Soutenance mémoire
LES VARIETES DE Zea mays L CULTIVES A MADAGASCAR
Nombreuses sont les variétés cultivées de Zea mays L à Madagascar (DJIDO 1986, RABENANTOANDRO etal 199). En 1994, Le Centre National de Recherche Appliquée au Développement Rural (FOFIFA) a recensé 371collections de Zea mays L. Citons quelques unes :
« Meva » : un polyhybride 374 de nature génétique synthétique constitué de 5 lignées jaunes d’Afrique du Sudet d’une lignée d’origine locale. Les graines sont de couleur jaune semi dentée. Cette variété résiste aux maladies ettolère le sol acide. Elle pousse à une altitude comprise entre 700 et 1500m.
« Tombontsoa » : Il s’agit une variété de Zea mays vulgarisée par le centre agricole Tombontsoa Antsirabe.Elle est caractérisée par des graines jaunes claires de grande taille utilisée surtout en provenderie.
« Volasoa » : ou Los Banos 82.27 de nature génétique composite des Philippines. Cette variété peut atteindre2,3 m de hauteur. Elle est caractérisée par une longueur de l’épi pouvant atteindre 110 cm, produisant une graine dequalité de couleur orange et poussant vers 800 m d’Altitude.
« NTS 88 » : Cette variété composite d’origine zimbabwéenne est caractérisée par une graine de couleurblanche à texture dentée de taille moyenne.
« Paysannes » : ce sont des variétés locales de Maïs qui sont obtenues à partir de sélections répétées par lespaysans à chaque récolte.
Tithonia Desf (ex Helianthus annuus)
Des études ont été déjà faites par RAMAVOVOLOLONA 1998 sous le nom Helianthus annuus. 31 % despatients ont été allergique au pollen de cette espèce. Tous ces malades ont reconnu l’allergène majeur (Hel a 1, Hel a 2, Hel a 3) et les sujets allergiques à ses pollens sont également allergiques aux autres Gramineae. C’est une plante rudérale, herbacée annuelle de 2 à 3 m de hauteur de la Famille des Asteraceae d’origineaméricaine introduite à Madagascar et qui occupe des terrains accidentés à sol humifères des hauts plateaux. Elle estcommunément appelée « Tournesol de Mexique » (MABBERLEY 1997). Sur la partie supérieure de la plante, les feuilles sont alternes contrairement à celles qui se trouvent en dessous,elles sont opposées. Ce sont des feuilles acuminées longuement pétiolées. L’appareil reproducteur est constitué d’une inflorescence en capitule radiée représentée sur la Photo 6(fleurons tubulés au centre ; fleurons ligulés en périphérie), les bractées sont foliacées sur plusieurs rangs. Les fleursPhoto 5 : Pore operculé deZea mays centrales sont hermaphrodites et fertiles, les corolles constituées par un tube court de couleur jaune. Chaque fleur estconstituée par un androcée synanthéré. Les fleurs périphériques par contre sont stériles et à corolle large de couleurjaune. Les fruits sont constitués par des akènes. D’après RAMAVOVOLOLONA 1998, les pollens de Tithonia sp sont isopolaires, subcirculaire en vueméridienne et vue polaire. L’aperture est constituée par 3 colporus. L’exine est échinulée, les épines sont longues,pointues et élargies à la base, structurées dans le tiers inférieur. L’exine est perforée et le diamètre des perforations estplus grand à la base des épines.
DOSAGE DES PROTEINES POLLINIQUES
Pour induire une réponse immunitaire satisfaisante (FROPPIER, LENOIR 2000), le lapin doit être immuniséavec une solution équivalente entre 500 à 1 500 µg de protéines par injection. Pour cela, une méthode de dosage desprotéines est nécessaire. Ce dosage permet également d’apprécier les variations de la quantité de protéines polliniquesexprimant l’antigénicité et l’allergénicité des pollens (KNOX, HESLOP, HARRISON 1971, 1981). Le dosage protéique des extraits solubles de pollens a été fait suivant la méthode de BRADFORD (1952). Ils’agit d’une méthode colorimétrique à base de Bleu de Coomassie avec la SAB (Sérum Albumine Bovine) commeprotéine de référence. La composition des solutions utilisées est donnée en Annexe I. La lecture de la densité optique de l’extrait à doser additionné de PBS (Phosphate Buffered Saline) et decolorant (Bleu de Coomassie) se fait à la longueur d’onde de 595 nm. Les valeurs des quantités de protéines serontdéterminées à partir de la gamme étalon de SAB (Sérum Albumine Bovine) : Annexe II. Cette technique a permis également d’évaluer les variations au niveau du contenu protéique des pollens avantet après l’exposition du pollen avec la pollution de l’air dans le tunnel d’Ambohidahy. Les pollens exposés sont ceuxde Zea mays L., Tithonia sp, Cupressus, Cryptomeria japonica T.
TECHNIQUE D’ISOELECTROFOCALISATION (I.E.F)
C’est une technique d’électrophorèse pour séparer les protéines suivant leur charge dans un gradient de pH. Les molécules soumises à unchamp électrique, et dans un gradient de pH créé par les ampholytes, migrent jusqu’à ce qu’elles atteignent leur point isoélectrique pI (pHoù la charge de la molécule est égale à 0). Dans notre cas, la technique consiste à séparer en parallèle sur un même gel des extraits solubles de pollens natifs et pollués. L’appareil est constitué d’un générateur, d’un thermostat et d’une cuve de séparation horizontale. Sur le gel d’Agarose de 12 x 12 cm, 50 µl de l’extrait de pollen ont été déposés sur une ligne de départ parallèle à l’anode, à 1 cm. (Annexe V) La migration s’effectue pendant une heure et demi sous le courant électrique à puissance constante et quand le voltage augmente, l’ampérage diminue. La focalisation est arrêtée par coupure du courant électrique puis le gel contenant les échantillons prêts est récupéré pour une colorationpar du bleu de Coomassie.
TRAITEMENT CHIMIQUE DES FILTRES
Le support de gaze (filtre) contenant les échantillons est d’abord solubilisé par de l’acide sulfurique pur(H2SO4) puis défloculé par du triton 2%. Les grains de silice (sables) sont éliminés pendant 24 h par de l’Acide Fluorhydrique 40% (FH) et lesFluorosilicates, par de l’acide chlorhydrique 37% (HCl). Le tout est dilué à nouveau par du triton. Les traces d’eau sont éliminées ensuite par de l’acide acétique pur. Une solution contenant uniquement les particules cibles est obtenue. Celles-ci sont prêtes pour la méthoded’acétolyse d’Erdtman 1952. Avec le culot obtenu, 9 volumes d’anhydride acétique est mélangé pur par 1 volume de H2SO4 pur. Lemélange acétolysant est soumis ensuite pendant 3 mn au bain marie. La réaction est arrêtée en versant sur lemélange de l’acide acétique glacial avant une centrifugation. Le culot ainsi récupéré est agité, rincé avec del’eau glycérinée à 30% Enfin, les culots sont soumis à un égouttage pendant 24 heures, culots contenant les particules retenues par lesfiltres.
DOSAGE DE LA QUANTITÉ D’ANTICORPS PAR ELISA
La quantité d’anticorps produite par le lapin pour chaque injection a été mesurée par le biais de la densitéoptique et en fonction de la dilution du sérum. Les valeurs de la densité optique à 492 nm (Annexe IX) après ELISA provenant du spectrophotomètreMultiscan Plus, sont lues par le logiciel Multiscan Transmit puis traité par Microsoft Excel. D’après les courbes, la quantité d’anticorps formée après la première injection est très faible, se trouvantpresque au même niveau que celle du témoin négatif (sérum de lapin sans immunisation). Après une deuxième immunisation, la densité optique est à un niveau nettement supérieur par rapport à cellede la première injection ; celle-ci atteint la valeur maximale après une troisième injection. On obtient les mêmes DO avec le troisième qu’avec le deuxième sérum mais le troisième étant dilué 10 foisplus que le second. Cela signifie que le sérum de la dernière saignée contient 10 fois plus d’anticorps spécifiques antiextrait de pollen de Zea mays L. que celui de la deuxième saignée Il y a donc production d’Anticorps au cours de l’immunisation du lapin. Cela veut dire que, le lapin répondparfaitement à son immunisation par de l’extrait soluble de pollen de Zea mays L. Les réponses (quantités d’anticorpsproduits) augmentent de la première à la troisième injection, mais surtout de la seconde à la troisième injection.
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Table des matières
INTRODUCTION
GENERALITES
I. DEFINITIONS EN IMMUNOLOGIE
II. INTERRELATION POLLUTION DE L’AIR MÉCANISMES D’ALLERGIE
Première partie : PRÉSENTATION DU ATION DU MATÉRIEL VÉGÉTAL
I. Zea mays Linnaeus
1. LES VARIETES DE Zea mays L. CULTIVES À MADAGASCAR
2. CARACTERES BOTANIQUE ET PALYNOLOGIQUE
2.1. ASPECT BOTANIQUE de Zea mays L
a. CARACTERES DES ORGANES VEGETATIFS
b. CARACTERES DES ELEMENTS REPRODUCTEURS
2.2. LA PÉRIODE DE FLORAISON DE Zea mays L
2.3. LE POLLEN DE Zea mays L
II. OBSERVATION PHÉNOLOGIQUE SUR Zea mays L
III. LES AUTRES TAXONS POLLINIQUES
1. Tithonia Desf (ex Helianthus annuus)
2. Cupressus Linnaeus
3. Cryptomeria japonica (Thunberg ex Linnaeus f.)
Deuxième partie : MÉTHODOLOGIE
I : REACTIONS ANTIGENE – ANTICORPS DES EXTRAITS SOLUBLES DE POLLENS DE Zea mays L
1. RÉCOLTE DE POLLENS ET PRÉPARATION DES EXTRAITS POLLINIQUES
a. RECOLTE ET CONSERVATION DES POLLENS
b. PRÉPARATION DES EXTRAITS DE POLLENS
2. IMMUNISATION DES LAPINS
a. DOSAGE DES PROTEINES POLLINIQUES
b. LES DIFFERENTES ETAPES DE L’IMMUNISATION
3. COLLECTE ET CONSERVATION DES IMMUNSERUMS
4. DOSAGE DE LA PRODUCTION D’ANTICORPS
a. TECHNIQUE D’OUCHTERLONY
b. TECHNIQUE E.L.I.S.A
II : ETUDES DES EFFETS DES POLLUANTS ATMOSPHERIQUES SUR LES LES ANTIGENES POLLINIQUES
1. EXPOSITION EXPERIMENTALE DES POLLENS A LA POLLUTION ATMOSPHERIQUE
2. SEPARATION ELECTROPHORETIQUE DE POLLENS NATIFS ET POLLUES
a. TECHNIQUE D’ISOELECTROFOCALISATION (I.E.F)
b. COLORATION DU GEL AU BLEU DE COOMASSIE
III. DISPERSION POLLINIQUE ET DES POLLUANTS ATMOSPERIQUES DANS LA REGION D’ANTSIRABE
1. CHOIX DU SITE DE PRELEVEMENT DE PARTICULES
2. LE PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS
a. DESCRIPTION DU MATERIEL DE PRELEVEMENT
b. FICHE DE RELEVE
3. TRAITEMENT CHIMIQUE DES FILTRES
4. ANALYSES AEROPALYNOLOGIQUES DES PARTICULES RECOLTES
a. MESURE VOLUMETRIQUE DES CULOTS
b. CONFECTION DES PREPARATIONS MICROSCOPIQUES
c. ZONATION DE LA LAME ET IDENTIFICATION DES PARTICULES
Troisième partie : RESULTATS
I. PRODUCTION D’ANTICORPS CHEZ LES LAPINS
1. FORMATION DU COMPLEXE ANTIGENE ANTICORPS
2. DOSAGE DE LA QUANTITÉ D’ANTICORPS PAR ELISA
II. EFFET DE LA POLLUTION DE L’AIR SUR LA COMPOSITION PROTÉINIQUE DES EXTRAITS DE POLLENS
1. SÉPARATION ELECTROPHORETIQUE DES EXTRAITS DE POLLENS NATIFS ET EXPOSÉS À LA POLLUTION DE L’AIR DE Zea mays L
2. VARIATION DES QUANTITES DES PROTEINES POLLINIQUES APRÈS EXPOSITION A LA POLLUTION DE L’AIR
III. DISPERSION DES AEROSOLS SUPERIEURS A PM10 DANS LA RÉGION D’ANTSIRABE
1. EVALUATION QUANTITATIVE DES CULOTS
2. COMPOSITION DES CULOTS EN PARTICULES BIOLOGIQUES
3. LES PARTICULES DIESEL
DISCUSSION
RECOMMANDATION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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