 ; Païdassi et al., 2009).
Néanmoins, l’exposition de la phosphatidysérine (PS) résultant de la perte de l’asymétrie de la bicouche lipidique reste la modification la plus connue et étudiée à la surface de la cellule apoptotique (Fadok et al., 1992 ; 1998 ; 2001). Le mécanisme exact de cette exposition commence à être mieux défini et il semble être dépendant des caspases (Nagata et al., 2010). Un modèle proposé suggère que les translocases ATP-dépendantes qui maintiennent la PS dans la couche membranaire interne de la cellule vivante sont inactivées au cours de l’apoptose. En même temps, des scramblases Ca2+-dépendantes sont activées et provoquent la translocation de la PS à la surface cellulaire (Balasubramanian et Schroit, 2003 ; Sahu et al., 2007). La propriété des cellules apoptotiques à exposer la PS à leur surface a été mise à profit dans le test « d’apoptose » à l’annexine V (qui reconnaît la PS) permettant de quantifier et de caractériser l’apoptose au sein d’une population cellulaire (Gardai et al., 2006). Il apparaît aujourd’hui que la PS est l’un des principaux motifs qui conduit à la reconnaissance des cellules apoptotiques par les phagocytes.
La protéine chaperonne calréticuline (CRT) du réticulum endoplasmique (RE) a été classée comme le deuxième ligand de reconnaissance général (après la PS) quand elle est exposée et redistribuée à la surface des cellules apoptotiques. Elle est capable de lier et d’activer le récepteur LRP (LDL Receptor-Related Protein) ou CD91 présent à la membrane du phagocyte. La co-localisation de la CRT avec la PS à la surface des cellules en apoptose suggère que les deux molécules coopèrent ensemble pour stimuler la phagocytose (Gardai et al., 2005). Le rôle de la CRT et son implication dans l’efferocytose seront détaillés dans les paragraphes ultérieurs.
La PS et les autres signaux « eat-me » de surface de la cellule apoptotique sont reconnus par des récepteurs engagés de la surface du phagocyte. Cette reconnaissance se fait soit d’une façon directe, soit d’une façon indirecte à travers des molécules solubles qui vont jouer le rôle de pont entre les deux côtés (Hochreiter-Hufford et Ravichandran, 2013). On peut donc imaginer l’espace entre la cellule apoptotique et le phagocyte comme une synapse où les molécules de surface communiquent directement ou indirectement à travers des intermédiaires. Les récepteurs phagocytaires de la PS exposée à la surface de la cellule apoptotique sont ainsi divisés en deux catégories : i) les récepteurs de liaison directe comme la famille de protéines TIM (TIM4 ; TIM1 et TIM3), BAI1 (Brain Angiogenesis Inhibitor), MFGE8 et ii) ceux qui reconnaissent leur ligand via des molécules pontantes comme Gas6, la protéine S, impliquées dans la liaison de la PS aux récepteurs TAM (Tyro-3-Axl-Mer) présents à la surface des phagocytes (pour revue Ravichandran, 2010). La molécule C1q a été aussi proposée par notre groupe comme capable de ponter la PS à ses récepteurs à la surface du phagocyte (Païdassi et al., 2008). C1q joue plusieurs rôles dans la reconnaissance et l’élimination des cellules en cours d’apoptose. Ces rôles seront développés ultérieurement.

Voies intracellulaires de réorganisation du cytosquelette d’actine du phagocyte

La réorganisation du cytosquelette d’actine du phagocyte est essentielle pour l’internalisation et la phagocytose du corps apoptotique. Des études menées chez le nématode C. elegans ont permis d’identifier deux cascades de signalisation impliquées dans cette étape : CED-1, CED-6, CED-7 et CED-2, CED-5, CED-12. Ces deux voies convergent vers CED-10 qui, une fois activé, conduit au réarrangement du cytosquelette (Kinchen et al., 2005). L’homologue de CED-10 chez les mammifères est la petite protéine G Rac-1 appartenant à la famille des GTPases Rho connues pour leurs fonctions dans la régulation des mouvements cellulaires (Ridley, 2001). Les membres de cette famille fonctionnent comme un commutateur moléculaire dont l’activité, régulée par un facteur d’échange nucléotidique GEF, cycle entre une forme active liée au GTP et une forme inactive liée au GDP (figure 3).
• La voie CED-2, CED-5, CED-12
CED-2, CED-5 et CED-12 correspondent respectivement à CrkII, Dock180 et ELMO chez les mammifères. La molécule adaptatrice CED-2/CrkII s’associe avec CED-5/Dock180, un facteur d’échange nucléotidique pour CED-10/Rac, et cette interaction est régulée positivement par CED 12/ ELMO (Côté et Vuori, 2007). Ce groupe de protéines est impliqué dans divers processus nécessitant le réarrangement du cytosquelette comme l’élimination des cellules apoptotiques, la migration cellulaire, la croissance des neurites et la fusion musculaire (Nagata et al., 2010). Il a été démontré que cette voie est utilisée par plusieurs récepteurs à la surface du phagocyte au cours de l’élimination de la cellule en apoptose. Il s’agit surtout des récepteurs, indirects ou directs, de la PS comme les intégrines αvβ3 et αvβ5, le récepteur Mer et le récepteur BAI1 identifié récemment (Hochreiter-Hufford et Ravichandran, 2013).
• La voie CED-1, CED-6, CED-7
La liaison de la protéine transmembranaire CED-1 à son ligand permet l’activation de cette voie. CED-1 est l’homologue du récepteur CD91 qui a été décrit pour son rôle dans l’élimination des cellules apoptotiques (Ogden et al., 2001). Suite à la reconnaissance de la cellule apoptotique, CED-1/CD91 interagit directement avec l’adaptateur CED-6/GULP, ce qui conduit à la réorganisation du cytosquelette d’actine via l’activation de CED-10/Rac-1 (Su et al., 2002). Le rôle de la protéine de surface CED-7 et de son homologue mammalien ABCA1 (ABC transporter) n’étant pas bien clair dans cette voie, il a été proposé qu’elle peut assister à la reconnaissance des signaux « eat-me » ou fonctionner en aval de CED-1 (Mangahas et Zhou, 2005). L’observation que CD91, à la surface du phagocyte, est un corécepteur avec la CRT pour C1q et les collectines (Vandivier et al., 2002) suggère qu’une activation de cette voie pourrait avoir lieu suite à des interactions avec le système immunitaire inné (Païdassi et al., 2009). Une étude récente renforce cette hypothèse en démontrant que le récepteur «scavenger » SREC-I, un autre orthologue de CED-1 chez les mammifères, participe à l’élimination des cellules apoptotiques via son interaction avec C1q (Ramirez-Ortiz et al., 2013).
Bien que ces deux voies de signalisation soient stimulées par des récepteurs différents, un modèle de coordination entre elles a été proposé. En effet, la Stabiline-2 qui reconnaît la PS et GULP peut aussi interagir directement avec l’intégrine αvβ5 et coordonner les activités des deux voies de signalisation (Kim et al., 2012).
Figure 3. Voies de signalisation impliquées dans l’internalisation des cellules apoptotiques.
La liaison directe ou indirecte des récepteurs à la surface du phagocyte aux signaux exposés à la surface de la cellule apoptotique déclenche deux cascades de signalisation intracellulaires : 1) La voie CrkII, Dock 180, ELMO homologue de CED-2, CED-5, CED-12 chez C. elegans, et 2) La voie CD91, GULP, ABCA1 ou CED-1, CED-6, CED-7 chez C. elegans. La cible de ces deux voies est la GTPase Rac-1 qui, une fois activée, contribue à la réorganisation du cytosquelette d’actine. La stabiline-2 est capable d’orchestrer une coordination entre les deux cascades.

Mécanismes d’internalisation

Les processus mécaniques de l’internalisation ont été décrits comme un mécanisme «zipperlike ». Ce mécanisme se traduit par la réorganisation du réseau d’actine du phagocyte conduisant à la formation des extensions membranaires qui vont entourer la particule visée suffisamment proche, pour constituer ce qu’on appelle «une coupe phagocytaire» (Krysko et al., 2003 ; 2006a). Ensuite, les deux extrémités de la coupe fusionnent ensemble pour encercler exclusivement la cible (sans ingestion de solutés) qui devient intégrée dans une vésicule membranaire fine appelée « le phagosome ». Cette étape est suivie par la dépolymérisation du cytosquelette d’actine résultant de la désactivation de la GTPase Rac-1.
L’activation-désactivation de Rac-1 au cours de ce processus suggère qu’il existe un contrôle spatio-temporel régulé par la disponibilité des ligands à la surface de la cellule apoptotique (Nagata et al., 2010 ; Krysko et al., 2006b).
Néanmoins, d’autres études ont démontré que l’élimination des cellules apoptotiques se fait initialement par un mécanisme de macropinocytose caractérisé par la formation de larges phagosomes, accompagnée de l’ingestion du liquide extracellulaire (Ogden et al., 2001 ; Hoffman et al., 2001 ; Jersmann et al., 2003 ; Xu et al., 2006).
Dans tous les cas, quel que soit le mécanisme d’internalisation, le devenir de la particule ingérée semble être le même. Après la formation de la vésicule membranaire contenant la cellule apoptotique ou phagosome, ce dernier entame une étape de maturation. Il devient fortement acide et fusionne avec les lysosomes pour devenir un «phagolysosome» contenant les enzymes nécessaires à la dégradation de la cellule apoptotique. L’observation qu’un phagocyte est capable d’ingérer plusieurs corps apoptotiques en même temps met en avant l’efficacité et la rapidité de l’efferocytose (Hochreiter-Hufford et Ravichandran, 2013).

Types de phagocytes et réponse anti-inflammatoire

Une grande partie de notre compréhension de la phagocytose des cellules apoptotiques vient des études de l’élimination des neutrophiles apoptotiques durant la résolution de l’inflammation. En effet, les neutrophiles qui ont massivement migré au site de l’inflammation ou de l’infection, doivent être efficacement « nettoyés » pour permettre la restauration du tissu à son état d’origine. Les neutrophiles recrutés, ayant une courte durée de vie, empruntent la voie d’apoptose et sont par la suite éliminés par les phagocytes (Savill et al., 1989). Cette élimination rapide et efficace est accompagnée de la suppression de la sécrétion des molécules pro-inflammatoires comme le TNFα et la stimulation de la sécrétion des cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et TGFβ, par les macrophages (Kennedy et Deleo, 2009). Ainsi, la phagocytose des neutrophiles apoptotiques au cours de la réponse inflammatoire contribue à l’homéostasie tissulaire (Witko-Sarsat et al., 2011). Comme pour le cas de l’élimination des neutrophiles apoptotiques, le processus d’efferocytose est, en général, immunologiquement silencieux grâce aux réponses antiinflammatoires et immunosuppressives élaborées par les différents types de phagocytes décrits dans les paragraphes qui suivent.

Phagocytes professionnels

? Les macrophages

Les macrophages sont des phagocytes professionnels capables de contrôler et de moduler leurs activités en fonction des signaux reçus de leur environnement. Ainsi, la réponse d’un macrophage est généralement inflammatoire face à un pathogène tandis qu’elle est antiinflammatoire face à une cellule apoptotique.
Plusieurs études ont décrit et expliqué les effets anti-inflammatoires et aussi immunosuppressifs de la phagocytose des cellules apoptotiques par les macrophages. Il a été démontré, d’une façon intéressante, que la phagocytose des cellules apoptotiques stimule la sécrétion des cytokines anti-inflammatoires comme le TGFβ, l’IL-10, le PAF (Platlet-Activating-Factor) et la prostaglandine E2 par les macrophages (Chung et al., 2007 ; Voll et al., 1997). Les cellules apoptotiques participent, elles mêmes, aussi à la création de cet environnement anti-inflammatoire en sécrétant du TGFβ (Chen et al., 2001) et de l’IL-10 (Gao et al., 1998). En parallèle, la production des cytokines pro-inflammatoires comme l’IL- 12 et le TNFα par les macrophages est bloquée suite à l’inhibition de l’activation de la voie NF-κB (Kim et al., 2004 ; Perruche et al., 2009). Une étude récente effectuée in vivo soulève le rôle joué par le récepteur nucléaire Nr4a1, dont l’expression est induite d’une manière PSdépendante par les cellules apoptotiques, dans l’inhibition de la voie NF-κB et la sécrétion de l’IL-12 par les macrophages (Ipseiz et al., 2014).
Il a été reporté d’une manière intéressante que le contact cellule-cellule peut être suffisant pour provoquer la réponse cytokinique des macrophages car l’internalisation du corps apoptotique n’est pas requise pour stimuler cette réponse (Hochreiter-Hufford et Ravichandran, 2013). En effet, les membranes des cellules apoptotiques seules sont suffisantes pour empêcher la sécrétion de l’IL-12 par des macrophages activés au LPS (Kim et al., 2004). De même, des vésicules de PS peuvent, seules, stimuler la sécrétion de TGFβ par les macrophages (Huynh et al., 2002).
Toutefois, une réponse macrophagique neutre, ni pro-inflammatoire ni anti-inflammatoire, a été proposée essentiellement lorsque ce sont des cellules en apoptose très précoces qui sont phagocytées (Kurosaka et al., 2003).

? Les cellules dendritiques

Les cellules dendritiques sont des phagocytes hautement spécialisés capables d’initier une réponse immunitaire adaptative suite à la présentation de leurs antigènes aux lymphocytes T. Les mécanismes d’élimination des cellules apoptotiques par les cellules dendritiques impliquent le récepteur « scavenger» CD36 et les intégrines αν, mécanismes similaires à ceux décrits pour les macrophages (Albert et al., 1998a). Cependant, la réponse des cellules dendritiques à l’élimination  des corps apoptotiques est spécifique. Albert et ses collègues ont publié en 1998 une série d’études particulièrement intéressantes sur ce sujet. Ils ont démontré que les cellules dendritiques génèrent, à partir du matériel apoptotique internalisé, des peptides épitopes pour les molécules du CMH I (Complexe Majeur d’Histocompatibilité) et sont ainsi capables d’activer une réponse des lymphocytes T CD8+ (Albert et al., 1998a ; 1998b). Comme conséquence, les cellules T CD8+ peuvent orchestrer une réponse cytotoxique primaire accompagnée par l’expression du récepteur de mort TRAIL qui tue les lymphocytes T CD4+ et favorise ainsi la tolérance (Garg et al., 2014). Les cellules apoptotiques peuvent pré-sélectionner les déterminants antigéniques importants pour favoriser leur présentation par les cellules dendritiques (Blachère et al., 2005). En plus, la phagocytose des cellules apoptotiques empêche activement la maturation des cellules dendritiques (Green et al., 2009) et affecte directement leur phénotype en diminuant l’expression des cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-12 et des molécules de costimulation comme CD40 ; CD80 et CD86 (Stuart et al., 2002 ; Morelli et al., 2003). Des sous-populations de cellules dendritiques sont capables d’internaliser les cellules apoptotiques. Un exemple est celui d’une sous-population de cellules dendritiques qui capture en continu les cellules épithéliales apoptotiques de l’intestin régulièrement éliminées après la desquamation. Les cellules dendritiques migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques mésentériques où elles peuvent inactiver les cellules T naïves auto-réactives (Huang et al., 2000).

Table des matières

I. INTRODUCTION
I.1 Apoptose et efferocytose
I.1.1 Apoptose
I.1.1.1 Voies d’activation de l’apoptose
I.1.1.2 Rôles physiologique et pathologique de l’apoptose
I.1.2 Phagocytose des cellules apoptotiques
I.1.2.1 Signaux « find-me » : Recrutement des phagocytes
I.1.2.2 Signaux « eat-me » : Reconnaissance de la cellule apoptotique
I.1.2.3 Voies intracellulaires de réorganisation du cytosquelette d’actine du phagocyte
I.1.2.4 Mécanismes d’internalisation
I.1.2.5 Types de phagocytes et réponse anti-inflammatoire
I.1.2.5.a Phagocytes professionnels
I.1.2.5.b Phagocytes non professionnels
I.1.2.6 Autres conséquences de la phagocytose des cellules apoptotiques
I.2 C1q
I.2.1 Structure du C1q
I.2.2 Fonctions immunologiques du C1q
I.2.2.1 C1q active la voie classique du complément
I.2.2.2 C1q contribue à l’efferocytose
I.2.2.3 Interactions de C1q et activation du complément
I.3 Calréticuline
I.3.1 Structure de la CRT
I.3.2 Modifications post-traductionnelles de la CRT
I.3.3 Fonctions de la CRT
I.3.3.1 Chaperonne/Contrôle-Qualité
I.3.3.2 Rôle de la CRT dans l’apoptose et la phagocytose
I.3.3.3 Immunogénicité de la CRT de surface
I.3.3.4 Effet immunomoduleur de la CRT soluble
I.3.3.5 Mécanismes de translocation de la CRT à la surface cellulaire
I.4 Projet de thèse
I.4.1 Résultats à la base du projet
I.4.2 Objectifs de mon travail de thèse
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 Biologie cellulaire
II.1.1 Lignées et culture cellulaire
II.1.2 Induction de l’apoptose
II.1.3 Transfection des cellules
II.2 Analyses de la fluorescence
II.2.1 Marquage par des protéines fluorescentes
II.2.2 Marquage par immunofluorescence
II.2.3 Analyse par cytométrie en flux
II.2.4 Analyse par microscopie
II.3 Analyses fonctionnelles
II.3.1 Analyse de l’apoptose
II.3.2 Tests de phagocytose
II.3.2.1 Phagocytose des cellules apoptotiques
II.3.2.2 Phagocytose des billes
II.3.3 Test de migration
II.3.4 Test de prolifération
II.4 Analyses biochimiques
II.4.1 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
II.4.2 Techniques de transfert sur membrane
II.4.3 Préparation des protéines d’intérêt
II.4.3.1 Préparation des protéines cellulaires
II.4.3.2 Purification du C1q plasmatique et de ses têtes globulaires
II.4.3.3 Purification de la calréticuline recombinante
II.4.3.4 Détermination de la concentration des protéines purifiées
II.5 Analyse des interactions protéiques
II.5.1 Mesure de FRET
II.5.2 Analyse par overlay
II.6 Analyse statistique
III. RESULTATS
III.1 Temps précoce d’apoptose
III.1.1 Modèle cellulaire et inducteur d’apoptose
III.1.2 Comparaison de l’exposition membranaire de la CRT et de la PS
III.1.3 Fixation de C1q
III.1.4 Co-localisation entre CRT et C1q
III.1.5 Etude par FRET de l’interaction entre CRT et C1q
III.1.5.1 Mise au point du protocole
III.1.5.2 Détection de l’interaction CRT/C1q
III.1.6 Effet de C1q sur la phagocytose
III.1.6.1 Optimisation du test de phagocytose
III.1.6.2 Effet de C1q sur la phagocytose des cellules pré-apoptotiques
III.1.6.3 Effet de la diminution de l’expression de la CRT endogène
III.1.7 Conclusion
III.2 Calréticuline extracellulaire
III.2.1 Les cellules apoptotiques précoces relarguent leur CRT
III.2.2 Effets de la CRT extracellulaire sur la biologie des phagocytes
III.2.2.1 La fonction de phagocytose
III.2.2.1.a La capacité d’induire la phagocytose des billes
III.2.2.1.b La capacité d’induire la phagocytose des cellules apoptotiques
III.2.2.2 La morphologie
III.2.2.3 La migration
III.2.2.4 La différenciation
III.2.2.5 La différenciation des monocytes
III.2.2.6 La prolifération des monocytes
III.2.3 Conclusion
III.3 Fixation et internalisation de la CRT exogène par les phagocytes
III.3.1 Analyse de la CRT des macrophages incubés avec des surnageants des cellules apoptotiques
III.3.2 Fixation de la CRT recombinante sur les macrophages
III.3.3 Internalisation de la CRT exogène par les macrophages
III.3.4 Conclusion
IV. DISCUSSION ET PERSPECTIVES
IV.1 L’exposition en surface de la calréticuline est un signal « pré-apoptotique »
IV.2 C1q favorise la phagocytose des cellules pré-apoptotiques via son interaction précoce avec la calréticuline
IV.3 La calréticuline est relarguée par les cellules apoptotiques
IV.4 La calréticuline extracellulaire module les fonctions du macrophage
IV.5 La calréticuline interagit avec le macrophage
IV.5.1 A la recherche des partenaires de surface
IV.5.2 Endocytose par maropinocytose
IV.5.3 Mot de la fin
ANNEXE
REFERENCES

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