Soutenance mémoire
Structure du gène codant pour le RM
Le RM appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires, et plus précisément à la famille des récepteurs stéroïdiens (dont font partie également le récepteur aux androgènes, le récepteur glucocorticoïde (RG), le récepteur aux œstrogènes et le récepteur à la progestérone). Il agit comme un facteur de transcription dépendant des ligands. Le gène NR3C2 (pour Nuclear Receptor sub-family 3 group C member 2) codant pour le RM, est situé sur le chromosome 4 chez l’homme . D’une taille approximative de 450 kilobases, il est composé de dix exons séparés les uns des autres par huit introns. Les deux premiers exons 1 et 1 sont non-codants, les huit autres codent pour une protéine de 984 acides aminés. Ce gène est également retrouvé chez le rat et la souris, et sa structure est très conservée. Situé sur le chromosome 19 chez le rat, NR3C2 possède trois premiers exons non-codants (1, 1 et 1) et code pour une protéine de 981 acides aminés11. Chez la souris, celui-ci est situé sur le chromosome 8 et code une protéine de 978 acides aminés. Une étude a montré que l’expression du gène codant pour le RM humain (RMh) est contrôlée par deux promoteurs alternatifs, menant à la synthèse d’une même protéine dans la mesure où le codon d’initiation de la traduction est situé dans le deuxième exon. P1 permet la transcription de l’exon 1 et P2 celle de l’exon 1, générant alternativement deux isoformes d’acides ribonucléiques messagers13 (ARNm). Cette même étude indique que ces deux promoteurs sont soumis à des régulations hormonales distinctes. Bien que tous les deux soient sensibles aux glucocorticoïdes, seul P2 répond aux minéralocorticoïdes. Outre cette différence, P1 et P2 ont également des spécificités tissulaires bien distinctes. Alors que P1 est actif dans tous les tissus où le RM s’exprime, l’activité de P2 est 10 fois moins importante que celle de P1 et peut parfois être nulle comme dans le cerveau14. Des mutations du gène codant pour le RM ont également été décrites, notamment chez les patients atteints de pseudohypoaldostéronisme de type I. Ces derniers, qui montrent une résistance aux minéralocorticoïdes se définissant par une concentration plasmatique en potassium élevée (hyperkaliémie), une concentration plasmatique en aldostérone élevée (aldostéronémie) et une concentration plasmatique en sodium faible, peuvent présenter des mutations du gène codant pour le RM. Une dizaine de mutations ont été identifiées, particulièrement dans la région codant pour le domaine de liaison du ligand hormonal, donnant une protéine avec une activité transcriptionnelle diminuée par rapport aux sujets sains
Structure du RM
Comme tous les autres récepteurs nucléaires, le RM est organisé selon plusieurs domaines qui se distinguent en termes de structure et de fonction. Ces domaines sont regroupés selon trois régions principales, définies de l’extrémité N-terminale à l’extrémité Cterminale de la manière suivante :
– la région N-terminale contenant les domaines de régulation de l’activité transcriptionnelle
– la région centrale qui est constituée du domaine de liaison à l’acide désoxyribonucléique (ADN ; DLA)
– la région C-terminale contenant le domaine de liaison du ligand hormonal (DLL). Ces différents domaines vont permettre au RM d’agir comme un facteur de transcription dépendant des ligands; tout d’abord par sa liaison à son ligand, puis par sa liaison au gène cible et enfin par sa liaison aux corégulateurs de son activité. Plusieurs motifs s’ajoutent aux différents domaines pour réguler la fonction du RM. Dans la région Nterminale, contenant les domaines de régulation de l’activité transcriptionnelle du RM (AF-1a et AF-1b, pour Activation Function 1a et 1b) , un signal de localisation nucléaire (SLN) est inclus dans le domaine AF-1b. Des SLN sont également présents dans le DLA et le DLL. Le DLA est constitué de deux motifs en doigts de zinc, nécessaires à la liaison du RM à ses éléments de réponse hormonale au niveau de l’ADN ainsi qu’à sa dimérisation26. Il possède également un motif de signalisation d’export nucléaire (SEN). Au niveau du DLL, il a été montré que des protéines de choc thermique (HSP, pour Heat Shock Protein), y interagissent. Ces HSP permettent de maintenir le RM dans une conformation permettant sa liaison avec son ligand hormonal tout en masquant le SLN situé dans ce domaine. Un domaine de régulation de l’activité transcriptionnelle du RM AF-2 y est également présent.
Hormones glucocorticoïdes
Les hormones glucocorticoïdes sont les hormones stéroïdes majeures de l’organisme et possèdent des propriétés anti-inflammatoires. A l’instar de l’aldostérone, elles sont synthétisées à partir du cholestérol, dans la zone fasciculaire et réticulaire du cortex surrénalien. Elles sont principalement représentées par le cortisol chez l’homme et la corticostérone chez les rongeurs. Les glucocorticoïdes se lient à leur récepteur spécifique le RG, exprimé de manière ubiquitaire dans l’organisme. Ils peuvent également induire des voies de signalisation différentes à travers leur fixation au RM. Cette propriété du RM à lier ces deux hormones doit être prise en compte dans la compréhension de la signalisation minéralocorticoïde. Plusieurs travaux se sont intéressés à l’effet des glucocorticoïdes sur le complexe aldostérone/RM dans le cœur. Des rats soumis à une surcharge minéralocorticoïde présentent au niveau du cœur une augmentation de la fibrose ainsi que des niveaux d’expression de marqueurs d’inflammation (comme la cyclo-oxygénase-2 ou l’ostéopontine) et de stress oxydatif (comme les sous-unités gp91phox et p22phox de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase sous forme réduite ou NADPH oxydase, pour nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase). Quatre semaines après l’arrêt de la stimulation minéralocorticoïde les augmentations des niveaux d’expression des marqueurs cités ci-dessus sont toujours observées, suggérant un effet minéralocorticoïde dépendant des glucocorticoïdes, majoritaires dans le plasma par rapport à l’aldostérone. Une autre étude, découlant de la précédente, a montré que l’augmentation des niveaux d’expression de marqueurs d’inflammation et de stress oxydatif est prévenue par le blocage du RM, et non pas du RG, et que l’action des glucocorticoïdes sur le RM semble dépendre du stress oxydatif environnant. La compilation de ces résultats démontre les multiples signalisations possibles induites par le RM au regard de sa liaison avec l’un ou l’autre de ces corticostéroïdes. La suite de cette introduction se propose de montrer la complexité de la signalisation minéralocorticoïde cardiaque selon son activation par l’aldostérone ou par les glucocorticoïdes.
Etude de la signalisation cardiaque du RM in vitro
Toutes ces études ci-dessus résumées concernent la signalisation du RM cardiaque in vivo. Cette approche intégrée rend difficile la compréhension des mécanismes moléculaires spécifiques mis en jeu lors de la fixation du ligand au RM du cardiomyocyte. C’est pourquoi de nombreux travaux se sont intéressés à l’exploration de la signalisation induite par le complexe aldostérone/RM avec l’approche cellulaire. L’aldostérone dans des cultures primaires de cardiomyocytes de rats adultes induit une augmentation du niveau d’expression des MMP-2 et MMP-9 dépendant des espèces réactives de l’oxygène. En effet, l’inhibition de la NADPH oxydase prévient totalement l’effet de l’aldostérone sur les MMP-2 et MMP-9 cardiomyocytaires. Cependant, cette étude a été réalisée avec des doses d’aldostérone plus de 100 fois supérieures aux doses physiologiques, remettant en question la pertinence des résultats. Néanmoins une étude du remodelage cardiaque lors du vieillissement physiologique réalisée sur des rats jeunes (2 mois) ou adultes (8 ou 30 mois) non traités, semble confirmer in vivo les études in vitro167. Une corrélation est observée entre l’âge et l’augmentation de la NADPH oxydase, de la MMP-2 et de l’aldostéronémie168. L’étude du transcriptome total de cardiomyocytes a également permis d’identifier des gènes directement et spécifiquement régulés par l’aldostérone68. L’ensemble des ARNs de cellules H9C2-RM+ traitées avec de l’aldostérone à 1 nM a été comparé à celui de cellules non traitées. Plusieurs gènes ont été identifiés comme spécifiquement régulés par l’aldostérone parmi lesquels des gènes impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire comme Tenascin-X, A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 (Adamts1) et PAI-1. Sont aussi modulés positivement des gènes impliqués dans la régulation du tonus vasculaire comme le Regulator of G-protein signalling-2 (Rgs-2) ou encore des gènes impliqués dans les phénomènes inflammatoires comme Orosomucoid-1.
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Table des matières
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES ILLUSTRATIONS
PRODUCTIONS SCIENTIFIQUES
AVANT-PROPOS
PARTIE 1 : INTRODUCTION
1.1 Les pathologies cardiovasculaires
1.2 Le récepteur minéralocorticoïde
1.2.1 Structure du gène codant pour le RM
1.2.2 Structure du RM
1.2.3 Ligands du RM
1.2.3.1 Hormone minéralocorticoïde aldostérone
1.2.3.2 Hormones glucocorticoïdes
1.2.3.3 Sélectivité de liaison de l’aldostérone au RM
1.2.3.3.1 Sélectivité enzymatique : 11-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2
1.2.3.3.2 Autres mécanismes de sélectivité de l’aldostérone au RM
1.3 Bénéfices de l’inhibition du récepteur minéralocorticoïde en clinique
1.3.1 Antagonistes pharmacologiques du RM
1.3.2 Effets de l’antagonisme du RM dans l’hypertension
1.3.3 Effets de l’antagonisme du RM dans l’insuffisance cardiaque
1.3.3.1 Phénomène d’échappement de l’aldostérone
1.3.3.2 Etude RALES
1.3.3.3 Etude EPHESUS
1.3.3.4 Autres études
1.3.4 Effets de l’antagonisme du RM sur l’infarctus du myocarde
1.3.5 Effets de l’antagonisme du RM dans les troubles du rythme cardiaque
1.3.6 Emergence d’antagonistes non-stéroïdiens
1.4 Mécanismes d’action du RM
1.4.1 Effets non génomiques du RM
1.4.2 Effets génomiques du RM
1.5 Rôle physiopathologique du RM dans le cœur et le rein
1.5.1 Effets génomiques classiques du RM dans l’épithélium rénal
1.5.2 Effets génomiques du RM cardiaque
1.5.2.1 Blocage pharmacologique du RM in vivo
1.5.2.2 Implication du RM dans les pathologies cardiaques
1.5.2.3 Etude de la signalisation cardiaque du RM in vitro
1.5.2.4 L’apport des modèles transgéniques dans la compréhension de la signalisation du RM
1.5.2.5 Rôle du RM dans les arythmies cardiaques
1.5.2.5.1 Effets du RM sur les arythmies cardiaques en clinique
1.5.2.5.2 Effets du RM sur les arythmies cardiaques chez l’animal
1.6 Objectifs de la thèse
PARTIE 2 : MATERIELS ET METHODES
2.1 Modèles animaux
2.1.1 Surexpression conditionnelle du RM spécifiquement dans les cardiomyocytes
2.1.2 Protocoles
2.1.2.1 Effet de l’infusion d’aldostérone sur les souris RM-Cardio
2.1.2.1.1 Administration du traitement
2.1.2.1.2 Préparation du cœur
2.1.2.1.3 Extraction des ARNs totaux, réalisation et analyse du transcriptome
2.1.2.2 Etude des microARNs comme cibles potentielles du RM
2.1.2.2.1 Extraction des microARNs totaux, et réalisation du miRnome
2.1.2.2.2 Analyse du miRnome
2.1.2.2.3 Rétrotranscription et PCR quantitative des microARNs cibles
2.1.2.3 Effets du torasémide in vivo
2.1.2.3.1 Modèle pharmacologique DOCA-Sel d’excès de minéralocorticoïde
2.1.2.3.2 Extraction des ARNs totaux et rétrotranscription
2.1.2.3.3 PCR quantitative
2.2 Modèles cellulaires
2.2.1 Lignées cellulaires
2.2.1.1 Lignée cellulaire H9C2-RM+
2.2.1.2 Lignée cellulaire H9C2-RM+/MMTV-Luciférase
2.3 Analyses statistiques
PARTIE 3 : RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.1 Approche pharmacologique
3.1.1 Effets in vitro du torasémide sur la signalisation du RM cardiaque
3.1.1.1 Etat de la question
3.1.1.2 Objectif de l’étude
3.1.1.3 Article: The Diuretic Torasemide Does Not Prevent Aldosterone Mediated Mineralocorticoid Receptor Activation in Cardiomyocytes
3.1.1.4 Conclusions de l’étude et discussion
3.1.2 Effets in vivo du torasémide sur la signalisation du RM cardiaque
3.1.2.1 Etat de la question
3.1.2.2 Objectif de l’étude
3.1.2.3 Protocole d’activation du RM in vivo
3.1.2.4 Le torasémide diminue l’expression de certains gènes participant au remodelage de la matrice extracellulaire cardiaque
3.1.2.5 Le torasémide n’intervient pas dans la modulation de l’expression des sousunités de la NADPH oxydase
3.1.2.6 Conclusions de l’étude et discussion
3.2 Approche génétique
3.2.1 CTGF comme gène candidat de premier choix dans la compréhension de la voie de signalisation du RM cardiaque
3.2.1.1 Etat de la question
3.2.1.2 Objectif de l’étude
3.2.1.3 Article: Aldosterone-Specific Activation of Cardiomyocyte Mineralocorticoid Receptor In Vivo
3.2.1.4 Conclusions de l’étude et discussion
3.2.2 Etude transcriptomique cardiaque globale
3.2.2.1 Etat de la question
3.2.2.2 Objectif de l’étude
3.2.2.3 Article : Aldosterone Promotes Cardiac Endothelial Cells Proliferation In Vivo
3.2.2.4 Conclusions de l’étude et discussion
3.2.2.5 Implication du RM dans la prolifération des cellules endothéliales cardiaques induite par l’aldostérone
3.2.3 Implications des microARNs dans la voie de signalisation du RM cardiaque
3.2.3.1 Etat de la question
3.2.3.2 Objectif de l’étude
3.2.3.3 Comparaison du miRnome des souris RM-Cardio par rapport à celui de leurs contrôles
3.2.3.4 Pertinence physiopathologique de la modulation du miR-1941-5p par le RM cardiaque
3.2.3.5 Conclusions de l’étude et discussion
PARTIE 4 : DISCUSSION GENERALE
4.1 Comparaison entre torasémide et spironolactone
4.2 Cibles moléculaires du RM dans le cœur
4.2.1 CTGF
4.2.2 Aldostérone et prolifération
4.2.3 MicroARNs
PARTIE 5 : PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
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