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La chromatographie en phase supercritique de nos jours
Définitions
Tout composé pur existe sous trois états de la matière : solide, liquide et gazeux, en fonction de la température et de la pression. Au point triple, les trois états de la matière coexistent en équilibre. Les domaines d’existence des différents états sont délimités par des courbes d’équilibres qui traduisent des transitions de phase (fusion/solidification, vaporisation /liquéfaction, sublimation/condensation).
La définition de l’état supercritique est liée à l’équilibre liquide-vapeur du diagramme de phase (Figure 1.1). Au point critique, la densité des deux phases tend vers l’égalité, faisant ainsi disparaître toute interface. La figure 1.2 illustre le processus de disparition de l’interface au point critique pour un composé pur. De la gauche vers la droite, on assiste au passage d’un système biphasique distinct liquide/vapeur à la formation d’une phase supercritique unique homogène au point critique. Ce phénomène est lié à une élévation de pression et de température.
De manière générale, l’état supercritique est un état de la matière, intermédiaire entre les gaz et les liquides, qui est atteint lorsque les valeurs de pression et de température sont supérieures à celles des paramètres critiques (PC, TC).
Viscosité
La viscosité et la diffusivité des fluides supercritiques sont proches de celles des gaz. Une viscosité relativement faible induit une faible résistance à l’écoulement de la phase mobile au travers de la phase stationnaire, se traduisant alors par de faibles pertes de charge. Ce paramètre régit également la vitesse de diffusion des solutés dans la phase mobile. Une diffusivité plus importante que celle des liquides favorise le transfert de matière et ainsi autorise l’utilisation de débits élevés, sans nuire à l’efficacité de la séparation [15].
A travers ces propriétés, la chromatographie employant les fluides supercritiques comme phase mobile s’impose comme une méthode alternative à la chromatographie liquide à ultra-haute pression (UHPLC), la chromatographie liquide haute température (HTLC) et à l’utilisation de colonnes monolithiques et à porosité superficielle pour le développement de procédures analytiques rapides et efficaces [16]. L’application de débits élevés (pouvant atteindre 10 ml/min) et de gradient de composition de phase mobile, ainsi que l’équilibrage rapide des colonnes permettent à la SFC de se positionner comme technique de choix dans le cadre de criblage rapide.
La faible viscosité des FS facilite également le couplage de colonnes, soit de nature identique pour accroitre les performances de séparation, soit de nature différente pour bénéficier des sélectivités propres à chaque phase. Des efficacités importantes, de l’ordre de 200 000 plateaux peuvent être atteintes avec des longueurs de colonne atteignant 2 mètres [17]. Le développement de particules à faible diamètre (1,7 µm – 3,0 µm) autorise un nombre de plateaux similaires à ceux obtenus en UHPLC, ainsi que la réduction du temps d’analyse [18,19]. C’est également le cas des particules à porosité superficielle, appelées plus communément fused-core ou core-shell. Elles permettent notamment le couplage de colonnes car elles génèrent moins de pressions que les particules totalement poreuses [20].
Par exemple, le couplage en série d’une phase achirale (Synergi Polar RP 250 x 4,6 mm ; 4,0 µm) et chirale (Chiralpak ID 150 x 4,6 mm ; 5,0 µm) permet la séparation sélective de 4 herbicides racémiques (figure 1.3). L’intérêt est réel puisque les phases chirales présentent souvent une faible sélectivité achirale. La position et la longueur des colonnes ont un impact significatif sur la qualité de la séparation. Le couplage induit une augmentation de pression interne dans la colonne placée en première position, ce qui y augmente la force éluante du fluide. On peut observer dans la figure ci-dessous que l’inversion de la position des colonnes entraine une perte de séparation entre les quatre premiers énantiomères. Ce phénomène est moindre dans le cas des colonnes monolithiques. La combinaison de macropores et de mésopores permet d’atteindre une porosité de l’ordre de 80%. La grande perméabilité de la phase minimise les changements de densité du fluide [21].
Pouvoir solvant
Les fluides supercritiques ont un pouvoir solvant dit à « géométrie variable », ces propriétés pouvant être modulées par une variation des paramètres thermodynamiques (pression et température), c’est-à-dire en faisant varier leur densité.
Le pouvoir solvant du CO2 supercritique peut également être modulé par l’ajout de modificateurs tels que le méthanol, l’éthanol, l’isopropanol ou l’acétonitrile [22]. Géneralement, ils améliorent la solubilité des composés polaires ainsi que les performances chromatographiques. Sauceau et al. (2001) montrent par exemple que la solubilité d’un principe actif pharmaceutique dans le CO2 peut être multipliée par 10 avec 1% de DMSO ou 5 % d’éthanol [23,24]. Ils peuvent aussi apporter de nouvelles propriétés aux FS. C’est le cas du (R)-butanol pour apporter de la chiralité et le phosphate de tri-butyle pour augmenter la solvatation des complexes métalliques [25].
L’adsorption du modificateur et du dioxyde de carbone sur la phase stationnaire peut altérer le caractère de la phase stationnaire. Sur les colonnes de silice greffée C18, ils recouvrent probablement les silanols résiduels, favorisant alors la symétrie des pics [26]. Dans le cas des phases stationnaires chirales polysaccharides, des modificateurs encombrés (comme l’isopropanol) peuvent altérer la liaison glycosidique entre les unités de glucose, induisant une modification de la structure tridimensionnelle du polymère [27].
L’ajout de modificateur se répercute également à un autre niveau. En effet, un accroissement de viscosité du fluide est observé ce qui induit une augmentation de pression interne et donc de la masse volumique. Les paramètres critiques sont également augmentés lors de l’introduction d’un co-solvant.
Dans les zones de forte compressibilité, un faible changement de pression induit une augmentation considérable de la masse volumique et donc du pouvoir solvant. La vitesse linéaire de la phase mobile et la compressibilité du fluide sont continuellement modifiées le long de la colonne. Toute instabilité dans le contrôle de la pression conduit à une diminution de l’efficacité de la séparation, une modification de la sélectivité [28,29] ou même à des résultats non reproductibles.
Afin de minimiser l’influence de la pression et de la température, il est possible de travailler dans le domaine « subcritique » pour lequel la valeur d’un des paramètres est plus faible qu’un paramètre critique (P<PC ou T<TC). Tarafder et al. ont discuté de l’effet de la pression et de la densité en milieu sub- et super-critique. Ils recommandent d’opérer dans des conditions de faible compressibilité du CO2 (haute pression et faible température) afin d’éviter une variation des propriétés thermo-physiques de la phase mobile le long de la colonne et une mauvaise efficacité [30]. Cet état permet d’apporter une flexibilité dans le contrôle du processus de rétention.
Il existe actuellement une multitude de termes, regroupée sous le terme « chromatographie unifiée » [31] pour désigner l’état du fluide en fonction des conditions de pression et de température, ainsi que de la composition de la phase mobile : l’état « near critical » (subcritique) est atteint lorsque la valeur de pression ou de température est inférieure à un des paramètres critiques. L’état « superheated liquid » (liquide superchauffé) est atteint lorsque P<PC et T>TC. Par exemple, l’extraction d’herbicides des sols est réalisée à l’aide d’eau à haute température (374°C) [32]. Des études ont aussi été menées concernant des phases mobiles liquides pour lesquelles la viscosité est moindre via une augmentation de température (<100°C). L’utilisation de ces liquides dits « à fluidité améliorée » (« enhanced fluidity liquids ») induit des temps d’analyse réduits, une efficacité plus importante, ainsi qu’une réduction de la perte de charge le long de la colonne [33]. Ils sont une alternative intéressante aux phases liquides conventionnelles.
Applications
Applications industrielles du CO2 supercritique
Le potentiel du CO2 supercritique est reconnu et exploité dans le monde industriel et offre une variété d’applications : son utilisation comme solvant d’extraction ou de fractionnement devient une alternative intéressante vis-à-vis des techniques d’extraction conventionnelles telles que la macération ou la percolation. Ce procédé respectueux de l’environnement permet alors l’obtention d’extrait sans résidu de solvant. De par son caractère non polaire, le CO2 supercritique est principalement utilisé pour l’extraction d’hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs), de polluants aromatiques organochlorés (PCB) et de pesticides [34,35]. Dans le domaine agroalimentaire, son utilisation est surtout connue pour la décaféinisation [11] et/ou la purification d’arômes, dans la phyto-industrie, tels que la vanille, les baies de rose ou le houblon [1].
En 1985, la Société Separex, crée par Michel Perrut, devient spécialiste dans la mise en place de processus pour l’extraction végétale pour la pharmacie, cosmétique, nutraceutique.
Le Commissariat à l’énergie atomique (CEA) a mis au point un procédé innovant et breveté de décontamination du bouchon de liège par traitement CO2 supercritique. Il permet d’éliminer sélectivement le 2,4,6-trichloro-anisole (TCA), ainsi que des micro-organismes, à l’origine des déviations organoleptiques du vin [36].
Il peut être aussi utilisé pour la valorisation de substances dans des matrices données. C’est le cas du procédé d’extraction du squalène à partir d’huile d’olive. Ce composé est utile dans le domaine alimentaire (complément alimentaire), cosmétique (antioxydant, antistatique et émollient) et pharmaceutique (anticancéreux).
Dans le domaine de la santé, le procédé RESS (Rapid Expansion of Supercritical Solutions) illustre l’utilisation du fluide supercritique comme solvant de pulvérisation dans le cadre du contrôle de la taille et la morphologie des particules [37]. Son principe repose essentiellement sur le pouvoir solvant du fluide. Ce procédé a été utilisé avec succès pour la formation de particules inhalables pour une administration pulmonaire [38].
Ce procédé peut être également employé pour étaler l’effet thérapeutique d’une substance active à l’aide de polymères biocompatibles. La lovastatine, molécule hypocholestérolémiante, est co-précipitée avec l’acide poly-lactique (PLA), sous forme de microsphères polymériques [39]. Aujourd’hui, la société française Ethypharm est spécialisée dans la mise au point de procédé d’encapsulation pour une libération contrôlée dans l’organisme. Les microsphères destinées à être administrées par voie injectable sont obtenues selon un procédé d’enrobage impliquant la mise en contact sous agitation du principe actif et de l’agent enrobant dans un fluide supercritique (brevet WO 2001089481 A1).
La société Pierre Fabre est le seul établissement pharmaceutique à disposer d’une plate-forme pour des études d’élaboration, d’imprégnation et d’enrobage de pré-formulations galéniques basées sur l’utilisation du CO2 supercritique. Ces procédés permettent d’augmenter la biodisponibilité du principe actif.
Approches chromatographiques
Depuis sa naissance dans les années 1960, la chromatographie en phase supercritique (SFC) a été l’une des techniques orphelines des laboratoires analytiques, définie aussi bien comme une source de difficultés qu’un vaste champ d’opportunités.
Dans les années 80, la SFC est perçue comme une extension de la chromatographie en phase gazeuse (colonne capillaire et détecteur universel de type ionisation de flamme ou FID) et de la chromatographie liquide haute performance (système d’injection et contrôle de phase mobile). Cependant, le faible développement technologique, associé aux limitations envisagées du domaine d’application et la mauvaise reproductibilité des analyses due à des appareils encore peu fiables restreignent alors son usage à l’industrie pétrochimique [40].
Dans les années 90, l’utilisation de la SFC sur colonne remplie, appuyée par les travaux de Terry Berger, connait un regain d’intérêt [41]. La technique est alors considérée comme une alternative prometteuse à la chromatographie liquide à polarité de phase normale (NPLC). Les instruments sont des extensions des appareils utilisés en HPLC, avec des modules spécifiques complémentaires tels que le régulateur de pression qui permet de maintenir précisément le fluide à une certaine pression, la pompe réfrigérée qui permet de pomper le CO2 sous forme liquide afin d’éviter les phénomènes de cavitation, et un système de détection adapté (cellule résistante à la haute pression pour la détection UV-visible).
La SFC est aujourd’hui souvent considérée, à tort, comme une technique de phase normale analogue à la NPLC en raison de la nature apolaire de la phase mobile. Les phases polaires silice, amino, cyano et diol sont les plus utilisées, mais toutes les chimies de phase stationnaires existant pour l’HPLC peuvent être employées. Un grand nombre de travaux a été publié par notre équipe sur la classification de ces colonnes en SFC. Parmi le large choix de chimie de phases stationnaires, ces travaux fournissent des lignes directrices pour sélectionner un set de colonnes complémentaires en termes de sélectivité [42-45]. Cependant, une même phase mobile peut être appliquée indépendamment de la nature de la colonne [46]. Des phases de type alkyl peuvent être employées pour des séparations de type « phase inverse » alors que inversement, des phases polaires peuvent être employées pour des séparations de type « phase normale ». Ceci est parfaitement illustré pour l’analyse de composés aromatiques en SFCxSFC compréhensive, mettant en œuvre deux colonnes de polarité opposée dans chacune des deux dimensions, une colonne de silice dans la première dimension permettant une séparation par classe et une colonne de silice greffée octadécyle (ODS) dans la deuxième permettant une séparation intra-classe [47]. A l’heure actuelle, la chromatographie liquide à polarité de phase inversée (RPLC) demeure la technique la plus utilisée pour les séparations achirales. Cette dominance s’illustre notamment par le grand nombre de caractérisations et de classifications dédiées aux colonnes apolaires de type ODS [48-50]. Les techniques SFC et RPLC en phase aqueuse sont orthogonales en raison du rôle prédominant de l’eau dans le mécanisme RPLC. Le couplage bidimensionnel est un véritable avantage pour l’analyse de composés hautement hydrophobes [51]. Les triglycérides (TGs) sont les constituants majoritaires des huiles végétales et des graisses animales. La large diversité des chaines d’acides gras des TGs fait que l’analyse monodimensionnelle est parfois insuffisante. Le couplage SFC x RPLC génère une capacité de pics élevée due au degré d’orthogonalité important entre les deux techniques [52].
Les phases stationnaires disponibles en HPLC peuvent toutes être utilisées en SFC. Cependant, certaines phases sont développées pour une utilisation spécifique à la SFC [18]. La phase 2-éthylpyridine a été introduite par Princeton Chromatography. Elle est notamment utile pour l’analyse de composés basiques qui représentent une part importante des principes actifs développés et commercialisés dans l’industrie pharmaceutique [53]. L’efficacité de cette colonne repose peut-être sur le ligand 2-éthylpyridine qui se comporte comme protection stérique vis-à-vis des silanols résiduels [54] ou l’existence de liaisons hydrogènes intramoléculaires (silanol-azote de la pyridine) qui rend les silanols moins disponibles. Elle a maintenant été copiée par de nombreux autres fabricants de colonnes.
La SFC préparative
Lors du développement d’un candidat médicament (figure 1.4), la synthèse de la substance active peut résulter de voies de synthèses complexes. Isoler la molécule cible est primordial afin d’évaluer le profil pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique.
Diverses techniques sont disponibles et dépendent du profil d’impureté, de la solubilité de l’échantillon, de la sélectivité et des quantités à purifier, ainsi que de la productivité désirée : HPLC, SFC, SRR (steady-state recycling), SMB (simulated moving bed).
La chromatographie préparative « en batch » (injection/élution/collecte) a très vite été considérée comme un outil de support pour la synthèse, aux dépens de la cristallisation. En 1973, le chimiste R.B. Woodward déclare que « les méthodes de chromatographie liquide haute pression […] seront indispensables dans les laboratoires de chimie organique dans le futur. » [55].
Elle peut constituer un axe parallèle à la synthèse asymétrique pour améliorer la pureté énantiomérique. Alors que la synthèse stéréosélective de cyclopropanation [56] permet d’obtenir 77% d’excès énantiomérique (e.e.), associée à la prep-SFC la pureté énantiomérique est nettement améliorée et devient supérieure à 99%.
En raison de l’automatisation des étapes d’injection et de collecte, des économies d’énergie (l’étape d’évaporation est moindre), de solvant et de retraitement des déchets, la chromatographie en phase supercritique est devenue rapidement la méthode de choix pour les applications de purification du milligramme à plusieurs kilogrammes. White reporte l’implantation de la prep-SFC, en parallèle de la prep-LC, pour l’évaluation de la pureté énantiomérique et la purification chirale chez Eli Lilly. Après 12 mois, 96% des purifications sont réalisées en prep-SFC au dépend de la prep-LC en raison de la forte productivité associée à une économie sur les coûts opératoires estimée à 40 000 dollars par an [57]. De plus, les caractéristiques intrinsèques du fluide supercritique (faible viscosité et haute diffusivité) permettent de satisfaire les besoins de productivité. A travers la faible viscosité du fluide, les débits élevés peuvent être employés sans atteindre les pressions limites du système et sans perte significative d’efficacité. De plus, alors qu’en HPLC de larges diamètres de particules sont utilisés pour minimiser l’effet de la pression, en SFC, une même granulométrie de particules peut être employée aussi bien en analytique qu’en préparatif. Hamman et ses collaborateurs décrivent la purification de 100 mg de racémiques pharmaceutiques sur des phases stationnaires chirales (PSC) de dimensions 250 mm x 21,2 mm ; 5 µm et un débit de 70 ml/min [19].
La SFC préparative repose aussi sur les avantages d’une purification « verte » en utilisant du CO2 comme constituant majoritaire de l’éluant. Elle se place comme une solution pour remédier à l’utilisation de solvants organiques et diminuer les problèmes liés à l’élimination des déchets organiques.
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Table des matières
Introduction générale
Synthèse bibliographique
I. LES FLUIDES SUPERCRITIQUES ET LEUR EMPLOI EN CHROMATOGRAPHIE
1. HISTORIQUE
2. LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE DE NOS JOURS
2.1. Définitions
2.2. Les fluides supercritiques – Le dioxyde de carbone
2.2.1. Caractéristiques générales
2.2.2. Polarité du CO2
2.3. Des propriétés particulières
2.3.1. Viscosité
2.3.2. Pouvoir solvant
3. APPLICATIONS
3.1. Applications industrielles du CO2 supercritique
3.2. Approches chromatographiques
3.3. La SFC préparative
4. CONCLUSION
II. LA CHIRALITE
1. HISTORIQUE
2. LA STEREOCHIMIE
2.1. Définition
2.2. Propriétés
2.3. Nomenclature
2.3.1. Configuration absolue
2.3.2. Cas particulier des glucides et des acides aminés
3. CHIRALITE ET CHIMIE DU VIVANT
4. CHIRALITE ET DOMAINE PHARMACEUTIQUE
III. LES SEPARATIONS ENANTIOSELECTIVES
1. AVANT-PROPOS
2. LES PHASES STATIONNAIRES CHIRALES
2.1. Généralités
2.2. Les phases stationnaires chirales de type Pirkle
2.3. Les phases stationnaires chirales de type polysaccharide
2.3.1. Contexte
2.3.2. Cellulose triacétate
2.3.3. Optimisation des polysaccharides : nature et morphologie du support
2.3.4. Optimisation des polysaccharides : procédé du dépôt
2.3.5. Optimisation des polysaccharides : nature du ligand
2.3.6. Optimisation des polysaccharides : technique d’immobilisation
2.4. Les phases macrocycliques
2.4.1. Les cyclodextrines
2.4.2. Les cyclofructanes
2.4.3. Les Glycopeptidiques Macrocycliques
IV. CONCLUSION ET INTRODUCTION DES TRAVAUX DE RECHERCHE
Chapitre II
I. UNE STRATEGIE CHEMOINFORMATIQUE
1. LES RELATIONS QUANTITATIVES STRUCTURE-RETENTION
2. APPLICATION AUX SEPARATIONS CHIRALES
3. ANALYSE FACTORIELLE DISCRIMINANTE
II. APPLICATION DE LA STRATEGIE CHEMOINFORMATIQUE A LA CARACTERISATION DE PHASES STATIONNAIRES DE TYPE POLYSACCHARIDE
ARTICLE N°1: IN-DEPTH CHARACTERIZATION OF SIX CELLULOSE TRIS-(3,5- DIMETHYLPHENYLCARBAMATE) CHIRAL STATIONARY PHASES IN SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY
ARTICLE N°2: INSIGHTS INTO CHIRAL RECOGNITION MECHANISM IN SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY III. NON-HALOGENATED POLYSACCHARIDE STATIONARY PHASES
ARTICLE N°3: INSIGHTS INTO CHIRAL RECOGNITION MECHANISM IN SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY IV. CHLORINATED POLYSACCHARIDE STATIONARY PHASES
III. APPLICATION DE LA STRATEGIE CHEMOINFORMATIQUE A LA CARACTERISATION D’AUTRES CHIMIES DE PSC
REFERENCES DU CHAPITRE II
Chapitre III
I. PREAMBULE
II. INFLUENCE DU MODIFICATEUR EN SFC CHIRALE
ARTICLE N°4: INSIGHTS INTO CHIRAL RECOGNITION MECHANISM IN SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY V. EFFECT OF THE NATURE AND PROPORTION OF ALCOHOL MOBILE PHASE MODIFIER WITH POLYSACCHARIDE STATIONARY PHASES
III. COMPARAISON DES PHASES MOBILES LIQUIDES ET SUPERCRITIQUES
1. INTRODUCTION
2. RESULTATS
2.1. Propriétés de rétention
2.1.1. Résultats préliminaires
2.1.2. Etudes détaillées des propriétés de rétention
2.1.3. Force éluante
2.2. Propriétés de séparation
3. CONCLUSION
IV. INFLUENCE DES ADDITIFS SUR LES SEPARATIONS CHIRALES EN SFC
1. INTRODUCTION
2. RESULTATS
3. CONCLUSION
RÉFÉRENCES DU CHAPITRE III
Chapitre IV
I. PREAMBULE
II. CARTOGRAPHIE RETENTIVE
III. CARTOGRAPHIE SEPARATIVE
IV. CONCLUSIONS
REFERENCES DU CHAPITRE IV
Chapitre V
I. PREDICTION DE LA RETENTION D’APRES L’APPROCHE LSER
II. PREDICTION DE LA SEPARATION
Conclusion générale
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Soutenance mémoire
