Soutenance mémoire
Par : REFOUFI KHALIL ABDALLAH
Pour l’obtention du diplôme de MASTER EN BIOLOGIE
Filière: Biologie
Spécialité: Microbiologie Appliquée
Depuis la découvert des antibiotiques en 1928 par Alexander Fleming et dés leur utilisation durant la seconde guerre mondiale, les antibiotiques de la famille des β-lactamines ont été confrontés à l’émergence de la résistance. Cependant, la résistance bactérienne aux antibiotiques est en perpétuelle évolution. Cette résistance est la résultante d’interactions complexes entre la bactérie d’une part et son environnement d’autre part. Elle est liée essentiellement à un usage excessif des antibiotiques aussi bien en médecine humaine, qu’en médecine vétérinaire ou dans l’alimentation animale (Bradford. 2001b). Les bactéries, pour faire face à la pression de sélection exercée par les antibiotiques utilisent des parades leur permettant de s’adapter aux conditions hostiles de leur environnement (Benredjeb et al. 2000). Selon le rapport de l’OMS en 2014, sur la surveillance mondiale de la résistance aux antimicrobiens, la résistance aux antibiotiques est une réalité existant partout dans le monde et constitue désormais une grave menace pour la santé publique (Anonyme. 2014). En effet, on assiste à l’émergence et à la dissémination des bactéries multirésistantes par hyperproduction de céphalosporinase (AmpC) ou production de bêtalactamases à spectre élargi (BLSE) ou encore de carbapénémases. Jusque dans les années 2000, la diffusion des entérobactéries productrices de BLSE concernait essentiellement le milieu hospitalier, de nombreuses épidémies hospitalières en réanimation ou en hospitalisation de longs séjours ayant été décrites. Mais aujourd’hui, la diffusion à grande échelle dans le domaine communautaire de ce type de résistance laisse augurer un problème majeur de santé publique. Les infections causées par les souches productrices de BLSE sont associées à une morbidité et une mortalité élevées, à une prolongation de la durée de l’hospitalisation et à une augmentation des coûts d’hospitalisation. Découvertes au début des années 1980, les BLSE sont une grande famille d’enzymes bactériens capables d’hydrolyser les pénicillines, les quatre générations de céphalosporines et l’aztréonam. Elles n’hydrolysent pas les carbapénèmes ni les céphamides. Elles sont retrouvées essentiellement dans la famille des entérobactéries, principalement Escherichia coli et Klebsiella spp. (Bradford, 2001a). La plupart des BLSE détectées auparavant étaient les types classiques TEM et SHV qui diffusaient majoritairement chez des souches de Klebsiella pneumoniae et d’Enterobacter spp étroitement associés à des infections nosocomiales. Actuellement, un nouveau type d’enzyme, le CTX-M dissémine au sein des souches communautaires. Les gènes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA ont été décrits dans plusieurs études épidémiologiques. La résistance bactérienne par production de BLSE est devenue un problème de santé publique mondiale car compromettant gravement les thérapies antimicrobiennes.
Les entérobactéries
Définition
Les entérobactéries sont des bactéries commensales ou pathologiques du tube digestif de l’homme et des animaux, d’où leur nom (entéro= intestin grêle). Elles peuvent être transitoirement présentes, en dehors du tube digestif, sur différentes parties du revêtement cutanéo-muqueux (Nauciel et Vildé. 2005) et également dans l’environnement. Certaines sont des pathogènes obligatoires provoquent dès leur entrée dans le tube digestif des malades. D’autres, présentent un caractère opportuniste, elles ne sont pathogènes que sur fond d’immunodépression. D’autres groupes prolifèrent dans l’environnement et peuvent être une source de contamination (Grosjean et al. 2011).
Classification
La position phylogénétique de la famille des Enterobacteriaceae se trouve dans l’ordre des Enterobacteriales de la classe des Gammaproteobacteria. Cette famille comprend 176 espèces nommées ou plus, répertoriées en 44 genres (Garrity et al. 2005), dont les plus récents sont Alterococcus, Arsenophorus, Brenneria, Pectobacterium, Raoultella, Samsonia et Sodalis. Les relations phylogénétiques des genres sont fondées sur l’analyse des séquences de l’ARNr 16S des souches types de l’espèce (Garrity et al. 2005).Les genres de cette famille sont regroupés en cinq tribus, d’après leurs propriétés fermentatives : Escherichiae, Klebsielleae, Proteae, Yersiniae et Erwiniae.
Caractères bactériologiques
Les Enterobacteriaceae sont des bacilles à Gram négatif mobiles ou immobiles, avec des extrémités arrondies de 0.5- 1.5 μm d’épaisseur et 2-4 μm de longueur, parfois capsulés. Leurs exigences nutritionnelles sont, en général, réduites se développent bien dans un bouillon ou sur gélose ordinaire incubés 18 heures à 37°C. Sur milieu gélosé, ils peuvent donner différentes formes de colonies. Les formes S (smooth) sont l’aspect habituel des colonies lisses, bombés, brillantes et humides. Les formes R (rough) s’observent surtout avec les souches ayant subi plusieurs repiquage où les colonies sont rugueuse, sèches, à contours irréguliers et de teinte mate (Avril et al. 2000).
Caractères biochimiques
L’identification des Enterobacteriaceae repose sur l’étude des caractères biochimiques. Elles donnent une réaction d’oxydase négative, acidifient le glucose par métabolisme fermentatif, avec ou sans production de gaz et réduisent les nitrates en nitrites. Des galeries biochimiques permettent de déterminer avec précision le genre et l’espèce, se basant sur :
● Production d’hydrogène sulfuré
● Recherche de l’uréase.
● Production d’indole.
● Recherche des décarboxylases.
● Recherche des désaminases oxydatives.
● Utilisation du citrate.
● Utilisation du mannitol.
● Recherche de l’acétoïne ou réaction Voges-Proskauer (VP).
● Test à l’ONPG (Orthonitrophényl b-D-Galactopyranoside).
Caractères antigéniques
L’identification des antigènes et sérogroupes a permis de différencier les souches pathogènes des souches commensales. En effet, certains sérotypes ne sont jamais, ou rarement, associés à des maladies tandis que d’autres le sont très fréquemment. L’antigène somatique O, définissant le sérogroupe, est contenu dans les lipopolysaccharides présents sur la paroi bactérienne. L’antigène flagellaire H est de nature protéique entrant dans la structure du flagelle permettant la mobilité de la bactérie. L’antigène de surface K est présent de façon inconstante il bloque l’agglutinabilité de l’antigène O qui peut être restituée après chauffage de la souche à 100°C car il est détruit par ébullition. Les antigènes de surface aussi appelés antigènes de capsule ou d’enveloppe sont appelés « Vi » chez Salmonella (Avril et al. 2000).
Pouvoir Pathogène
Les entérobactéries occupent une place très importante en pathologie humaine infectieuse. Cette importance s’explique aussi bien par la variété des espèces bactériennes qui les composent qu’à leur incidence au niveau de la santé des populations. Les Enterobacteriaceae forment une vaste famille de bactéries qui sont à l’origine de maladies de gravité très variable, en raison de mécanismes pathogéniques distincts. La fréquence et la gravité des infections, dont elles sont responsables (septicémies, infections nosocomiales, méningites…), traduisent des difficultés de prise en charge liées entre autres à des difficultés d’identification et à leur résistance aux antibiotiques. On les rencontre dans les prélèvements d’origine divers, mais particulièrement dans les urines et les prélèvements sanguins qui constituent une part très importante des activités du laboratoire de bactériologie. Les entérobactéries constituent plus de 80% des germes isolés en laboratoire : Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morganella et Yersinia sont les bactéries les plus souvent retrouvés.
Escherichia coli est un germe très courant. Son habitat est le colon humain où il est le plus abondant. Chez l’homme, la colonisation par E. coli est précoce, et peut être responsable d’un nombre varié de pathologie. Toutefois, trois types de syndromes majeurs résultent de l’infection par de souches E. coli pathogènes :
– Infections urinaires (impliqué dans 80 % des infections urinaires), l’incidence de ces infections est plus marquée chez les personnes de sexe féminin en milieu extrahospitalier en raison notamment de la colonisation de la région péri-urétrale. En milieu hospitalier, l’incidence est égale entre les deux sexes en rapport essentiellement avec l’utilisation fréquente des sondes urinaires.
– Infections digestives (diarrhées, infections hépatobiliaires et autres), E. coli cause principalement des infections du tractus digestif, en raison de la contamination de l’eau ou des aliments par la flore fécale des malades ou des porteurs. E. coli est subdivisé en 6 pathovars majeurs selon le type de maladie engendrée et les facteurs de virulence associés : les ETEC (E. coli Entérotoxinogènes), les EHEC (E. coli Entérohémorragiques), les EPEC (E. coli Entéropathogènes), les DAEC (E. coli à Adhérence Diffuse), les EAEC (E. coli Entéroagrégatives) et les EIEC (E. coli Entéroinvasives) (Avril et al.2000).
– Méningites néonatales et septicémies, E. coli à l’origine de maladies extra- intestinales, a acquis la capacité de déjouer les défenses immunitaires de l’hôte, et à se propager dans l’organisme et il peut coloniser les voies génitales et générer des méningites néonatales.
Klebsiella pneumoniae habite le tractus digestif et le système respiratoire supérieur. Ce germe est principalement isolé en milieu hospitalier, le portage étant fortement accru chez les patients hospitalisés. Toutefois, il est également présent en dehors des hôpitaux, notamment chez des patients diabétiques, fortement débilités, ou souffrant de maladies respiratoires chroniques. Klebsiella pneumoniae peut causer des pneumonies lobaires, des bronchites et broncho-pneumonies, la contamination pulmonaire se faisant surtout par voie aérienne, mais la voie hématogène n’étant pas exclue. Klebsiella pneumoniae est également retrouvé dans des infections urinaires suite au passage de la flore fécale aux voies urinaires. Finalement, des bactériémies compliquent parfois les infections localisées.
Klebsiella oxytoca est une bactérie isolée dans la majorité des cas dans les selles, mais peut aussi être isolée dans les urines, le sang et les sécrétions naso-pharyngées et trachéales. A l’instar de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca peut infecter les voies urinaires et respiratoires des patients hospitalisés.
Salmonella constitue un vaste groupe de bactéries, composé de plus de 2000 variétés, et subdivisé en deux sous-groupes. Le premier comprend les Salmonella dites majeures qui causent les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes dues à la transmission féco-orale, l’eau ou la nourriture étant contaminées par les selles d’un malade ou d’un porteur sain. Le second est composé des Salmonella dites mineures qui sont à l’origine d’intoxications alimentaires (aliments provenant d’animaux infectés ou contaminés ; viande, produits laitiers…), de gastro-entérites et de bactériémies.
Enterobacter cloacae est un germe colonisant souvent les patients hospitalisés et plus particulièrement ceux traités par antibiotiques. Il a été associé à des épidémies nosocomiales et est considéré comme pathogène opportuniste (Hart. 2006). Il peut causer de nombreux types d’infections, y compris abcès cérébraux, pneumonie, méningite, septicémie et infection de plaies, infection des voies urinaires et des infections de la cavité abdominale ou des intestins (Farmer et al. 2007). De plus, il a été observé dans des infections liées à des appareils intra-vasculaires et des infections au point de chirurgie (surtout des infections postopératoires ou liées à des dispositifs comme des prothèses biliaires).
Serratia marcescens colonise les systèmes respiratoires, digestifs et urinaires des patients. Bien que les germes isolés en milieu hospitalier soient le plus souvent responsables d’une colonisation asymptomatique, quelques infections nosocomiales sont relatées dans la littérature: ce sont essentiellement des bactériémies, des infections des voies respiratoires inférieures, des infections urinaires et cutanées. Ces infections sont dues à des germes qui proviennent des patients eux-mêmes ou de leur environnement (Mirabaud. 2003). Citrobacter freundii est un agent pathogène nosocomial opportuniste rare, qui entraîne normalement des infections des voies urinaires, des bactériémies, des sepsis abdominaux et des abcès cérébraux ainsi que des pneumonies et d’autres infections néonatales (Pepperell et al. 2002).
Les β-lactamines
Les β-lactamines demeurent les antibiotiques les plus utilisés dans la pratique clinique courante. Cette large utilisation est principalement liée à leur faible toxicité, à leur pouvoir bactéricide et à la diversité des molécules (Robin et al. 2012). L’histoire des ß-lactamines débute depuis l’introduction de la pénicilline G en thérapeutique dans les années 1940.Il faudra attendre le début des années 1960 pour voir apparaître les premières synthèses de ß-lactamines permettant leur développement à l’échelle industrielle. Un grand nombre de molécules incluant les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénémes a été développé. Cependant, la grande utilisation des ßlactamines depuis plus de 60 ans s’est accompagnée d’une augmentation importante de la résistance bactérienne à ces antibiotiques. D’autre part, le développement de nouveaux antibiotiques connaît un franc ralentissement depuis plus de 10 ans (Robin et al. 2012). Cette famille est caractérisée par la présence constante de cycle β-lactame associé à des cycles et des chaînes latérales variables expliquant les propriétés pharmacocinétiques et le spectre d’activité des différents produits (Cavallo et al. 2004).
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Table des matières
Introduction
CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1-Les entérobactéries
1-1-Définition
1-2-Classification
1-3-Caractères bactériologiques
1-4-Caractères biochimiques
1-5-Caractères antigéniques
1-6-Pouvoir Pathogène
2-Les β-lactamines
2-1-Classification des β-lactamines
2-1-1-Les pénicillines (noyau péname)
2-1-2-Les céphalosporines (noyau céphème)
2-1-3-Les pénèmes (Carbapénèmes)
2-1-4-Les monobactames
2-1-5-Les inhibiteurs des β-lactamases
2-2-Mode d’action des β-lactamines
3-Résistance des entérobactéries aux β-lactamines
3-1-Types de résistance
3-1-1-La résistance naturelle
3-1-2-La résistance acquise
3-2-Supports génétiques de la résistance
3-2-1-Le chromosome
3-2-2-Les éléments génétiques mobiles
a) Plasmides
b) Séquences d’insertion et transposons
c) Les intégrons
3-3-Mécanismes de résistance aux β-lactamines
3-3-1-Diminution de la perméabilité
3-3-2-Modification de la cible
3-3-3-Hyperproduction du système d’efflux
3-3-4-Production d’enzymes
4-Les β-lactamases
4-1-Classification des β-lactamases
4-1-1-Classification d’Ambler
4-1-2-Classification de Bush-Jacoby-Medeiros
5-Les β-lactamases à spectre élargi BLSE
5-1-Différents types de BLSE
5-1-1-BLSE de type TEM (Temoneira – nom du patient)
5-1-2-BLSE de type SHV : (Sulfhydryl variable)
5-1-3-BLSE de type CTX-M (Cefotaximase-Munich)
5-1-4-Autres types de BLSE
5-1-5-Les Carbapénèmases
a)Classification des carbapénèmases
6-Epidémiologie mondiale des entérobactéries BLSE
6-1-Les BLSE classiques
6-1-1-En Europe
6-1-2-En Afrique
6-1-3-En Asie
6-1-4-En Amérique
6-2-Les BLSE de type carbapénèmases
7-Facteurs de risque d’acquérir une BLSE
CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES
1-Prélèvement et identification
1-1-La mini galerie (galerie classique)
1-2-La galerie Api 20E
1-3-Le systeme MicroScan WalkAways SIEMENS
2-Antibiogramme
3-Détection phénotypique des EBLSE
3-1-Test de synergie
3-2-Test du double disque
3-3-Test à la cloxacilline
4-Détection génotypique des EBLSE
4-1-Extraction d’ADN plasmidique par la lyse alcaline
a) Extraction d’ADN
b) Extraction de l’ADN chromosomique par Boiling
4-2-Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)
4-2-1-Principe
4-3-Electrophorèse sur gel d’agarose
CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION
Résultats
1-Entérobactéries
1-1-Répartition des entérobactéries par espèces
1-2-Répartition des entérobactéries selon l’origine de l’infection
1-3-Pourcentage des entérobactéries selon le sexe
1-4-Répartition des entérobactéries selon les tranches d’âge
1-5-Profil de résistance des entérobactéries aux antibiotiques
1-6-Profil de résistance des entérobactéries aux antibiotiques par année
a) Résistance aux β-lactamines
b) Résistance aux autres antibiotiques
2-Les EBLSE
2-1-Fréquence d’isolement des EBLSE
2-2-Répartition des EBLSE selon l’espèce
2-3-Répartition des EBLSE selon l’origine de l’infection
2-4-Répartition des EBLSE selon le service
2-5-Répartition des EBLSE selon la nature du prélèvement
2-6-Répartition des EBLSE selon le sexe
2-7-Profil de résistance des EBLSE
2-7-1-Résistance aux β-lactamines
2-7-2-Résistance aux aminosides
2-7-3-Résistance aux quinolones
2-7-4-Résistance aux autres antibiotiques
3-Support génétique de la résistance
4-Caractérisation des BLSE par la PCR-multiplex
4-1-BLSE de type CTX-M
4-2-BLSE de type SHV
4-3-BLSE de type TEM
4-4-Résistances multiples
Discussion
Conclusions et Perspectives
Références bibliographique
Annexe
Mots clés : Entérobactéries, BLSE, plasmides, PCR-multiplex.
