ASPECTS IMMUNOLOGIQUES AU COURS DE LA TB

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Pathogenรจse de la tuberculose

Les espรจces du complexe M. tuberculosis, agents pathogรจnes responsables de la tuberculose, sont transmis par voie respiratoire suite ร  une libรฉration de petits gouttelettes aรฉrosoles contenant des bactรฉries par une personne atteinte de tuberculose pulmonaire losquโ€™il parle, chante ou รฉternue. Les gouttelettes sont inhalรฉes et dรฉposรฉes dans les alvรฉoles pulmonaires distales de personnes en contacts รฉtroits [18]. M. tuberculosis est une bactรฉrie intracellulaire et, bien qu’il puisse infecter diffรฉrents types cellulaires, les macrophages alvรฉolaires sont sa niche prรฉfรฉrรฉe. Les stades initiaux de l’infection sont caractรฉrisรฉs par des rรฉponses immunitaires innรฉes qui impliquent le recrutement de cellules inflammatoires dans les poumons [19] ; l’induction d’une rรฉponse immunitaire adaptative ne se produit que plus tard, aprรจs la dissรฉmination de M. tuberculosis aux ganglions lymphatiques drainant [20 ;21]. Dans les ganglions lymphatiques, la prรฉsentation des antigรจnes bactรฉriens par les cellules dendritiques conduit ร  l’amorรงage et ร  l’expansion des cellules T spรฉcifiques de l’antigรจne, qui se diffรฉrencient de cellules T naรฏves en cellules T effectrices. Les cellules T effectrices migrent ensuite vers le poumon infectรฉ et, en combinaison avec d’autres leucocytes, stimulent la formation de granulomes. Les granulomes sont des structures organisรฉes qui contiennent des macrophages, des lymphocytes et des fibroblastes [22]. Au sein du granulome, les macrophages sont activรฉs, par exemple par lโ€™IFN-ฮณ sรฉcrรฉtรฉ par les lymphocytes T CD4+ (cellules Th1) permettant de limiter la dispersion et la multiplication de M. tuberculosis.
Historiquement, les lymphocytes B n’รฉtaient pas considรฉrรฉs comme un รฉlรฉment important dans l’immunopathogenรจse de la TB. Cependant, il existe de plus en plus de preuves suggรฉrant que les lymphocytes B assurent la protection par la prรฉsentation des antigรจnes et la production d’anticorps via des interactions avec les lymphocytes T [23 ;24].
Bien que le systรจme immunitaire humain puisse contrรดler l’infection, le contrรดle ne conduit pas ร  lโ€™รฉlimination complรจte des mycobactรฉries. En fait, la plupart des personnes infectรฉes par M. tuberculosis sont cliniquement asymptomatiques, c’est-ร -dire dans un รฉtat de tuberculose latente [25]. Ces personnes infectรฉes de faรงon latente, dont on estime qu’elles reprรฉsentent le tiers de la population mondiale, reprรฉsentent un รฉnorme rรฉservoir potentiel de maladie. Des รฉtudes รฉpidรฉmiologiques montrent que 5 ร  10 % des personnes atteintes de TB latente dรฉveloppent une maladie active au cours de leur vie [26]. Les personnes atteintes de TB active toussent et gรฉnรจrent des gouttelettes infectieuses qui propagent l’infection (Figure 1).

Infection tuberculeuse chez l’homme

L’infection tuberculeuse survient gรฉnรฉralement pendant l’enfance lors de la premiรจre exposition aux bacilles tuberculeux, d’oรน la description de la tuberculose infantile ou de la tuberculose primaire. Bien que les infections ร  Mtb aient รฉtรฉ associรฉes ร  l’รฉrythรจme noueux et ร  la fiรจvre, l’exposition initiale ร  Mtb est gรฉnรฉralement asymptomatique [28]. Si l’infection ne conduit pas ร  la maladie, elle peut entrer dans une phase latente d’infection. La tuberculose postprimaire se rapporte ร  la rรฉactivation des bacilles latents, tandis que la tuberculose due ร  une rรฉinfection est dรฉcrite comme une tuberculose secondaire [29]. La tuberculose post-primitive peut affecter les poumons (tuberculose pulmonaire) ou d’autres parties du corps telles que la colonne vertรฉbrale, les articulations, les voies gรฉnito-urinaires, le systรจme nerveux ou l’abdomen (TB extra-pulmonaire) [30].

Progression de la tuberculose

Aprรจs inhalation, les bacilles sont inoculรฉs dans les bronchioles respiratoires et les alvรฉoles. Chez les hรดtes immunocompรฉtents, une rรฉponse des cellules T ร  mรฉdiation cellulaire est induite, ce qui conduit ร  l’activation et au recrutement des macrophages sur le site de l’infection [16]. Les macrophages alvรฉolaires et les phagocytes tels que les cellules dendritiques (DC) et les neutrophiles sont les premiรจres cellules ร  interagir avec les bacilles [31]. Mtb se rรฉplique dans les macrophages naรฏfs et reste confinรฉ dans le compartiment intracellulaire pendant de longues pรฉriodes [16]. Les bacilles peuvent toutefois รชtre libรฉrรฉs ร  tout moment aprรจs l’immunosuppression [32]. Les macrophages infectรฉs par Mtb sont transportรฉs par la lymphe et le sang vers des organes tels que la rate, le foie et les ganglions lymphatiques [32] oรน les cellules T sont amorcรฉes et multipliรฉes par clonage [33]. En raison de la libรฉration de facteurs chimiotactiques, les monocytes circulants s’infiltreront dans le site d’infection et se diffรฉrencieront en macrophages matures capables de tuer les bactรฉries libres [32]. En fin de compte, la progression de l’infection latente vers l’infection tuberculeuse dรฉpend de la dose infectante, du statut immunitaire et d’autres facteurs tels que la malnutrition et les toxines (alcool, tabac) [34].

ASPECTS IMMUNOLOGIQUES AU COURS DE LA TB

Rรฉponse immunitaire au cours de la TB active

Rรฉponse immunitaire innรฉe

En raison du mode de vie intracellulaire de M. tuberculosis, l’immunitรฉ dรฉpend essentiellement des lymphocytes T [35 ;36]. Aprรจs une infection par aรฉrosol contenant M. tuberculosis, les macrophages alvรฉolaires et les cellules dendritiques (DC) interstitielles, aprรจs une รฉtape de reconnaissance des composants de M. tuberculosis via des PRR comme les TLR, les CLR, les rรฉcepteurs de type oligomรฉrisation de nuclรฉotide, DC-SIGN, Rรฉcepteur Fc, Mannose Receptor (MR) et les Rรฉcepteurs รฉboueurs [37 ;38] phagocytent les pathogรจnes. La phagocytose concomitante de M. tuberculosis par les macrophages l’expose ร  un environnement intracellulaire sรฉvรจre, acide (acidification des phagosomes), riche en superoxydes (espรจces rรฉactives d’oxygรจne et d’azote) et l’autophagie de Mtb intracellulaire, entre autres processus [39]. Contrairement aux macrophages, les DC aprรจs avoir phagocyter les bactรฉries dans le tissu pulmonaire, peuvent migrer vers les ganglions lymphatiques drainants, et initier la rรฉponse immunitaire adaptative en activant les lymphocytes T naรฏve [40].
Cependant Mtb dispose de mรฉcanisme dโ€™รฉchappement efficace qui empรชche parfois sa destruction dans les macrophages. Parmi ces mรฉcanismes nous avons :
– Blocage de la fusion phagolysosome. En effet Armstrong et al ont montrรฉ que M. tuberculosis arrรชtait le phagosome ร  un stade prรฉcoce pour รฉviter la fusion avec le lysosome [41].
– Inhibition de la lyse toxique : La protรฉine Mtb catalase-peroxydase (KatG) et la protรฉine alkylhydroperoxyde rรฉductase (AhpC) la protรฉgeaient des superoxydes toxiques [42].
– Survie dans les corps apoptotiques : Mtb virulent peut contourner l’apoptose des macrophages infectรฉs, entraรฎnant une nรฉcrose et une infection continue de nouveaux macrophages frais [43].
– Immunomodulation environnement cytokinique : M. tuberculosis peut manipuler les profils de cytokines รฉlaborรฉs par l’hรดte pour รฉviter d’รชtre รฉliminรฉ. En effet une รฉtude a rapportรฉ que trois souches de M. tuberculosis hyper virulentes isolรฉes de patients atteints de mรฉningite tuberculeuse prรฉsentaient une croissance intracellulaire significativement accrue dans les macrophages humains par la rรฉgulation nรฉgative de l’expression du facteur de nรฉcrose tumorale (TNF-a) [44].
Pendant la recirculation, les lymphocytes T spรฉcifiques ร  M. tuberculosis interagissent avec les macrophages infectรฉs par M. tuberculosis dans les poumons. Ici, ils attirent et activent d’autres monocytes et cellules T pour former un granulome solide oรน le pathogรจne est contenu.

Rรฉponse immunitaire adaptative

Les rรฉponses immunitaires adaptatives contre la tuberculose comprennent ร  la fois l’immunitรฉ humorale et lโ€™immunitรฉ ร  mรฉdiation cellulaire. Une variรฉtรฉ de populations de lymphocytes T participent ร  la rรฉponse immunitaire contre la tuberculose [35 ;45]. Les lymphocytes T CD4 sont activรฉs par des peptides antigรฉniques dans le cadre de produits gรฉniques du complexe majeur d’histocompatibilitรฉ (CMH) de classe II, dรฉrivรฉs du compartiment phagosomale [46]. La rรฉsidence prรฉfรฉrentielle de M. tuberculosis dans le phagosome favorise le traitement du CMH de classe II, bien que Mtb ait dรฉveloppรฉ des moyens d’altรฉrer cette voie [47 ;48]. Les cellules T CD4 de type Th1 stimulรฉes produisent des cytokines de type 1, notamment l’interfรฉron-gamma (IFN-ฮณ) et le facteur de nรฉcrose tumorale (TNF) qui sont d’une importance cruciale dans la rรฉponse immunitaire anti tuberculose. Ces lymphocytes T auxiliaires de type 1 activent les fonctions effectrices des macrophages qui contrรดlent M. tuberculosis intracellulaire. Par consรฉquent, ils sont essentiels pour l’immunitรฉ protectrice dans la tuberculose.
Aprรจs l’activation et l’expansion clonale, les cellules T effectrices diminuent rapidement avec seulement une petite proportion qui se dรฉveloppe en lymphocytes T mรฉmoire (Tm) [49]. Certaines cellules Tm rรฉsident dans des sites d’infection en tant que cellules T effectrices mรฉmoire (Tem). D’autres migrent vers des ganglions lymphatiques voisins et constituent des cellules T mรฉmoires centrale (Tcm). Lorsque l’hรดte rencontre de nouveau M. tuberculosis, les Tcm vont prolifรฉrer et se diffรฉrencier rapidement en cellules T effectrices pour lโ€™รฉliminer.
Les cellules T CD4+ sont importantes car les personnes infectรฉes par le VIH ont une incidence plus รฉlevรฉe d’infection primaire ou de rรฉactivation de la latence de la tuberculose [50]. Les lymphocytes Th1 sont essentiels pour lutter contre les pathogรจnes intracellulaires, y compris M. tuberculosis. Les cellules Th1 sรฉcrรจtent l’IFN-ฮณ et le TNF-a pour recruter et activer les cellules immunitaires innรฉes, ainsi que l’interleukine (IL-2) pour activer les lymphocytes T [51].
Le rรดle essentiel de l’IFN-ฮณ a รฉtรฉ dรฉmontrรฉ chez les patients TB prรฉsentant un dรฉficit en IFN-ฮณ [52]. De plus, des mutations du gรจne de l’interfรฉron-g R1 peuvent rendre les personnes plus sensibles ร  l’infection ร  M. tuberculosis et entraรฎner une dissรฉmination du BCG chez les enfants aprรจs une vaccination [53].
Le TNF-a est รฉgalement critique car les patients traitรฉs par un antagoniste du TNF-a pour le traitement de la polyarthrite rhumatoรฏde prรฉsentent une incidence plus รฉlevรฉe de tuberculose [54]. Les patients tuberculeux traitรฉs par IL-2 prรฉsentent des symptรดmes cliniques amรฉliorรฉs [55]. De plus, les lymphocytes T polyfonctionnels produisant au moins deux types de cytokines (IFN-ฮณ, TNF-a et IL-2) sont des effecteurs plus puissants que les lymphocytes T monofonctionnels, qui n’en produisent qu’un seul type [56].
Th17 est un autre sous-ensemble de lymphocytes T auxiliaires CD4+ qui intervient pour le contrรดle de la tuberculose. Th17 produit de l’IL-17, qui dรฉclenche le recrutement de neutrophiles et de cellules T CD4+ productrices d’IFN-ฮณ (Th1), pour assurer une synergie de la rรฉponse contre lโ€™infection ร  M. tuberculosis [51].
Contrairement ร  la fonction protectrice de Th1 et Th17, les cellules T CD4+ auxiliaires de type 2 (Th2) semblent jouer un rรดle nรฉgatif en activant la sรฉcrรฉtion de cytokines (IL-4, IL-5 et IL-10โ€ฆ) et en inhibant les rรฉponses Th1 [57].
Il est ร  noter que les cellules T rรฉgulatrices (Treg) ont la capacitรฉ de produire de l’IL-10 et du facteur de croissance transformant ฮฒ (TGF-ฮฒ) pour supprimer la gรฉnรฉration et la fonction de Th1 et Th17 [57]. Les lymphocytes Treg s’accumulent souvent aux sites de l’infection ร  M. tuberculosis chez les patients actifs et joue un rรดle nรฉgatif pendant l’endiguement de la tuberculose [58].
Collectivement, les rรฉponses des lymphocytes T CD4+ bรฉnรฉfiques contre la TB reposent probablement sur une polarisation fine vers Th1 et Th17 tout en minimisant l’action de Th2 et de Treg (figure 2).
Outre les rรฉponses des lymphocytes Th1 et Th17, les lymphocytes T CD8+ restreints au CMH-I sont รฉgalement indispensables dans la lutte contre la tuberculose. La prรฉsentation des antigรจnes M. tuberculosis par les CPA implique la charge directe de l’antigรจne sur le complexe CMH-I ou l’absorption indirecte par des exosomes ou l’apoptose des cellules infectรฉes [59]. Les lymphocytes T CD8+ activรฉs tuent directement M. tuberculosis en libรฉrant de la granulysine ou indirectement par la lyse des macrophages ou des DC infectรฉs [60]. Deux voies distinctes de la cytolyse incluent l’exocytose des granules coordonnรฉes de perforine et granzyme A / B et la mort cellulaire programmรฉe suite ร  la fixation de Fas sur FasL, retrouvรฉs ร  la surface des cellules cibles [61]. Les antigรจnes de M. tuberculosis libรฉrรฉs peuvent รชtre recapturรฉs par les macrophages pour faciliter davantage le traitement et la destruction de l’antigรจne.

Gรฉnรฉralitรฉs sur les molรฉcules de co-stimulation

A la fin des annรฉes 1980, Schwartz RH proposait la thรฉorie du ยซ second signal ยป selon laquelle lโ€™activation des lymphocytes T nรฉcessite un premier signal dรฉfini par la reconnaissance par le rรฉcepteur T dโ€™un complexe CMH-peptide. Aprรจs un premier signal provenant de lโ€™interaction TCR/CMH-peptide, un second signal nรฉcessaire ร  lโ€™activation complรจte des lymphocytes T est transmis par lโ€™interaction dโ€™une molรฉcule de co-stimulation exprimรฉe par le lymphocyte T avec son ligand prรฉsent sur la cellule prรฉsentatrice dโ€™antigรจne [80]. En son absence, les lymphocytes T deviennent anergiques [80 ;81]. Ce signal de co-stimulation, fourni par un ensemble de molรฉcules, augmente lโ€™aviditรฉ de lโ€™interaction TCR/CMH-peptide et amplifie le signal induit par le complexe TCR-CD3. En fin, les molรฉcules de co-stimulation elles-mรชmes transmettent un signal aux lymphocytes T indรฉpendamment du CD3 [82].
Quatre grandes familles de molรฉcules de co-stimulation ont รฉtรฉ jusquโ€™ici dรฉcrites mais de nouvelles molรฉcules de co-stimulation sont dรฉcouvertes rรฉguliรจrement. Ainsi on distingue :
– La superfamille des immunoglobulines (dont le CD28),
– La superfamille des TNFR (Tumor Necrosis Factor receptor ; dont le CD40L),
– La superfamille des intรฉgrines (dont le LFA-1)
– Et la superfamille des TIM (TIM-3).
Chacune dโ€™elles est composรฉe de molรฉcules de co-stimulation activatrices et rรฉgulatrices. Le tableau I rรฉsume les principales molรฉcules de co-stimulation de ces superfamilles impliquรฉes dans lโ€™activation lymphocytaire.

Mรฉcanisme dโ€™action des molรฉcules de co-stimulation

Initialement, les molรฉcules de co-stimulation รฉtaient considรฉrรฉes comme permettant simplement dโ€™augmenter lโ€™activation et la fonctionnalitรฉ des lymphocytes T. Ainsi lorsque les lymphocytes T sont stimulรฉs par le rรฉcepteur T et co-stimulรฉs par le CD28, la production dโ€™IL-2 est augmentรฉe. Par la suite, il est apparu que le signal transmis par les molรฉcules de co-stimulation et leurs ligands รฉtait bidirectionnel car concerne aussi bien les LT, les CPA et probablement dโ€™autres cellules cibles. Ainsi, le CTLA-4 transmet un signal inhibiteur aux LT mais รฉgalement aux CPA aprรจs interaction avec son ligand. Ce signal induit lโ€™enzyme Indoleamine 2-3 dioxygenase qui dรฉgrade le tryptophane dont lโ€™absence ou la diminution peut entrainer lโ€™apoptose ou lโ€™anergie des LT [84]. Sur le plan molรฉculaire, les molรฉcules de co-stimulation activatrice de la superfamille des immunoglobulines (CD28, ICOS) vont activer les voies de la PI3 kinase et dโ€™AKT (PKB). La voie Ras est รฉgalement activรฉe via lโ€™activation du CD28 tandis que la voie ICOS est induite par le C-MAF.
Le domaine intra cytoplasmique des rรฉcepteurs des molรฉcules de co-stimulation appartenant ร  la superfamille des rรฉcepteurs du TNF (CD40L) va recruter des adaptateurs de la famille des TRAFF qui activeront ensuite diffรฉrentes voies de signalisation (NF-kB, MAPK, AP1, ERK et NFAT). A lโ€™inverse, les molรฉcules de co-stimulation inhibitrices inhibent la signalisation par le complexe CD3 en recrutant des phosphatases capables de dรฉphosphoryler diffรฉrentes protรฉines (CD zรชta, LAT, ZAP70โ€ฆ) impliquรฉes dans la transduction du signal par le rรฉcepteur T (figure 3) [85].

Fonctions des molรฉcules de co-stimulation

Les molรฉcules de co-stimulation รฉtaient connues pour leur rรดle de second signal pour lโ€™activation des lymphocytes T mais de nos jours leurs fonctions se sont diversifiรฉes. Ces molรฉcules sont exprimรฉes sur des sous-populations de LT et interviennent ร  diffรฉrentes รฉtapes de lโ€™activation lymphocytaire. Ainsi sur les LT naรฏfs, CD28 est la principale la molรฉcule responsable de lโ€™initiation de la rรฉponse lymphocytaire avec probablement un rรดle redondant avec le CD2 et HVEM. La survie et la prolifรฉration des LT mรฉmoires semblent plutรดt รชtre sous la dรฉpendance des molรฉcules de co-stimulation de la famille du rรฉcepteur du TNF (CD40L, CD27โ€ฆ) [86].
ICOS et PD-1 sont exprimรฉs par les LT CD4 folliculaires dans le centre germinatif et sont importants dans la coopรฉration cellulaire entre les LT CD4 et les lymphocytes B. En lโ€™absence dโ€™ICOS, on assiste ร  un dรฉficit dans la production des immunoglobulines. Le signal de co-stimulation va รฉgalement jouer un rรดle dans la polarisation de la rรฉponse lymphocytaire T. Ainsi les rรฉcepteurs appartenant ร  la famille SLAM, ainsi que TIM-1 et TIM-4, favorisent une polarisation de type Th2, tandis que dโ€™autres molรฉcules de co-stimulation appartenant souvent ร  la famille des rรฉcepteurs du TNF (CD27, HVEMโ€ฆ) orientent vers une rรฉponse Th1 [87].
Ces molรฉcules de co-stimulation sont รฉgalement importantes dans la gรฉnรฉration et la formation des LT rรฉgulateurs (Treg). Le CD28 est nรฉcessaire ร  la diffรฉrentiation de ces cellules dans le thymus et ร  leur persistance au niveau pรฉriphรฉrique. Des molรฉcules de co-stimulation inhibitrices (CTLA-4, Lag 3, GITR, HVEMโ€ฆ) sont exprimรฉes par les LT rรฉgulatrices et jouent un rรดle dans leurs fonctions suppressives [87].
De faรงon plus gรฉnรฉrale, les molรฉcules de co-stimulation inhibitrices jouent un rรดle dans la tolรฉrance et la prรฉvention des maladies auto-immunes. Elles sont รฉgalement surexprimรฉes physiologiquement en rรฉponse ร  une activation lymphocytaire aigue et participent ร  la rรฉgulation de cette rรฉponse immunitaire [88].

Le CD40L

Le ligand du CD40, connu sous le nom de CD154 ou CD40L, est une glycoprotรฉine transmembranaire de type II, avec un poids molรฉculaire variable entre 32 et 39 kDa en raison des modifications post-traductionnelles [89]. Une forme soluble de CD40L a รฉtรฉ rapportรฉe qui exprime des activitรฉs similaires ร  la forme transmembranaire [90,91]. Cette forme soluble est le rรฉsultat dโ€™un clivage enzymatique au niveau de la mรฉthionine 113 de la partie extracellulaire du CD40L membranaire. Le CD40L clivรฉ est une molรฉcule de 18KDa, trimรฉrique et biologiquement active [92]. Le CD40L est un membre de la superfamille du TNF et est caractรฉrisรฉ par une structure extracellulaire en sandwich qui est composรฉe d’une feuille ฮฒ, d’une boucle en hรฉlice ฮฑ et d’une deuxiรจme feuille ฮฒ [93]. Cette structure permet la trimรฉrisation du CD40L, qui est รฉgalement une caractรฉristique de la famille des ligands du TNF [93].
Le CD40L est exprimรฉ sous forme trimรฉrique ร  la surface des lymphocytes T activรฉs ainsi que par diffรฉrentes cellules hรฉmatopoรฏรฉtiques comme les monocytes, les basophiles, les cellules dendritiques et les plaquettes. Il est aussi exprimรฉ par certaines cellules non hรฉmatopoรฏรฉtiques comme les cellules รฉpithรฉliales, les cellules musculaires lisses et les cellules endothรฉliales [94].
Le CD40L (CD154) est une molรฉcule co-stimulatrice qui joue un rรดle dans l’immunitรฉ cellulaire contre les pathogรจnes intracellulaires en induisant la production de l’IL-12, qui gรฉnรจre ensuite des cytokines de type Th1 par des interactions avec CD40 sur les macrophages ou les cellules dendritiques [95].

Les rรฉcepteurs du CD40L

Le CD40 est considรฉrรฉ comme รฉtant le principal rรฉcepteur du CD40L [96]. Rรฉcemment, trois autres rรฉcepteurs pour le CD40L ont รฉtรฉ identifiรฉs : lโ€™ฮฑIIbฮฒ3 [97], lโ€™ฮฑ5ฮฒ1 [98] et le Mac-1 [99].
Le rรฉcepteur co-stimulateur CD40 est une glycoprotรฉine transmembranaire de type I appartenant ร  la superfamille du TNFR [100]. Le CD40 est une protรฉine de 48 kDa. Elle est constituรฉe dโ€™un domaine extracellulaire de 193 acides aminรฉs (aa), dโ€™une sรฉquence leader de 21 aa, dโ€™un domaine transmembranaire de 22 aa et dโ€™un domaine intracellulaire de 62 aa [89]. Dans le domaine extracellulaire du CD40, il y a 22 rรฉsidus de cystรฉine qui sont conservรฉs entre les membres de la superfamille du TNFR [89]. En ce qui concerne le profil d’expression, le CD40 a รฉtรฉ initialement caractรฉrisรฉ sur les cellules B et exprimรฉ sur les cellules dendritiques (CD), monocytes, plaquettes et macrophages ainsi que par les cellules non hรฉmatopoรฏรฉtiques comme les myofibroblastes, les fibroblastes, les cellules รฉpithรฉliales et endothรฉliales [101 ;102].

Lโ€™interaction CD40L/CD40

Les interactions CD40L / CD40 exercent des effets profonds sur les CD, les cellules B et les cellules endothรฉliales, parmi de nombreuses cellules des compartiments hรฉmatopoรฏรฉtiques et non hรฉmatopoรฏรฉtiques.
Il a รฉtรฉ dรฉmontrรฉ que l’engagement du CD40 sur la surface des DC favorise leur production de cytokines, l’induction de molรฉcules co-stimulatrices sur leur surface, et facilite la prรฉsentation croisรฉe de l’antigรจne [103]. Dans l’ensemble, l’impact de la signalisation CD40 sur les CD est dโ€™assurer leur maturation pour dรฉclencher efficacement l’activation et la diffรฉrenciation des cellules T.
La signalisation CD40 des lymphocytes B favorise la formation du centre germinatif (GC), la commutation isotypique des immunoglobulines, l’hypermutation somatique (SHM) de l’Ig pour augmenter l’affinitรฉ pour l’antigรจne et enfin la formation de cellules plasmiques.
De plus, il a รฉtรฉ dรฉmontrรฉ que la voie CD40 est essentielle pour la survie de nombreux types de cellules, y compris les cellules B, les CD et les cellules endothรฉliales dans des conditions normales et inflammatoires [104]. Cet รฉventail de fonctions pour CD40 souligne l’importance de ce rรฉcepteur lors de la gรฉnรฉration d’une rรฉponse immunitaire acquise [103]. Chez les CD infectรฉs par le BCG, il a รฉtรฉ montrรฉ que la stimulation du CD40 favorise non seulement leur capacitรฉ ร  sรฉcrรฉter de l’IL-12 mais augmente la libรฉration d’autres mรฉdiateurs inflammatoires tels que lโ€™IL-1ฮฑ, IL-1ฮฒ et IL-6 [105].

Matรฉriels et rรฉactifs (voir annexe)

La sรฉparation et conservation des PBMC

๏ถ Principe de la sรฉparation cellulaire
Les รฉlรฉments figurรฉs du sang pรฉriphรฉrique, en milieu Ficoll-Triosil de haute densitรฉ, subissent durant la centrifugation une migration diffรฉrentielle qui conduit ร  leur sรฉparation en deux fractions : dโ€™une part, les รฉrythrocytes et les granulocytes qui sรฉdimentent au fond du tube et dโ€™autre part, les lymphocytes, les monocytes et les plaquettes qui restent ร  lโ€™interface รฉchantillon/milieu de sรฉparation. Le milieu de sรฉparation Ficoll-Triosil est une solution de densitรฉ 1,077 contenant :
๏ƒผ Du Ficoll de haute masse molรฉculaire (400.000 Da), trรจs soluble dans lโ€™eau mais de faible viscositรฉ intrinsรจque, et possรฉdant des propriรฉtรฉs agrรฉgantes vis-ร -vis des globules rouges ;
๏ƒผ Du Triosil, qui forme avec le Ficoll une solution de faible viscositรฉ et de haute densitรฉ, et qui a pour rรดle dโ€™รฉtablir une osmolaritรฉ et une densitรฉ adaptรฉe ร  la sรฉdimentation des granulocytes.
Lors de la centrifugation, les cellules sรฉdimentent vers lโ€™interface รฉchantillon/Ficoll-Triosil. A lโ€™interface, les รฉrythrocytes sont agrรฉgรฉs du fait de la prรฉsence de Ficoll. La densitรฉ des agrรฉgats รฉtant supรฉrieure ร  celle du Ficoll-Triosil, les รฉrythrocytes sรฉdimentent au fond du tube. La densitรฉ des granulocytes sโ€™รฉlรจve dans une solution hyper-osmotique. Ils sรฉdimentent donc, tandis que les cellules mononuclรฉรฉes (PBMC) demeurent ร  lโ€™interface รฉchantillon / milieu de sรฉparation (figure 6).
๏ถ Mode opรฉratoire de la sรฉparation des cellules
๏‚ง Collecter 2 x 8 ml de sang dans un tube hรฉparinรฉ
๏‚ง Dans un tube Falcon de 50 ml contenant 15 ml de Ficoll, faire couler doucement le sang hรฉparinรฉ ร  la surface du Ficoll et centrifuger pendant 15 minutes ร  800 g sans freinage.
๏‚ง Aliquotter 2 x 1ml de plasma dans du tube eppendorf 1,5 et conserver ร  -20ยฐC
๏‚ง Transfรฉrer les PBMCs dans un nouveau tube Falcon de 50 ml et complรฉter le volume jusquโ€™ร  50 ml avec la solution de lavage (RPMI/PS) ; centrifuger ร  1800 Tpm pendant 10 minutes ร  4ยฐC avec freinage.
๏‚ง Aliquotter 2 x 300 ฮผL de Buffy-coat dans un tubes eppendorf 1,5 et congeler ร  -20ยฐ C.
๏‚ง Verser le surnageant et resuspendre doucement le culot dans 10ml de solution de lavage
๏‚ง Pour le comptage :
– Resuspendre les cellules dans 10 ml de 10%FBS/RPMI et transfรฉrer 50 ฮผL de la suspension cellulaire dans un puit dโ€™une plaque de 96 puits
– Centrifuger ร  1800 tpm pendant 10 minutes ร  4ยฐ
– Durant la centrifugation, ajouter 50 ฮผL de bleu trypan dans le puit contenant les 50 ฮผL de la suspension cellulaire et compter les cellules vivantes avec une cellule hรฉmatimรฉtrique
– Pour une cellule de comptage mesurant 0,1ฮผl/16 carrรฉs :
๏ƒผ Compter les cellules dans 2 quadrants de 16 carrรฉs et diviser par 2 pour avoir n
๏ƒผ Multiplier n par 20.000 pour avoir la concentration cellulaire.
๏ถ Conservation des cellules mononuclรฉes du sang pรฉriphรฉrique
Les PBMC ainsi isolรฉes ont รฉtรฉ conservรฉes pour leur stimulation et la dรฉtermination ultรฉrieure des rรฉponses cellulaires. Lโ€™objectif de ce procรฉdรฉ a รฉtรฉ de rรฉaliser les tests immunologiques de tous les รฉchantillons en mรชme temps afin dโ€™รฉviter les variabilitรฉs techniques entre les รฉchantillons mesurรฉs ร  des moments diffรฉrents.
La conservation des PBMCs a รฉtรฉ rรฉalisรฉe selon les รฉtapes ci-dessous :
๏‚ง Aprรจs la centrifugation des PBMCs, verser le surnageant et resuspendre doucement le culot cellulaire dans un volume suffisant de 10% FBS/RPMI pour avoir une concentration de 20 millions de PBMC/ml.
๏‚ง Mettre 300 ฮผL de la suspension de 20 million de PBMC dans un cryotube =หƒ 6 millions de PBMC.
๏‚ง Mettre 200 ฮผL de la suspension de 20 million de PBMC dans un cryotube =หƒ 4 millions de PBMCs (rรฉpรฉter cette รฉtape obtenir un second tube de 4 millions de PBMC).
๏‚ง Ajouter dans le tube contenant les cellules le mรชme volume de solution de conservation (10 % FBS/ 20 % DMSO / RPMI).
๏‚ง Mettre les cryotube ร  4ยฐ C dans de lโ€™isopropanol et conserver ร  -80ยฐC pendant une nuit.
๏‚ง Le jour suivant, transfรฉrer les cellules ร  -150ยฐC.

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Table des matiรจres

PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I : GENERALITES SUR LA TUBERCULOSE
I EPIDEMIOLOGIE
I.1 Incidence
I.2 Mortalitรฉ
II PATHOGENIE DE Lโ€™INFECTION A MTB
II.1 Agent causal de la tuberculose
II.2 Pathogenรจse de la tuberculose
II.3 Infection tuberculeuse chez l’homme
II.4 Progression de la tuberculose
CHAPITRE II : ASPECTS IMMUNOLOGIQUES AU COURS DE LA TB
I Rรฉponse immunitaire au cours de la TB active
I.1 Rรฉponse immunitaire innรฉe
I.2 Rรฉponse immunitaire adaptative
I.3 Rรดle de lโ€™IFN-ฮณ
II Gรฉnรฉralitรฉs sur les molรฉcules de co-stimulation
II.1 Mรฉcanisme dโ€™action des molรฉcules de co-stimulation
II.2 Fonctions des molรฉcules de co-stimulation
II.3 Le CD40L
II.4 Les rรฉcepteurs du CD40L
II.5 Lโ€™interaction CD40L/CD40
II.6 Le TIM-3
II.7 Les ligands de TIM-3 : La Galectine-9
II.8 Lโ€™interaction TIM-3/Galectine-9
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I METHODOLOGIE
I.1 Objectifs
I.1.1 Objectifs gรฉnรฉraux
I.1.2 Objectifs spรฉcifiques
1.2 Cadre dโ€™รฉtude
1.3 Type et pรฉriode dโ€™รฉtude
1.4 Population dโ€™รฉtude
1.4.1. Critรจres dโ€™inclusions
1.4.2 Critรจres de non inclusion
1.5 Aspects รฉthiques
1.6 Prรฉlรจvements
I.7 Matรฉriels et rรฉactifs
I.7.1 La sรฉparation et conservation des PBMC
I.7.2 Dรฉcongรฉlation des PBMC
I.7.3 Stimulation et fixation cellulaire
I.7.3.1 Principe
I.7.3.2 Modes Opรฉratoires
I.7.4 Marquage extracellulaire
I.7.5 Marquage intracellulaire
I.7.6 Analyse des cellules par cytomรฉtrie en flux
I.7.6.1 Principe de la cytomรฉtrie en flux
I.7.6.2 Stratรฉgie de sรฉlection (gating)
I.7.7 Analyses des donnรฉes
II. RESULTATS
II.1. Caractรฉristiques de la population dโ€™รฉtude
II.2 Production dโ€™IFN-ฮณ par les Th1
II.3 Production dโ€™IFN-ฮณ par les T CD8
II.4 Expression du CD40L par les cellules Th1
II.5 Expression de CD40L par les lymphocytes T CD8+
II.6 Expression de TIM-3 par les cellules Th1
II.7 Expression de TIM-3 par les cellules T cytotoxiques
III. DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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