Association d’un gel de fibrine et d’un réseau de polymère synthétique

Matrice extracellulaire

La matrice extracellulaire (MEC) est un microenvironnement tissulaire dynamique, complexe et tridimensionnel qui entoure les cellules et leur fournit un support physique au sein duquel elles peuvent adhérer, et communiquer par le biais de messagers biochimiques. Elle régule également de nombreux aspects du comportement cellulaire, notamment la prolifération et la croissance, la survie, les changements de morphologie cellulaire, la migration et la différenciation. Certaines MEC sont spécialisées pour une fonction donnée (la filtration, au niveau du glomérule rénal par exemple), d’autres peuvent être calcifiées pour présenter une plus grande résistance mécanique (dents, os).
Les composants de la MEC sont synthétisés, sécrétés et remodelés par les cellules .Toutes les cellules sont capables de sécréter et de dégrader leur MEC, mais certains types cellulaires sont particulièrement actifs dans la production de MEC interstitielle (la MEC située entre les tissus) : c’est le cas par exemple des fibroblastes et des cellules de muscle lisse. La structure et la composition de la MEC varie en fonction du tissu étudié, mais ses principaux constituants sont globalement conservés : ce sont le collagène, l’élastine, les glycoprotéines, les protéoglycanes et les facteurs de croissance, tous arrangés en une ultrastructure tridimensionnelle spécifique du tissu étudié .ll existe deux catégories principales de MEC : la lame basale (ou membrane basale) et le tissu conjonctif. La lame basale est caractérisée par son épaisseur, comprise entre 30 et 100 nm. Elle est située sous les épithéliums et les endothéliums et créée une barrière sélective pour les macromolécules entre deux types de tissus. Elle est riche en collagène de type IV, en laminine et en perlécan. Le tissu conjonctif est un tissu de soutien situé entre d’autres tissus et composé de cellules incluses dans une quantité relativement importante de MEC. Il est riche en collagènes fibrillaires, en protéoglycanes et en glycosaminoglycanes .

Qu’est-ce qu’un gel ?

Un gel est constitué d’au moins deux composants : un réseau tridimensionnel des macromolécules de polymères, et un solvant, la phase liquide, qui représente la plus grande partie du volume . Les travaux Almdal et al  ont permis de fixer 3 caractéristiques de l’état de gel :
Un gel consiste en un système homogène, cohérent avec deux constituants : une phase solide contenant une phase liquide dont elle empêche l’écoulement.
Chacune des deux phases occupe la totalité du volume du gel. Le gel se comporte comme un solide viscoélastique.
Les propriétés élastiques et fluidiques des gels font d’eux de bons candidats pour des applications dans des domaines aussi divers que les produits pharmaceutiques, la biotechnologie, l’agriculture, la transformation des aliments et l’électronique. La formation du gel résulte de l’agrégation des particules solides en solution ou en dispersion dans un liquide. Ainsi, lors de la transition sol-gel, la solution (sol), formée d’amas finis, devient un gel lorsque ces amas s’associent pour former un amas infini.
Ce réseau s’étend dans toutes les directions et retient la phase liquide. Il ne représente que quelques pourcents du volume total mais joue un rôle essentiel d’armature et permet de grandes déformations.

Exemples de formation de gels physiques

Des gels naturels sont utilisés depuis la Haute Antiquité pour l’alimentation et certaines productions artisanales comme les colles. Ainsi, les gels d’Aloé Vera sont employés depuis des siècles pour soigner les problèmes cutanés comme les brûlures, les escarres, les dermatoses ou les coupures. Ces biogels sont, pour la plupart, des hydrogels physiques. Constitués de molécules biologiques complexes, leur synthèse a longtemps été effectuée de façon empirique en faisant varier la concentration, la température, le pH. La formation d’hydrogels physiques peut être réalisée au moyen d’interactions physico-chimiques variées : interactions hydrophobes, ioniques, liaisons hydrogène et électrostatiques .
La gélification de nombreux polymères biologiques est induite par la formation réversible de liaisons hydrogène intermoléculaires, en dessous d’une température donnée (Upper Critical Solution Temperature).
Ce processus thermoréversible est bien connu pour la gélatine, et un certain nombre de polysaccharides (agarose, amylose, amylopectine, carraghénane) . La nucléation et la croissance des agrégats d’hélices sont mues par la formation d’hélices doubles (polysaccharides) ou triples (gélatine). S’inspirant de ces mécanismes de gélification observés dans la nature, certaines équipes ont développé des systèmes hybrides associant des peptides capables d’adopter une conformation hélicoïdale avec des polymères synthétiques. La gélification intervient quand le repliement des protéines en hélices aboutit à l’organisation d’une combinaison de plusieurs hélices combinées ensemble pour former une superhélice. Par exemple, une série d’hydrogels contenant des motifs protéiques de type superhélice a été mise au point en greffant, ou non, des segments peptidiques de charges opposées, sur le polyméthacrylamide de N-(2-hydroxypropyl). La longueur et le nombre de motifs susceptibles de s’assembler en superhélice influencent la cinétique de gélification, dont les durées varient de quelques minutes à plusieurs jours et cela, même en solutionstrès diluées (0,1% en tampon PBS). Des polypeptides à bloc ont également été synthétisés pour préparer des hydrogels selon la même méthode . Dans ce cas, la gélification dépend de la nature amphiphile des polypeptides, mais aussi de la conformation de la chaîne (hélice , feuillet ou random coil).
La stabilité thermique et l’auto assemblage de tels hydrogels sont liés aux interactions hydrophobes et électrostatiques. Celles-ci peuvent être contrôlées par modification des séquences en acides aminés et de la longueur des segments superhélice.

Exemples de synthèse de gels chimiques

Les liaisons covalentes entre les macromolécules dans les gels chimiques peuvent être créées par différentes voies de synthèse dont quelques-unes sont décrites ci-dessous.

Réaction chimique des groupements fonctionnels

Des hydrogels peuvent être préparés par des réactions entre des groupements fonctionnels présents dans des macromolécules solubles dans l’eau. Les réactions les plus courantes sont les formations de bases de Schiff, les additions de Michael, la formation de liaisons peptidiques ou encore la « chimie-click ».
Ainsi, la synthèse d’hydrogels de protéines est fréquemment réalisée en faisant réagir un aldéhyde sur les fonctions amine pour former une base de Schiff . Bien que d’autres composés contenant des fonctions aldéhyde puissent être employés , le glutaraldéhyde est largement utilisé comme réticulant, malgré sa toxicité même à de faibles concentrations. Avant d’être mis en contact avec des cellules, les matériaux préparés avec ce composé doivent être rincés ou incubés en présence de glycine afin de retirer ou de neutraliser tout le glutaraldéhyde qui n’aurait pas réagi. L’addition de Michael entre un groupement nucléophile (amine ou thiol) et un groupement électrophile (acrylate, vinyle ou maléimide) est une réaction chimique largement utilisée pour la synthèse d’hydrogels, notamment injectables, pour l’ingénierie tissulaire . Le mélange des deux polymères portant les groupements nécessaires à la réaction suffit, en effet, à former l’hydrogel. Les temps de gel sont compris entre 0,5 et 60 minutes.

Réactions enzymatiques

Les réactions enzymatiques sont essentielles pour la formation de la MEC et pour un grand nombre de processus physiologiques. Elles ont donc aussi été utilisées pour la synthèse in vitro d’hydrogels chimiques.
L’une des caractéristiques majeures des enzymes est le degré élevé de spécificité pour leur substrat qui limite les réactions secondaires. Agissant comme catalyseurs, elles ne sont pas incluses dans les réseaux qu’elles forment. Il est, de plus, possible de contrôler et de prédire la cinétique de formation de l’hydrogel et d’accroître la densité de réticulation du réseau en modifiant la concentration enzymatique. À titre d’exemple, la transglutaminase (TG), en présence de calcium, est capable de catalyser la réaction des amines primaires sur les carboxyamides des chaînes latérales glutaminyl des protéines ; cette réaction conduit à la formation d’une liaison amide (Figure 14a) . L’utilisation de TG a été mise en œuvre avec succès lors de la synthèse d’hydrogels à base, notamment, de PEG fonctionnalisé par un motif glutaminamide ou de polypeptides  pour renforcer des gels de protéines. ar ailleurs, la peroxydase de raifort (HRP, en anglais horseradish peroxidase) est une hémo-protéine qui catalyse le couplage des dérivés phénols ou anilines en présence de peroxyde d’hydrogène.
Des hydrogels à base d’acide hyaluronique, de dextran, de cellulose et d’alginate ont été synthétisés par cette approche . Les temps de gel sont courts (1 minute), les propriétés mécaniques sont de l’ordre de 10³  à 10⁴  Pa, et les matériaux perdent moins de 25% de leur masse en 5 mois, dans du tampon PBS . Ces propriétés peuvent être modifiées en fonction du rapport HRP/H202/substrat .

Application des hydrogels en ingénierie tissulaire

Matériaux support (« scaffold »)

Comme leur nom l’indique, ces matériaux servent de support temporaire qui facilitent les processus de réparation tissulaire. Ils doivent donc permettre l’adhérence, l’étalement, la motilité, la survie et la différenciation cellulaires . Leur fonction en ingénierie tissulaire est de permettre la croissance cellulaire en leur sein et/ou la migration à partir des tissus environnants. Le matériau support est donc un support pour l’adhérence cellulaire, la prolifération, la différenciation, le transport de nutriments et l’excrétion des déchets pendant que la cellule sécrète sa propre matrice extracellulaire. Idéalement, ce matériau support doit :
avoir une structure tridimensionnelle dans laquelle les pores sont interconnectés pour permettre la croissance cellulaire et le flux de nutriments et des déchets métaboliques.
être biocompatible, c’est-à-dire qu’il ne doit pas susciter de réaction inflammatoire ni posséder une forte immunogénicité ou une cytotoxicité importante .
être biorésorbable avec une vitesse de dégradation et de résorption contrôlée pour coïncider avec la croissance cellulaire/tissulaire in vitro/in vivo. Si sa dégradation est trop rapide, le matériau ne joue plus son rôle de support et l’organisme n’est pas capable d’éliminer les produits de dégradation, ce qui peut engendrer des réponses inflammatoires ou toxiques. Si la dégradation est trop lente, elle limite la croissance du nouveau tissu.
avoir une surface permettant l’adhérence cellulaire, la prolifération et la différenciation des cellules. avoir des propriétés mécaniques correspondant à celles du tissu d’implantation dont ils doivent favoriser la régénération, afin de servir de support lors des premières phases de croissance cellulaire.
Si son module de compression est trop faible, le matériau support peut être déformé et écrasé, ce qui conduit à une croissance cellulaire déformée voire à l’absence de toute croissance. S’il est trop élevé, les cellules ne sont pas dans des conditions optimales pour la croissance cellulaire. Les différences de modules élastiques se traduisent par des déformations différentes pour la même contrainte imposée, ce qui peut causer la délamination du matériau support.
pouvoir être produit en quantité importante et dans des conditions satisfaisantes de qualité, en limitant au maximum l’emploi de solvants organiques .

Rôle de barrière

Les hydrogels peuvent aussi être utilisés comme barrières pour améliorer la guérison des tissus vasculaires blessés en prévenant la resténose ou la thrombose dues à la formation d’adhérences post-opératoires . La formation intravasculaire d’un hydrogel fin permet, en effet, de limiter l’épaississement de l’intima (couche de cellules endothéliales en contact direct avec le flux sanguin, appuyées sur une lame basale) et la thrombose. L’hydrogel agit alors comme une barrière empêchant les plaquettes, les facteurs de la coagulation et les protéines du plasma d’interagir avec la paroi cellulaire. Leur contact avec la paroi des vaisseaux sanguins étant limité, la prolifération, la migration et la synthèse de matrice extracellulaire par les cellules musculaires lisses ainsi que la resténose le sont également.
Certains hydrogels permettent de limiter la formation d’adhérences induites par des traumatismes chirurgicaux, plus particulièrement au niveau du péritoine , et dues à une fibrinolyse anormale. Ainsi, un gel de poly(éthylène glycol-co-acide lactique) diacrylate, formé par polymérisation en masse sur les surfaces intrapéritonéales, limite le dépôt de fibrine et l’attachement des fibroblastes à la surface tissulaire, minimisant ainsi l’adhérence cellulaire. Ce gel étant biodégradable, il se résorbe au fil du temps . Ces hydrogels constituent donc une barrière qui limite l’adsorption protéique et la diffusion afin d’empêcher les cellules de s’attacher à leur surface.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE 
CHAPITRE 1 : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Matrice extracellulaire 
1.1. Le collagène
1.2. La fibronectine
1.3. La laminine
1.4. Glycosaminoglycanes et protéoglycanes
2. Qu’est-ce qu’un gel ? 
2.1. Gels physiques et gels chimiques
2.2. Hydrogels
3. Synthèse des hydrogels 
3.1. Exemples de formation de gels physiques
3.2. Exemples de synthèse de gels chimiques
3.3. Combinaison des réticulations physique et chimique
4. Propriétés requises pour un hydrogel pour la régénération tissulaire 
4.1. Biocompatibilité
4.2. Vascularisation
4.3. Dégradation
4.4. Propriétés viscoélastiques
4.5. Microenvironnement
5. Application des hydrogels en ingénierie tissulaire
5.1. Matériaux support (« scaffold »)
5.2. Rôle de barrière
5.3. Libération contrôlée de principes actifs
5.4. Encapsulation cellulaire
6. Types d’hydrogels
6.1. A base de précurseurs synthétiques
6.2. A base de précurseurs naturels
6.3. Limitations de ces gels
7. Hydrogels complexes 
7.1. Coréseaux de protéines/peptides PEGylées
7.2. Réseaux Interpénétrés de Polymères (RIPs)
8. Conclusion 
CHAPITRE 2 : MATERIAUX RIP A BASE DE PVAM 
1. Comportement lors de cycle de déshydration/réhydratation 
2. Dégradation enzymatique des RIP PVA-BSA/Fb
2.1. Suivi visuel de la dégradation
2.2. Evolution des propriétés viscoélastiques
2.3. Suivi du relargage des fragments protéiques
3. Variabilité entre lots et stérilisation du PVAm 
4. Conclusion 
CHAPITRE 3 : MATERIAUX POE-BSA/FB 
1. Choix du remplaçant du PVAm
2. Synthèse et caractérisation des coréseaux POE-BSA 
3. Synthèse des RIPs POE-BSA/Fb
3.1. Optimisation de la proportion d’amorceur
3.1. Influence du temps de polymérisation
3.2. Suivi de la formation des matériaux
4. Caractérisation des RIPs 
4.1. Caractérisation de l’architecture RIP
4.2. Biodégradabilité
5. Biocompatibilité des RIPs POE(x)BSA(y)/Fb 
5.1. Approche en deux dimensions
5.2. Cytotoxicité de l’Irgacure 2959
6. Conclusion 
CHAPITRE 4 : GREFFAGE ET DELIVRANCE DE MOLECULES A ACTIVITE BACTERICIDE 
1. Colonisation bactérienne et biomatériaux antibactériens
1.1. Colonisation bactérienne des surfaces
1.2. Stratégie pour limiter le développement bactérien
2. Choix et caractéristiques des composés bactéricides 
2.1. Coefficient d’extinction molaire
2.2. Détermination des concentrations minimales inhibitrices
3. Synthèse de RIPs POE-BSA/Fb contenant des sels d’ammonium
3.1. Aspect des RIPs contenant les sels d’ammonium
3.2. Vérification du greffage du styrène ammonium au coréseau POE-BSA
4. Caractérisation des matériaux 
4.1. Caractérisation de la morphologie des matériaux
4.2. Propriétés viscoélastiques des RIPs contenant des sels d’ammonium
4.3. Suivi de la dégradation des RIPs contenant les sels d’ammonium
5. Activité bactéricide de ces RIPs 
5.1. Etude de la diffusion des sels d’ammonium
5.2. Dénombrement des bactéries en contact avec le matériau
6. Conclusion 
CHAPITRE 5 : MATERIAUX A BASE DE PLASMA
1. Etude bibliographique 
1.1. Intérêt de l’utilisation directe du sang
1.2. Biomatériaux dérivés du sang
1.3. Utilisation clinique des biomatériaux à base de sang
1.4. Risques et limites des biomatériaux à base de sang
2. Gel de plasma 
2.1. Condition de gélification du fibrinogène du plasma
2.2. Structure du réseau de fibrine
3. Matériaux RIPs à base de POE et de plasma total 
3.1. Synthèse de RIPs à base de POE dans le plasma
3.2. Caractérisation des RIPs POE-BSA/Plasma
3.3. Biocompatibilité
4. Conclusion 
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 

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