Bases biologiques importantes pour le diagnostic de l’infection à VIH

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Bases biologiques importantes pour le diagnostic de l’infection à VIH 2.1.-Sructure

Les VIH sont des virus enveloppés de forme plus ou moins sphérique avec 80 à 120 nm de diamètre, entourés par une enveloppe faite de bicouche lipidique à la surface de laquelle sont insérées des spicules [4].
L’enveloppe est limitée à l’intérieur par une membrane de 5 – 6 nm d’épaisseur servant de pont entre le nucléocapside et les glycoprotéines de l’enveloppe (gp41 et gp120).
Au cœur de la forme sphérique se trouve le core (p24) recouvert d’une couche protéique. Entre l’enveloppe et le core se trouve les cores latéraux (figure 1)

Organisation génétique [4]

Le génome des VIH (figure 2) est composé de l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’ des gènes caractéristiques des rétrovirus gag, pol et env :
► Le gène gag (Group Antigen) code la synthèse d’une polyprotéine (précurseur) clivée en trois protéines que sont : p17/18, p24/25, p13/15 ;
► Le gène pol (polymérase) code pour les différentes enzymes virales : p10 (protéase) p64/67 et p51/53 (transcriptase inverse) ; p34 (endonucléase/ intégrase).
► Le gène env (enveloppe) code pour deux glycoprotéines de l’enveloppe : la gp110/120 (glycoprotéine externe) et la gp41 (glycoprotéine transmembranaire).
Le génome des VIH possède en plus des trois gènes habituels des rétrovirus, six gènes supplémentaires appelés gènes accessoires vif, vpr nef, vpu, tat, et rev : ce sont des gènes régulateurs.
Le virus VIH-1 possède un gène dénommé le vpu qui n’existe pas dans le génome du VIH-2 à l’inverse, seul le virus VIH-2 possède un gène vpx, les génomes de VIH-1 et VIH-2 partagent entre eux globalement 42% d’homologie. Cette homologie est plus importante au niveau des gènes gag et pol qu’au niveau des gènes env.

Variabilité génétique [6, 17, 19, 20, 29, 36, 37, 45]

La rétrotranscription, permettant le passage de l’ARN viral en ADN proviral, est responsable de la grande variabilité génétique du VIH.
Le VIH-1 est plus répandu dans le monde alors que le VIH-2 a une localisation restreinte, en majorité en Afrique de l’ouest.
L’analyse, même grossière des génomes de VIH par profil de restriction montre d’importantes différences génomiques d’un isolat à l’autre. Le degré de divergence entre les deux virus VIH-1 et VIH-2 atteint plus de 50%, chaque type de virus est lui-même représenté par des virus génétiquement éloignés. Ainsi le VIH-1 est divisé en trois groupes de virus : les virus du groupe M (majeur), les VIH-1 groupe O (outher) identifié au Cameroun et le groupe N (Non M non O) identifié en 1998. Les VIH-1 du groupe M sont eux-mêmes représentés par différents sous types désignés par des lettres allant de A à K. Le sous type VIH-2 est divisé en 8 groupes désignés de A à H, le sous type A est endémique en Afrique de l’ouest et le B en Côte d’ivoire et au Mali. Les 6 sous types mineurs, C à H sont endémiques au Liberia, Sierra Léone et au Côte d’ivoire et sont hautement divergents par rapport aux sous types A et B (supérieur à 25% dans les gènes gag et env).
Le VIH-1 peut être pur (un seul sous-type) ou recombinant provenant de la rétrotranscription de leur génome dans une cellule co-infectée par deux sous types différents. D’autres mécanismes sont également responsables, parmi ceux-ci, les pressions de sélection exercées par des contrôles de la réplication de certaines formes virales chez l’hôte sont à prendre en considération.
La classification génétique constitue un outil important pour la surveillance épidémiologique des infections à VIH dans le monde. Cette surveillance essentielle, permet la réactualisation de méthodes fiables en matière de diagnostic.
L’impact de ces différents groupes, sous-types et formes recombinantes du VIH-1 sur la transmission et la progression de la maladie, reste inconnu. Il est probable que l’importance de la diversité génétique entre les sous types soit
plus suffisante pour causer les différences, mais leur mise en évidence pose des problèmes méthodologiques importants. C’est ainsi que les VIH-1 du groupe O ont été initialement identifiés parce qu’ils n’avaient pas été détectés par certains tests sérologiques commerciaux. Ces sérums du groupe O peuvent donner des résultats indéterminés avec des tests de confirmation habituels tel que le Western- blot.
Actuellement, la majorité des tests commerciaux sont capables de détecter les anticorps anti-groupes, soit par l’intermédiaire de la réactivité croisée des antigènes spécifiques du groupe M, soit par l’addition des antigènes spécifiques du groupe O. Cependant une surveillance continue est nécessaire, puisque des changements subtils dans la structure antigénique de certains variants des VIH peuvent affecter la sensibilité des tests.
Pendant la séroconversion, une plus faible sensibilité est observée pour la détection des infections dues aux sous-types non B en utilisant les tests de dépistage basés sur les antigènes de ce sous-type.
La diversité génétique a également des conséquences sur la mesure de la charge virale chez les patients infectés par les souches VIH non B. Les trousses disponibles ne peuvent pas détecter et quantifier les VIH-1 du groupe O ou les souches du VIH-2.
Compte tenu de la grande diversité des souches du VIH-1, ces tests nécessitent une mise à jour continue afin d’évaluer l’efficacité des amorces et des sondes utilisées.

Bases immunologiques de l’infection à VIH

Cinétique d’apparition des anticorps [9]

Un sujet qui présente des anticorps anti-VIH est séropositif ce qui signifie qu’il a été en contact avec le virus. Ceci ne préjuge nullement pas de son état clinique, par contre, il doit être considéré comme porteur de virus et donc potentiellement infectieux.
La séroconversion intervient 3 à 6 semaines au plutôt et 4 à 14 mois au plus tard après le contage. Cette période de latence semble être fonction de la quantité d’inoculum et de la voie de transmission. Elle est plus longue par transmission sexuelle que par transfusion.
Les anticorps anti-gp160 et anti-p24 sont les premiers anticorps à apparaître au cours de la séroconversion ; les anticorps anti-p64, anti-p52 et anti-p18 apparaissent ensuite ; l’anticorps anti-gp41 en dernier. De taux faible au moment de leur apparition, ces anticorps atteignent rapidement (en 3 à 4 semaines) des concentrations très élevées qui persisteront souvent longtemps au cours de l’infection.
Comme pour tous les rétrovirus à enveloppe, les structures virales les plus immunogènes sont associées aux glycoprotéines d’enveloppe (gp160, gp120, gp41).
La prévalence des anticorps anti-enveloppes est à 97% de l’ensemble des séropositifs à tous les stades de l’infection, tandis que celle des anticorps dirigés contre les protéines de core (p24) n’atteint que 40% dans les SIDA confirmés. En effet, chez un grand nombre de sujets, le taux des anticorps anti-p24 diminue, puis disparaît au moment de l’installation de signes cliniques et de l’apparition de l’antigène (figure 3).
Les anticorps mis en évidence avec les techniques Western-blot, ELISA et les tests rapides (dans lesquelles on utilise un anticorps humain marqué)
sont de classe IgG alors que ceux décelés par les techniques de compétition appartiennent aux classes IgG, IgA et IgM.
L’intérêt du dosage des IgM, comme preuve d’infection récente est mal connu, même chez le nouveau-né.
La cinétique d’apparition des anticorps anti-VIH montre l’existence d’une fenêtre sérologique d’environ 1 mois pendant laquelle le sujet est séronégatif en test ELISA, Western-blot et les tests rapides.

Techniques de diagnostic biologique de l’infection à VIH

Techniques indirectes

Test de dépistage du VIH [34]

Les échantillons de sérum ou de plasma sont dépistés à l’aide de test immuno-enzymatique tels que l’ELISA, les tests rapides ou les tests simples.

Les tests ELISA

Les ELISA sont très utiles sachant qu’ils sont relativement bon marché, standardisés, hautement reproductibles, sensibles et offrent la possibilité de tester un grand nombre d’échantillons simultanément. Il en existe quatre catégories :
– les ELISA de première génération utilisant comme antigènes des virus entiers obtenus par culture de VIH dans des cellules.
– les ELISA de deuxième génération utilisant des protéines recombinantes ou des peptides synthétiques pour une meilleure spécificité.
– les ELISA de troisième génération sont basés sur la méthode de sandwich.
– les ELISA de quatrième génération combinant la détection des anticorps du VIH et l’antigène p24.

Les tests rapides/simples [34]

Les tests rapides et les simples ne nécessitent pas un appareillage sophistiqué.
– Les tests rapides
Les tests rapides sont basés sur des techniques d’immuno-filtration, immuno-chromatographique ou de dot-blot et peuvent généralement, être réalisés en moins de 30 minutes.
Ces utilisent comme antigènes utilisent des protéines recombinantes ou des peptides synthétiques absorbées sur une membrane.
Pour certains tests, il est nécessaire de faire des dilutions de sérums, pour d’autres, le sérum est testé tel quel.
Pour certains tests, il est possible d’utiliser des échantillons de sang total, de plasma, de sérums ou de la salive.
Les tests rapides s’effectuent rapidement sans équipement particulier et certains d’entre eux sont discriminatifs.
– Les tests simples
Ils sont souvent basés sur des réactions d’agglutination. Ils peuvent être réalisés sans équipement particulier mais nécessitent un délai de réalisation de plus de 30 minutes. La phase solide peut être des globules rouges ; des particules de latex ou de la gélatine.
Les tests simples sont moins chers que les tests rapides.

Les tests de confirmation [4, 9, 11, 34]

Le test de confirmation doit normalement s’effectuer, quelle que soit la technique de dépistage utilisée, sur un prélèvement différent de celui ayant servi au dépistage de préférence si ce dernier est positif.
La plupart des algorithmes de diagnostic exigent l’utilisation de tests très spécifiques tels que le western blot, le test d’immunofluorescence indirecte, le test de radio-immunoprécipitation et le LIA pour s’assurer de ne pas rendre de faux résultats positifs.
Avec l’utilisation d’algorithme alternatif, il est possible de se passer de ces tests de confirmation qui sont très couteux.

Le western blot

Le western blot est basé sur une migration électrophorétique de lysat viral sur un gel de polyacrylamide dénaturé afin de séparer les protéines virales en fonction de leurs poids moléculaires (figure 7).
Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose coupée en bande sur des migrants électrophorétiques et incubée avec les échantillons de sérum à tester.
Les complexes Ag-Ac sont visualisés à l’aide d’un Anti-Ig humain couplé à une enzyme.
Une bande colorée apparaît pour chaque protéine virale sur laquelle un anticorps spécifique s’est fixé permettant l’identification des anticorps spécifiques liés à leurs protéines correspondantes.
Lee et collaborateurs ont montré que l’immuno-réactivité du western blot varie en fonction de l’isolat viral [26].
Actuellement, la gp120 des isolats utilisant le récepteur CCR5 a montré une plus grande immuno-réactivité aux anticorps élucidés contre les protéines chez les sujets humains infectés par le virus par rapport aux isolats utilisant les récepteurs CXCR4 ou aux isolats divalents.
Ces données montrent que la supplémentation des kits de western blot avec des gp120 purifiées d’isolats utilisant le récepteur CCR5 peut améliorer leur sensibilité et faciliter le diagnostic précoce.

Interprétation du western blot

La procédure du western blot est très technique et demande un personnel bien formé. Les résultats du western blot sont interprétés avec des critères variables selon les laboratoires.
Toutefois, l’OMS, comme d’autres institutions, a proposé des critères standard d’interprétation du western blot (tableau II).
Les critères de positivité varient selon les institutions.

LIA (Line Immuno Assay)

• Inno-LIA
Cette méthode utilise des protéines recombinantes et des protéines de synthèse déposées sur des bandes de nylon fixées sur un support plastique. Pour le VIH-1 les protéines utilisées sont antigènes p17 et p24 du gène gag et les antigènes gp120 et gp41 du gène env et p32 du gène pol. Pour le VIH-2, les protéines utilisées sont la gp36 et la gp105 du gène env. A côté des lignes d’antigène, la bande contient les lignes témoins qui peuvent servir à établir une échelle de cotation. Le conjugué utilisé est une immunoglobuline de chèvre anti-IgG humaine purifiée par affinité et marquée à la phosphotase alcaline
• Pepti-LAV
Ce test utilise une membrane fixée sur un support plastique et qui comporte une ligne avec un sérum témoin et deux bandes sensibilisées avec des peptides de synthèse spécifiques, qui représentent les épitopes immunogènes gp41 du VIH-1 et gp36 duVIH-2. Le conjugué utilisé est une immunogène de chèvre anti-IgG humaine purifiée, marquée à la peroxydase de Raifort.

RIPA (Radio-Immuno-Precipitation Assay)

Elle utilise un virus marqué par un isotope radioactif (en générale cystéine 35). Le lysat viral contenant les antigènes à l’état natif est incubé avec les sérums à tester.
Les complexes immuns formés sont alors captés sur un support d’affinité telle que des billes de protéines A-Sepharose. Les antigènes viraux retenus par les anticorps spécifiques sont ensuite élués et séparés en fonction de leur poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide. La révélation est effectuée par autoradiographie. Cette technique met en évidence préférentiellement des anticorps dirigés contre les protéines d’enveloppe, et de ce fait elle constitue un apport complémentaire d’information pour les échantillons sériques d’interprétation délicate en Western blot.
La RIPA est donc un test de confirmation très sensible mais d’emploi délicat et réservée à quelques laboratoires agréés du fait de l’utilisation des éléments radioactifs.

L’immunofluorescence

Des cellules lymphocytaires infectées par le virus sont déposées et fixées sur des lames de microscope. D’autres cellules identiques non infectées servent de témoins et permettent d’éliminer les fixations non spécifiques.
Le sérum à étudier est mis en incubation sur la lame ; les anticorps présents se fixent sur les cellules et sont révélés par une antiglobuline humaine marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine. Une réaction positive se traduit par une fluorescence visible uniquement à la périphérie des cellules infectées ; une fluorescence observée également sur le témoin signe une fixation non spécifique d’anticorps reconnaissant les éléments cellulaires et non le virus.
L’immunofluorescence est une excellente technique de détection des anticorps dirigés contre les glycoprotéines membranaires et transmembranaires spécifiques de l’infection par le VIH ; mais cette technique très sensible est difficile à standardiser, susceptible d’interprétation erronée et se prête mal au dépistage de routine. Elle est pratiquement abandonnée.

Diagnostic direct [4, 5]

L’isolement viral

L’isolement du VIH en culture de lymphocytes est une technique lourde dont les indications diagnostiques doivent être soigneusement pesées et réservées à des protocoles d’études particulières ou à des situations d’échec des méthodes évoquées ci-dessus.

Recherche des antigènes p24

La recherche d’antigène p24 est réalisée par la méthode ELISA dans le sérum, le plasma, le LCR ou d’autres liquides biologiques. Le principe initial de cette technique est le suivant :
Les anticorps d’un sérum polyclonal anti-VIH fixés sur le fond des puits d’une microplaque ou sur bille de polystyrène, sont en présence du sérum humain à tester et se lient à l’antigène viral éventuellement présent. Après des lavages répétés, la présence de l’antigène est révélée par les anticorps anti-VIH de lapin ou de chèvre. L’antigène est donc mis en sandwich entre deux types d’anticorps eux-mêmes révélés par une réaction colorimétrique grâce à l’adjonction d’anticorps de chèvre ou de lapin conjugué à une enzyme. La présence de l’antigène se traduit par l’apparition de la coloration spécifique du produit de la réaction enzymatique. L’intensité de la coloration permet une quantification de cet antigène.
La sensibilité de la méthode ELISA de détection de l’antigène p24 est faible, tout particulièrement si on l’envisage à titre diagnostic.
Cependant, dans certains cas, cette technique s’est révélée très utile pour la mise en évidence précoce d’une infection par le VIH : l’antigène est en effet parfois détecté avant la séroconversion ou chez les nouveaux-nés nés de mères séropositives. Par ailleurs, la recherche de l’antigène à une certaine valeur pronostique négative au cours de l’évolution de l’infection à VIH confirmée. Un des avantages de la technique de détection de l’antigène est sa facilité de réalisation qui l’apparente aux techniques sérologiques, avec notamment la possibilité de travailler sur des sérums congelés à -20°C. Les congélations, décongélations répétées entraînent une diminution de la quantité détectée.
Actuellement dans les kits commerciaux disponibles le complexe p24-anticorps est dissocié.

La polymerase Chain Reaction

La PCR (polymerase Chain Reaction) est une technique d’amplification, de détection et d’identification in vitro des acides nucléiques pro viraux.
Les acides nucléiques sont extraits par lyse des cellules mononuclées du sang périphérique, puis soumis à des cycles comportant chacun trois étapes :
◙ dénaturation de l’ADN double brin à chaud (95-100°C)
◙ hybridation des amorces : hybridation des chaînes monocaténaires à des brins complémentaires synthétiques
◙ extension des amorces : elle se fait grâce à une ADN-polymérase thermostable (Taq), c’est le cycle de la réplication. Un cycle dure en général 2 à 3 minutes. Au terme d’une trentaine de cycles, un brin d’ADN est amplifié en 10 millions de copies.
La détection et l’identification des chaînes caténaires peuvent se faire par électrophorèse sur gel avec révélation enzymatique des oligomères nucléotidiques marquées.
La PCR est la méthode la plus sensible que l’on connaisse pour l’identification du VIH.
Elle est utile pour les cas suivants :
– diagnostic précoce de l’infection par VIH
– suivi d’une thérapeutique antivirale par la quantification de l’ ARN virale plasmatique
– diagnostic de l’infection par VIH chez le nouveau – né de mère séropositive
– distinction entre VIH-1 et VIH-2
Cette technique est aussi utile pour clarifier les situations sérologiques confuses (résultats indéterminés, résultats discordants entre ELISA et WB).
Par ailleurs la pratique montre que la technique est de réalisation délicate et sujette à de nombreux artefacts, par exemple, la plus infime contamination des réactifs par la séquence à amplifier conduit inéluctablement à des résultats faussement positifs.
5- Les perspectives de diagnostics biologiques [34]
Depuis 1985 d’énormes progrès ont été réalisés dans le domaine du diagnostic du VIH. Toutefois beaucoup de travail reste à faire afin de développer et d’évaluer de nouveaux outils de diagnostic dans divers domaines. La technique idéale de diagnostic sera capable de déceler tout les variants du VIH dès le début de l’infection. Elle ne doit pas être lourde et doit être de réalisation et d’interprétation simples. Elle devra être également, très spécifique et sensible au point de pouvoir servir de moyen efficace de prévention et de contrôle.
L’utilisation d’autres fluides biologiques tels que les urines et la salive pour la détection des anticorps anti-VIH est une alternative
Les échantillons de salive peuvent être collectés dans différentes situations (à la maison, dans la rue etc…) et sont faciles à conserver.
Les méthodes de recueil des ces échantillons sont plus sures et plus simples pour le donneur et pour le personnel médical car il n’y a pas de risque de transmission par le sang. En plus, l’infectiosité de la salive et des urines semble être nulle.
La collecte des urines et de la salive va favoriser le consentement des patients et est plus acceptable par ceux qui ont une mauvaise expérience du don de sang.
Le principal problème technique dans l’utilisation de la salive et des urines par le diagnostic du VIH est lié par le fait que les taux d’IgG et d’IgA sont considérablement plus faibles que ceux du sérum et du plasma. Une
concentration minimale de 0,1mg/l est nécessaire pour détecter les anticorps anti-VIH.
Les kits commerciaux capables de détecter d’aussi faibles quantités d’anticorps sont actuellement disponibles mais ils sont destinés à être utilisés avec des échantillons de sang uniquement.
Quand on utilise ces kits pour mettre en évidence ces anticorps dans la salive et dans l’urine le volume des échantillons devra être augmenté ou concentré avant la manipulation.

Dans les salives

Depuis 1986, plusieurs études ont montré que des anticorps peuvent être décelés dans les fluides oraux des sujets séropositifs.
Toutefois, il y’a eu des opinions divergentes sur la sensibilité des tests VIH utilisant ces fluides. Certaines utilisant des techniques traditionnelles de détection du VIH ont montré des performances significativement faibles.
La polémique réside dans l’impossibilité de reconnaître que la concentration des anticorps dans les liquides oraux est fonction des méthodes de prélèvements.
La salive doit être recueillie dans un récipient ou dans un kit commercial spécialisé.
Plusieurs systèmes de diagnostics sont commercialisés aux USA.
Le système oraquick permet de collecter et stabiliser un exsudat salivaire qui est un liquide ayant une concentration en anticorps plus élevée
que la salive. De plus, le système comporte un ELISA et un WB mis au point pour la détection de l’infection à VIH à partir de ces exsudats.
Plusieurs études ont montré que les résultats obtenus avec cette méthode, sont substantiellement meilleurs que ceux obtenues avec la salive entière.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Diagnostic biologique de l’infection à VIH
2. Bases biologiques importantes pour le diagnostic de l’infection à VIH
2.1.-Sructure
2.2- Organisation génétique [4]
2.3- Variabilité génétique [6, 17, 19, 20, 29, 36, 37, 45]
3-Bases immunologiques de l’infection à VIH
3.1.-Cinétique d’apparition des anticorps [9]
4-Techniques de diagnostic biologique de l’infection à VIH
4.1-Techniques indirectes
4.1.1-Test de dépistage du VIH [34]
4.1.1.1-Les tests ELISA
4.1.1.2- Les tests rapides/simples [34]
4.1.2- Les tests de confirmation [4, 9, 11, 34]
4.12.1.1-Interprétation du western blot
4.1.2.2- LIA (Line Immuno Assay)
4.1.2.3-RIPA (Radio-Immuno-Precipitation Assay)
4.1.2.4- L’immunofluorescence
4.2-Diagnostic direct [4, 5]
4.2.1-L’isolement viral
4.2.2-Recherche des antigènes p24
4.2. 3-La polymerase Chain Reaction
5- Les perspectives de diagnostics biologiques [34]
5.1- Dans les salives
5.2- Dans les urines
5.3- Gouttes de sang prélevées sur papier filtre
DEUXIEME PARTIE : METHODOLOGIE ET PERFORMANCE non défini
1-MATERIEL
1.1-Cadre d’étude
1.2-Population d’étude
1.3-Matériel et réactifs utilisés
1.3.1-Materiel et consommables
1.3.2-Réactifs de l’étude
2-Méthodologie
2.1-Echantillonnage et codification
2.1.1-Echantillonnage
2.1.2- Codification
2.2-Méthode
2.2.1- Procédure
2.2.2 – Calcul
2.2.2.2 – Spécificité
2.2.2.3 – Valeur prédictive positive (VPP)
2.2.2.4 – Valeur prédictive négative (VPN)
2.2.2.5 – Efficacité
2.2.3.1- Tests de l’évaluation
2.2.3.1.1- Tests non discriminatifs
2.2.3.1.2 Tests discriminatifs
2.2.3.2 – Tests de référence
3-RESULTATS
3.1-Performances des tests rapides
3.1.1 – Performances des tests non discriminatifs
3.1.2-Performances des tests rapides discriminatifs
4-DISCUSION
5-CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

Télécharger le rapport complet