APPLICATIONS MICROSCOPIE EN BACTERIOLOGIE HISTOLOGIE ET PARASITOLOGIE

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Théorie corpusculaire

Pour expliquer certains phénomènes tels la réflexion et la réfraction de la lumière, Newton proposa le modèle corpusculaire en 1704. Selon ce modèle, la source lumineuse émettrait un faisceau de particules qui stimulerait la vue en pénétrant dans l’œil. Les trajectoires de ces particules sont appelées des rayons lumineux ; l’étude de ces trajectoires fait l’objet de l’optique géométrique.
Le modèle corpusculaire proposé par Newton connut un grand succès (9).

Théorie ondulatoire

Au début du 19ème siècle, Young et Fresnel proposèrent alors un autre modèle basé sur une description ondulatoire de la lumière. A cette époque, on ne connaissait pratiquement que les ondes sonores et l’idée de la théorie ondulatoire de la lumière ne fut pas acceptée d’emblée. Par la suite, Maxwell, en 1873 démontra théoriquement qu’un circuit électrique peut générer des ondes radioélectriques et que la vitesse de propagation de ces ondes est très proche de la vitesse de la lumière déterminée expérimentalement. Quinze ans plus tard, Hertz vérifia que ces ondes présentent les mêmes caractéristiques que les faisceaux lumineux. Elles peuvent être réfléchies sur une surface lisse, déviées à la surface de séparation entre deux milieux différents et focalisées.
Au début du 20ème siècle, on concevait donc la lumière comme une onde dite électromagnétique (8).

Sources lumineuses

Une source lumineuse est un système physique émettant de la lumière. Les sources de lumière sont très variées. Plusieurs processus physiques conduisent à l’émission de lumière (accélération de charges électriques, transition atomique ou moléculaire, recombinaison électron-trou dans un semi-conducteur, annihilation particule /antiparticule, etc.). On distingue :
 Le soleil: l’ozone absorbe le rayonnement UV l’atmosphère absorbe une partie du rayonnement IR. Une partie importante de la lumière est diffusée par les molécules d’air d’où la couleur bleue du ciel dans la journée et jaune et rouge le matin et le soir (incidence rasante du soleil). Puissance : 1kW/m². Notre soleil est une étoile parmi les autres ;
 Les sources thermiques : ce sont des corps portés à une température suffisamment élevée pour que leur rayonnement thermique se situe dans le domaine des ondes visibles ;
 Les lampes spectrales : elles contiennent un gaz dont les atomes sont excités par voie électrique et qui se désexcitent en émettant des raies à des fréquences bien définies (Exemple : on a les lampes à vapeur de sodium, de mercure, ou les lampes à décharge en générale) ;
 Les sources à semi-conducteurs, en particulier les diodes électroluminescentes, dans lesquelles la lumière est émise lorsqu’un électron passe dans un état d’énergie inférieur disponible à cet endroit ;
 Les sources froides (luminescentes) : les vers luisants et les lucioles sont de petits animaux munis d’organes «luminescents», capables d’émettre de la lumière tout en restant à température ordinaire. Ils y arrivent en convertissant directement de l’énergie chimique en énergie lumineuse. On parle dès lors de chimioluminescence ;
 Les tubes à gaz : à la place des lampes à incandescence on utilise actuellement très souvent des «tubes fluorescents», que ce soit pour l’éclairage intérieur des maisons ou pour les enseignes lumineuses. Ces tubes contiennent un gaz à basse pression, traversé par des électrons d’énergie assez grande. Il s’agit, en fait, d’un processus très semblable à l’éclair et aux étincelles électriques, (mais ceux-ci sont produits dans l’air, à la pression atmosphérique). On parle alors de «décharge gazeuse» ;
 Le laser est un autre type de source lumineuse. Il repose sur le phénomène d’émission stimulée. Lorsqu’un atome se trouve dans un état excité, un photon incident dont l’énergie correspond à une transition de désexcitation possible peut effectivement conduire à une telle désexcitation, avec émission d’un second photon ayant des caractéristiques identiques à celle du photon incident. Excepté les lasers, toutes ces sources sont polychromatiques. Les lasers sont monochromatiques. On appelle lumière monochromatique une lumière n’ayant qu’une seule couleur c’est-à-dire composée d’une seule onde de longueur d’onde définie. Une lumière polychromatique est la somme d’ondes de différentes longueurs d’ondes. La lumière blanche est une lumière polychromatique contenant toutes les longueurs d’onde du visible (10).

Principe de propagation rectiligne de la lumière

Depuis la plus haute antiquité, il est observé que la lumière issue d’une source ponctuelle se propageant dans un milieu homogène et isotrope emprunte un trajet rectiligne passant par la source. Un ensemble de milieux transparents homogènes et isotropes constitue un système optique. Les différents éléments du système sont séparés soit par une surface réfléchissante (miroir) soit par un dioptre (10).

Lois de la réflexion et de la réfraction

– Lois de la réflexion
La réflexion consiste en un brusque changement de direction de la lumière incidente qui, après avoir rencontré une surface réfléchissante, revient dans son milieu initial de propagation. Si la surface réfléchissante est en métal poli, on parle de réflexion métallique. Le facteur de réflexion est alors élevé (il dépend de l’inclinaison des rayons lumineux et aussi fortement de la longueur d’onde). Il faut noter que les miroirs domestiques comportent une plaque de verre protectrice sous laquelle est déposée la couche réfléchissante (7; 11; 12)
 Première loi : le rayon incident, la normale au point d’incidence et le rayon réfléchi sont dans le même plan perpendiculaire au plan du miroir, appelé plan d’incidence (figure 4 );
 Deuxième loi : l’angle d’incidence (i) est égal à l’angle de réflexion (r)
Plan d’incidence
i : angle d’incidence
r : angle de réflexion IN : la normale au point d’incidence (M) : miroir N F R i r (M) I
– Lois de la réfraction : lois de Snell-Descartes
La réfraction consiste en un brusque changement de direction de la lumière incidente qui, après avoir rencontré une surface dite réfringente, se propage dans un milieu différent de son milieu de propagation initial. Chaque milieu étant caractérisé par son indice de réfraction (n) qui est égal au rapport de la vitesse de la lumière dans le vide (c = 299792458 m.s1 3 10 8 ms1 ) à celle dans le milieu considéré (v).
On appellera n1 l’indice de réfraction du milieu initial (dit aussi milieu incident) et n2 l’indice du milieu final. Les lois de la réfraction ont été établies par W. Snell en 1621, R. Descartes les a retrouvées en 1637, avec celles de la réflexion, si bien qu’elles sont connues en France sous le nom de lois de Descartes. Elles sont les suivantes (7; 14; 12).
 Première loi : le rayon incident SI, le rayon réfracté IR et la normale au point d’incidence NIN sont dans le même plan (figure 5) (11; 12)
 Deuxième loi : soient i1 et n1 l’angle d’incidence et l’indice de réfraction du premier milieu (milieu par lequel la lumière arrive), i2 et n2 l’angle de réfraction et l’indice de réfraction du second milieu (figure 5). La deuxième loi s’écrit (11; 12): n1 sin i1 n2 sin i2.

Différents types de microscopes

Microscope à lumière transmise

Les microscopes à lumière transmise servent à contempler des préparations transparentes et très fines. Plus la préparation est fine, plus l’observation est faite avec précision. Ces microscopes peuvent aussi être utilisés pour voir la surface d’échantillons de corps opaques, comme par exemple, des granulés ou des dépôts. Dans ces cas-là, la préparation s’observe comme un jeu de lumière et d’ombres. Sur ces types de microscopes le rayon de lumière est normalement projeté d’en bas, en traversant la préparation lorsqu’elle est transparente. Pour une meilleure observation de préparations spéciales disposées sur la platine, il est recommandé d’utiliser un microscope inversé. Sur ces types de microscopes, l’éclairage est du haut vers le bas. La microscopie inversée s’utilise avec fréquence dans l’hydrogéologie, l’hydrobiologie et la médecine. Etant donné que le type de construction implique que la distance entre l’objet et l’objectif soit assez grand, cela rend possible la contemplation de préparations plus épaisses (18).

Microscope à lumière réfléchie

Sur ce type de microscope, la préparation s’éclaire de la partie supérieure à travers de l’objectif ou de façon latérale. La lumière réfléchie sur la préparation est captée par l’objectif. Grâce à cette technique, il est possible d’utiliser des préparations opaques ou épaisses. Les microscopes de lumière réfléchie s’utilisent fréquemment dans la microscopie de fluorescence ou en minéralogie.

Microscope stéréoscopique

Les microscopes stéréoscopiques sont principalement des microscopes de lumière réfléchie. La préparation est en général éclairée de la partie supérieure ou inférieure. La plupart des microscopes stéréoscopiques permettent d’éclairer aussi de la partie inférieure.
Les microscopes stéréoscopiques se différencient d’autres microscopes car ils disposent de deux entrées de lumière séparées, qui sont rangées dans un angle déterminé. Chaque entrée de lumière intègre son propre objectif et oculaire. Certains microscopes stéréoscopiques intègrent une lunette d’augmentation intégrée devant l’objectif(18).

Microscope à fluorescence

Dans ce type de microscope on utilise en général un colorant fluorescent qui est inséré dans l’échantillon à analyser. A l’aide d’une lumière de longueur d’onde déterminée le fluochrome excité devient fluorescent. La lumière émise par le colorant fluorescent a une longueur d’onde plus grande que celle de la lumière excitatrice (Soke’s Shift). Dans la trajectoire du rayon, la lumière fluorescente peut être séparée de la lumière excitatrice à travers des filtres optiques et renvoyer à l’oculaire ou à la caméra. La limite de résolution d’un microscope de fluorescence peut être très en-dessous d’un microscope optique conventionnel, ce qui permet de contempler avec précision les structures d’une cellule ou les processus biologiques de cellules vives(18).

Microscope confocal

Ce type de microscopie est une forme particulière de la microscopie optique. Le principe du microscope confocal est d’éliminer la lumière provenant de coupes optiques supérieures et inférieures, à l’aide de trous d’épingles situés à la source de la lumière et avant le détecteur. Pour ce faire, on place un diaphragme devant le détecteur, dans le plan focal conjugué au plan focal de l’objectif (d’où l’attribut « confocal »). Ainsi, seule la lumière provenant du plan focal atteint le détecteur.
La source lumineuse est un laser, qui balaye point par point l’objet à analyser. Dans sa configuration « réflexion », il utilise un miroir semi-réfléchissant, qui réfléchit le rayon provenant de l’objet vers un détecteur. Ce dernier peut ainsi mesurer l’intensité lumineuse de chaque point et la stocker dans un ordinateur(18).
Une fois que le balayage selon les abscisses et les ordonnées est effectué, et qu’une image à deux dimensions est obtenue, le plateau contenant l’objet est déplacé d’un incrément dz, et le balayage recommence. Ainsi, on mémorise des « tranches », qui peuvent par la suite être traitées informatiquement pour obtenir des images à trois dimensions de l’objet. Dans ce cas, des sections optiques très fines sont scannées et une image tridimensionnelle se compose. Etant donné que chaque section est une image très nette, une image 3D très bien mise au point est obtenue.

Table des matières

Introduction
PREMIERE PARTIE : LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
I.1 Historique
I.2 Bases optiques
I.2.1 Lumière
I.2.1.1 Définition
I.2.1.2.Théorie corpusculaire
I.2.1.3 Théorie ondulatoire
I.2.1.4 Sources lumineuses
I.2.1.5 Principe de propagation rectiligne de la lumière
I.2.1.6 Lois de la réflexion et de la réfraction
I.2.2 LENTILLES MINCES SPHERIQUES
I.2.2.1 Définition
I.2.2.2. Marche des rayons lumineux
I.2.2.3 Images fournies par une lentille convergente
I.2.2.4 Images données par une lentille divergente
I.2.2.5 Formules de conjugaison
I.3 Composantes du microscope
I.4 Différents types de microscopes
I.4.1 Microscope à lumière transmise
I.4.2 Microscope à lumière réfléchie
I.4.3 Microscope stéréoscopique
I.4.4 Microscope à fluorescence
I.4.5 Microscope confocal
I.4.6 Microscope STED (Stimulates Emmision Depletion)
I.4.7 Microscope à force atomique, Atomic Force Microscopy (AFM)
I.4.8 Microscope à balayage à effet tunnel, Scanning Tunnelling Microscopy (STM)
I.4.9 Microscope à rayons X
I.4.10 Microscope électronique
I.4.10.1 Microscope électronique à transmission (TEM)
I.4.10.2 Microscope électronique à balayage Scanning Elektron Microscopy (SEM)
DEUXIEME PARTIE : APPLICATIONS MICROSCOPIE EN BACTERIOLOGIE HISTOLOGIE ET PARASITOLOGIE
I APPLICATIONS EN BACTERIOLOGIE
I.1 Microscopie photonique simple
I.1.1 Réalisation des frottis
I.1.1.1 Etalement
I.1.1.2 Séchage
I.1.1.3 Fixation de la préparation
I.1.2 Colorations usuelles
I.1.2.1 Coloration au bleu de méthylène
I.1.2.2 Coloration de Gram
I.2 Autres microscopies
II. APPLICATIONS EN HISTOLOGIE
II.1 Microscopie photonique simple
II.1.1 Préparation tissulaire
II.1.2 Différents types de colorations
II.1.2.1 Coloration Hématéine Eosine Safran (HES)
II.1.2.2 Coloration de May-Grunwald-Giemsa (MGG)
II.1.2.3 Coloration de Papanicolaou
II.2 Autres microscopies
III. APPLICATIONS EN PARASITOLOGIE
III.1 Microscopie photonique simple
III.1.1 Prélèvement des échantillons
III.1.2 Fixation des échantillons
III.1.3 Examen direct (selles fraîches)
III.1.4 Types de colorations
III.1.4.1 Coloration au lugol
III.1.4.2 Coloration de Ziehl-Neelsen à froid
III.1.4.3 Coloration de weber
III.1.4.4 Coloration au bleu de méthylène
III.2 Autres microscopies
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Télécharger le rapport complet