ARN régulateurs et adaptation aux antibiotiques chez Staphylococcus aureus

Physiopathologie des infections staphylococciques

                Les infections dues au staphylocoque doré s’étendent du panaris bénin aux fulgurantes endocardite infectieuse ou pneumopathies nécrosantes (Tableau 1 ; (Lowy, 1998; Pilly et al., 2019; Tong et al., 2015)). Les plus fréquentes et les plus bégnines sont les infections superficielles de la peau et des tissus mous. S. aureus colonise la peau grâce à des protéines de surface, les MSCRAMM (Microbial Surface Component Recognozing Adhesive Matrix Molecules). Parmi ces adhésines, on retrouve la protéine A, les protéines de liaison au fibrinogène (ClfA et ClfB) et à la fibronectine (FnBPA et FnBPB) ou encore les protéines de liaison au collagène (Cna) (Brière et al., 2014; Clarke and Foster, 2006). L’infection se développe après rupture de la barrière cutanéomuqueuse, lorsque l’équilibre commensal est rompu. La dissémination bactérienne au sein de l’organisme peut donner naissance à des infections invasives plus rares mais pouvant engager le pronostic vital. Ces affections plus graves sont souvent des complications d’atteintes locales, entraînant la diffusion des bactéries par voie hématogène (appelée bactériémie) et le développement de localisations secondaires septiques grâce à des protéines immunomudulatrices et à des enzymes dégradant les tissus de l’hôte. En France, 10% des bactériémies sont associées à une endocardite infectieuse (EI) (Pilly et al., 2019). Les facteurs d’adhésion exprimés par S. aureus facilitent le développement de l’EI et la formation de greffe bactérienne pouvant à son tour être source de foyers infectieux secondaires. Les infections ostéo- articulaires (IOA) sont aussi associées à un mode de contamination par voie hématogène mais également par inoculation directe. Ces infections sont caractérisées par une destruction de l’articulation par chondrolyse et/ou de l’os par ostéolyse, induite par l’inflammation. Généralement, les mécanismes de colonisation ou de formation de biofilm sont favorisés chez les porteurs de dispositifs médicaux implantables (intracardiaques ou articulaires) ou en cas de pathologies préexistantes type valvulopathie pour l’EI ou diabète pour les IOA (infection du pied diabétique). Les staphylocoques sont la principale cause des infections cutanéo-muqueuses bactériennes, des bactériémies (30% S. aureus, à égalité avec Escherichia coli), des EI (40% dont 30% S. aureus) et des IOA (Pilly et al., 2019). Dans son arsenal de facteurs de virulence, S. aureus possède de puissants atouts : les toxines. Par exemple, la leucocidine de Panton-Valentine (LPV), essentiellement sécrétée par les SARM (S. aureus Résistants à la Méticilline) communautaires, est corrélée à des infections plus graves, nécrosantes et récidivantes (Pilly et al., 2019). Les syndromes toxiniques sont classés à part car ils reposent sur un mécanisme physiopathologique différent. Les signes cliniques associés à ses syndromes sont la conséquence des toxines produites par S. aureus. Associé dès les années 1980 à l’utilisation de tampons hygiéniques pendant les menstruations (Davis et al., 1980; Osterholm and Forfang, 1982; Shands et al., 1980), le syndrome du choc toxique (SCT) ou choc toxique staphylococcique est le plus connu d’entre eux. Une exotoxine appelée TSST-1 (Toxic Shock Syndrom Toxin-1), superantigène entraînant un relargage massif de cytokines pro-inflammatoires (See et al., 1992), est à l’origine du choc septique accompagné de défaillances d’organes et d’un rash maculaire diffus érythémateux. Les TIAC (Toxi-Infections Alimentaires Collectives) résultent également de la production de toxines. Thermorésistantes, ces entérotoxines contaminent les aliments préparés dans le non-respect des mesures d’hygiène. Les principaux symptômes observés sont des troubles gastrointestinaux, apparaissant 4 à 48h après l’ingestion d’aliments contaminés. De ce fait, les TIAC sont des maladies à déclaration obligatoire étroitement surveillées en France par l’Anses et Santé Publique France. Caractéristique supplémentaire, S. aureus est une des principales causes d’infections associées aux soins (IAS), anciennement nommées infections nosocomiales. On estime qu’entre 7% et 10% des patients hospitalisés dans le monde sont atteints d’IAS (World Health Organization, 2011). Ces infections alarment depuis de nombreuses années puisque l’environnement hospitalier est souvent le creuset idéal favorisant l’émergence de nouvelles souches multirésistantes aux antibiotiques.

Prise en charge générale des infections staphylococciques

                   Le panel de résistances existant chez S. aureus conditionne la prise en charge thérapeutique des staphylococcies qui s’appuie, lorsque cela est requis, sur l’analyse de l’antibiogramme. Le traitement de référence des affections staphylococciques repose sur l’utilisation de molécules de la famille des Pénicillines M. En tant que premier représentant, la méticilline a donné son initiale (« M ») à cette famille de β-lactamines mais elle a laissé sa place de chef de file à l’oxacilline, moins toxique. Dans le cas d’infections causées par des SARM, les glycopeptides (dont la vancomycine) sont utilisés en première intention (Pilly et al., 2019). Certaines situations imposent l’utilisation de combinaisons thérapeutiques. C’est par exemple le cas de la rifampicine, utilisée en association pour traiter les infections compliquées, en particulier sur matériel implantable (Pilly et al., 2019). Cependant, son utilisation est de plus en plus restreinte. L’étude ARREST publiée en 2018 et menée sur 758 patients (Thwaites et al., 2018) a démontré que l’utilisation concomitante de rifampicine dans le traitement des bactériémies à S. aureus n’était pas justifiée. Un paragraphe consacré à la rifampicine est développé dans le chapitre « Quelques inhibiteurs de l’ARN polymérase ».

Les facteurs σ staphylococciques

                   S. aureus possède quatre facteurs σ. Les deux principaux facteurs sont σA et σB tandis que σS et σH sont considérés comme cryptiques. σA est le facteur σ primaire de S. aureus. Caractérisé par Deora et Misra en 1996 (Deora and Misra, 1996) à partir des données de B. subtilis, il est considéré comme l’alter ego de σ70 chez E. coli. En effet, ce facteur essentiel assure l’expression de la majorité des gènes et en particulier des gènes de ménage durant la phase exponentielle de croissance (Mäder et al., 2016). Identifié peu de temps après le facteur végétatif σA (Deora et al., 1997), σB est le principal facteur σ alternatif du staphylocoque doré. Appartenant à la famille σ70, il est présent chez de nombreux Gram positifs riches en AT des genres Bacillus, Listeria et Staphylococcus (van Schaik and Abee, 2005). Il s’agit du principal facteur de réponse au stress : stress physico-chimique (choc thermique ou osmotique, variation de pH, oxydation (Kullik et al., 1998; Pané-Farré et al., 2006)), stress physiologique (entrée en phase stationnaire (Pané-Farré et al., 2006), défenses de l’hôte (Tuchscherr et al., 2015), formation de biofilm (Mitchell et al., 2010; Valle et al., 2019)), stress antibiotique (résistance aux antibiotiques ciblant la paroi (Singh et al., 2003; Wu et al., 1996)). Cependant le facteur σB n’intervient pas seulement dans des situations de stress ; il régule des processus relatifs au métabolisme basal comme la biosynthèse de la paroi ou la pigmentation et il est l’élément clé de la virulence chez S. aureus (Bischoff et al., 2004; Kullik et al., 1998; Pané-Farré et al., 2006). Un peu plus de 9% des promoteurs sont σB -dépendants. Le niveau d’expression basal du régulon σB est assez élevé même s’il est plus fortement exprimé en phase stationnaire (Mäder et al., 2016). La régulation de σB 18 est particulière puisqu’il s’agit à ce jour du seul facteur staphylococcal pour lequel un anti-sigma, RsbW, a été identifié (Miyazaki et al., 1999). Chez S. aureus, il existe seulement trois protéines Rsb homologues à celles de B. subtilis : RsbU, un activateur de σB (Giachino et al., 2001), RsbW, l’anti-sigma, et RsbV, l’antagoniste de RsbW (Palma and Cheung, 2001; van Schaik and Abee, 2005). Les gènes codant σB et ses protéines régulatrices (sigB, rsbU, rsbV, rsbW) appartiennent à la même unité de transcription et la synténie est conservée par rapport à B. subtilis (Miyazaki et al., 1999). σH et σS sont des facteurs cryptiques possédant des fonctions très spécifiques. σH , caractérisé au début des années 2000, est un orthologue du facteur éponyme retrouvé chez B. subtilis (Morikawa et al., 2003). Ce facteur est impliqué dans la régulation positive de la compétence naturelle via l’induction de l’expression des opérons comE et comG malgré une faible efficacité de transformation (Morikawa et al., 2012, 2003). Une des hypothèses avancées serait l’absence de régulation par σH de certains gènes essentiels pour la compétence (Fagerlund et al., 2014). Il est également impliqué dans la régulation génétique de certains prophages staphylococciques (Tao et al., 2010). σS est le dernier facteur identifiée chez S. aureus (Shaw et al., 2008). Il a été classé comme potentiel facteur extracytoplasmique (ECF) par homologie de séquence. Les travaux menés sur ce facteur suggèrent un rôle dans la survie au long court, la virulence et le maintien de l’intégrité de la paroi et de l’ADN suite à un stress (Miller et al., 2012; Shaw et al., 2008).

L’auréothricine, un possible inhibiteur de l’ARN polymérase ?

                     L’auréothricine est une ancienne molécule de la famille des dithiolopyrrolones, découverte à la fin des années 1940 à Tokyo. Comme de nombreux antibiotiques, elle est issue de bactéries du genre Streptomyces. Cette poudre cristalline jaune possède un large spectre antibiotique puisqu’elle est capable d’agir aussi bien contre les Gram positifs que contre les Gram négatifs. La cible et le mécanisme d’action de cette pyrrothine sont inconnus. Au sein de la même famille, d’autres molécules agiraient comme des inhibiteurs de l’ARNpol, suggérant un mode d’action similaire pour l’auréothricine. Ce bactériostatique ne connut pourtant pas son heure de gloire thérapeutique en raison d’une toxicité avérée, identifiée dès son isolation (Qin et al., 2013; Umezawa et al., 1948).

Les ARNrég agissant en cis

                 Les interactions ARN/ARN en cis impliquent généralement des ARNrég codés dans les régions 5’ ou 3’ UTR (UnTranslated Regions) de leur cible. Ces ARNrég ont souvent une structure sensible aux conditions environnementales leur permettant ainsi de moduler l’activité de leur cible (Waters and Storz, 2009). Les riboswitches sont un exemple d’élément régulateur en cis dont la conformation dépend de la présence d’un métabolite. Ils sont plus abondants chez les bactéries mais on les retrouve dans tous les Règnes du vivant. Ces senseurs possèdent une séquence aptamère conservée, site de liaison du ligand capable de modifier la configuration de la plateforme d’expression (Figure 12). Il n’existe pas moins de vingt classes de riboswitches, hiérarchisés en fonction de leurs ligands et de leurs aptamères. Ces riborégulateurs sont en général responsables de rétrocontrôle négatif, au niveau transcriptionnel ou traductionnel (Serganov and Nudler, 2013). C’est le cas des premiers riboswitches décrits au début des années 2000, impliqués dans la régulation de la synthèse des vitamines B1 et B2 (Mironov et al., 2002) et du transport de la vitamine B12 via le transporteur BtuB chez E. coli (Nahvi et al., 2002). En regard des voies de biosynthèse qu’ils contrôlent, leurs ligands sont la vitamines B12 ou des coenzymes dérivés des vitamines B1 (Thiamine PyroPhosphate, TPP) et B2 (Flavine MonoNucléotide, FMN). Les ligands reconnus par les riboswitches sont de nature très variable (molécules ou ions) mais ils sont liés de près ou de loin aux produits finis régulés par les mêmes riboswitches (Serganov and Nudler, 2013). Une classe particulière de riboswitch repose sur l’utilisation des ARN de transfert (ARNt) en tant que ligands. Ces riboswitches, appelés T-box, régulent l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme ou la synthèse des acides aminés, en particulier chez les Firmicutes. Les ARNt non chargés qui interagissent avec la région aptamère du riboswitch induisent la formation d’un anti-terminateur de transcription ou libèrent un SD, conduisant à l’expression des gènes en aval. Cette interaction repose sur la reconnaissance des trois extrémités de l’ARNt : l’anticodon, le coude et le bras accepteur non chargé. Ce dernier est essentiel pour stabiliser la structure anti-terminatrice ou anti-sequestratrice de SD et donc permettre la transcription ou la traduction du gène régulé en aval (Kreuzer and Henkin, 2018). Au-delà de leurs caractéristiques générales, les T-box peuvent se démarquer grâce à des mécanismes de régulation originaux. Par exemple, la synthèse de la méthionine chez S. aureus est en partie régulée par un riboswitch T-box au niveau transcriptionnel. Récemment, des chercheurs ont mis en évidence l’action régulatrice coordonnée inhabituelle de deux ribonucléases, RNase III ciblant la tige terminatrice du T-box met, et RNase J modulant la demi-vie de l’ARNm met (Wencker et al., 2021).

Particularités de l’ARN 6S chez B. subtilis

                     Après E. coli, B. subtilis est l’organisme chez lequel nous avons le plus de données sur l’ARN 6S; il ne possède pas moins de deux ARN 6S, nommés ARN 6S-1 et ARN 6S-2 et codés respectivement par les gènes bsrA et bsrB. Un troisième ARN 6S a même été identifié chez B. subtilis BEST7613. Son gène aurait été acquis par transfert horizontal artificiel à partir d’une bactérie du genre Synechocystis (Wehner et al., 2014). Les ARN 6S-1 et -2 ont été identifiés grâce à des approches computationnelles (Barrick, 2005) et biochimiques (Trotochaud and Wassarman, 2005). L’ARN 6S-1 existe sous deux formes, anciennement nommée ARN BS201 et BS190 à cause de leur taille respective (201 et 190 nucléotides), BS201 étant le précurseur maturé en position 5’ de BS190 (Suzuma et al., 2002). La cinétique d’accumulation de l’ARN 6S-1 (de 10 à 18 fois plus abondant en phase stationnaire) ressemble à celle observée chez E. coli (Barrick, 2005; Suzuma et al., 2002; Thüring et al., 2021; Trotochaud and Wassarman, 2005). L’ARN 6S-2, initialement appelé ARN BS203 (203 nucléotides) (Ando et al., 2002), a un profil d’expression difficile à appréhender ; certains n’observent aucune différence quantitative entre phase exponentielle et phase stationnaire (Trotochaud and Wassarman, 2005), alors que d’autres affirment que son pic d’expression est maximal en milieu de phase exponentielle (Ando et al.,2002; Barrick, 2005; Thüring et al., 2021). Globalement, le niveau d’expression de l’ARN 6S-1 est plus important que celui de l’ARN 6S-2 (Barrick, 2005). Un point rassemble ces deux paralogues : leur structure conservée leur permettant d’interagir avec l’ARNpol-σA avec la même affinité, σA étant le facteur végétatif de B. subtilis (Barrick, 2005; Burenina et al., 2014; Trotochaud and Wassarman, 2005). Plusieurs ARN 6S laisseraient entendre plusieurs fonctions distinctes au sein de la cellule. D’un point de vue phénotypique, les analyses peuvent varier d’une souche à l’autre. Chez certaines souches, seul le mutant bsrA (ARN 6S-1) présente un retard au redémarrage, un défaut de croissance ou d’adaptation en phase stationnaire prolongée comparé à sa souche isogénique en conditions standards (Ando et al., 2002; Cavanagh et al., 2012; Hoch et al., 2015; Suzuma et al., 2002; Thüring et al., 2021). Ces observations sont également valables pour le double mutant bsrA/bsrB de la souche PY79 malgré quelques différences pour ΔbsrA (Hoch et al., 2015). L’ARN 6S-1 contrôlerait également le démarrage de la sporulation (Cavanagh and Wassarman, 2013). Chez B. subtilis NCIB 3610, l’ARN 6S-2 serait impliqué dans la motilité bactérienne, l’inhibition de la formation de biofilm via la répression de marqueurs comme tasA, epsA and bslA et la retardation de la sporulation (Thüring et al., 2021). De manière surprenante, le phénotype de sporulation lié à l’ARN 6S-2 n’existe pas chez la souche B. subtilis 168 (Cavanagh and Wassarman, 2013). Le double mutant bsrAB possède aussi des phénotypes contradictoires selon les souches : il redémarre plus lentement et accuse un retard de croissance en conditions de stress physico-chimiques (stress oxydatif, pH élevé, choc osmotique) par rapport à la souche parentale NCIB 3610 (Thüring et al., 2021) alors que le phénotype inverse est décrit lors d’un stress alcalin chez la souche PY79 (Hoch et al., 2015). Les auteurs attribuent principalement ces différences au fond génétique bactérien. Par exemple, les souches PY79 et 168 dérivent de la souche NCIB 3610 mais elles ont perdu certaines aptitudes liées à la formation de biofilm, la motilité ou la sporulation par rapport à leur souche ancestrale (Hoch et al., 2015; Thüring et al., 2021). Les avis divergent également quant aux fonctions de ces deux homologues, entre ceux qui penchent pour des fonctions redondantes au sein de la cellule (Hoch et al., 2015) et ceux qui plaident l’inverse (Cavanagh and Wassarman, 2013). Malgré certaines incohérences, les auteurs semblent toutefois s’accorder sur des fonctions relatives à l’utilisation et à la disponibilité des nutriments dans l’environnement bactérien.

Table des matières

INTRODUCTION
Staphylococcus aureus, une bactérie aux multiples facettes
Caractéristiques générales
Physiopathologie des infections staphylococciques
Evolution de la résistance aux antibiotiques chez S. aureus
Concentrations sublétales et résistance aux antimicrobiens
Prise en charge générale des infections staphylococciques
L’ARN polymérase bactérienne
Le noyau de l’ARN polymérase
Les facteurs σ
Généralités
Les facteurs σ staphylococciques
La transcription en trois étapes
L’initiation
L’élongation
La terminaison
Quelques inhibiteurs de l’ARN polymérase
Les rifamycines
La fidaxomicine
L’auréothricine, un possible inhibiteur de l’ARN polymérase ?
Les ARN régulateurs
Les interactions ARNrég/ARNm
Les ARNrég agissant en trans
Les ARNrég agissant en cis
Cas particulier des ARNrég à double fonction
Les interactions ARNrég/protéines
Généralités
L’ARN 6S, David contre Goliath ?
Contexte de la découverte de l’ARN 6S
Répartition dans le domaine bactérien
Caractéristiques de l’ARN 6S chez E. coli
Particularités de l’ARN 6S chez B. subtilis
L’ARN 6S chez S. aureus
RESULTATS
Chapitre 1 : Sensibilité aux antibiotiques dépendante de l’ARN 6S
Résultats complémentaires
Résistance à la rifampicine (RifR) et ARN 6S
Contrôle transcriptionnel de l’ARN 6S
Etude des cibles putatives de l’ARN 6S dépendantes de CymR
Analyse de la paroi du mutant ΔssrSSa
Chapitre 2 : Un ARN régulateur issu de la région 5’ non traduite (5’UTR) de malK cible la néoglucogenèse chez les vibrions
DISCUSSION
Un nouveau phénotype associé à l’absence d’ARN 6S
Les interactions entre l’ARN 6S et l’ARNpol holoenzyme
L’ARN 6S est-il un régulateur global chez S. aureus ?
Bibliographie

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