Anthropisation des estuaires, cas de l’estuaire de la Seine

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Caractéristiques des sites d’étude et stratégie d’échantillonnage

Le bassin versant de la Risle

Dans le cadre de cette étude, quatre sites ont été échantillonnés dans le bassin versant de la Risle (Tableau II-1, Figures II-1A et B), lui-même localisé au niveau de la rive sud du bassin versant intra-estuarien de la Seine, le long d’un continuum « exploitation agricole – STEP (station d’épuration) – milieu récepteur (rivière) ». Le premier site de prélèvements (V1) est localisé dans la Selles, cours d’eau au niveau duquel aucune STEP n’est installée, à 500 m l’aval d’une exploitation de 500 bovins pratiquant une agriculture raisonnée (faible consommation d’antibiotiques ; Oberlé, 2012). La Selles est un petit cours d’eau d’ordre 1 selon la classification de Strahler (cf. lexique). Les trois sites de prélèvements suivants (V2, V3 et V4) sont localisés dans la Risle, à l’aval de la STEP de Pont-Audemer. La Risle est un cours d’eau d’ordre de Strahler 4 et la Seine est d’ordre 8.
Les prélèvements de sédiments ont été effectués le 5 juillet 2013. Une carotte sédimentaire de 12 cm de profondeur a été prélevée au niveau de chacun des sites. Chaque carotte de sédiment à été sous-échantillonée en quatre tronçons de 3 cm chacun. Les 16 tronçons de sédiments ont été stockés à -80°C. En plus des carottes sédimentaires, des sédiments de surface (crème de vase) ont été prélevés au niveau de chaque site de prélèvements à l’aide de falcons stériles de 50 mL. Ces sédiments correspondent approximativement à une profondeur 0-1 cm. Ils ont été utilisés pour les analyses microbiologiques (cf. §4) le jour même de la campagne de prélèvements.

La darse des Docks

Une carotte sédimentaire de 4,8 m de profondeur (Figure II-1E et II-2A) a été prélevées par carottage dans la darse des Docks (Figure II-1), située dans l’estuaire fluvial de la Seine, à onze kilomètres en aval du centre ville de Rouen dans le cadre du projet RHAPSODIS (Reconstitution de l’Historique des Apports Particulaires à la Seine par l’Observation De leur Intégration Sédimentaire, Boust et al., 2012) dans le cadre du programme Seine-Aval. Il s’agit d’une zone de décantation de particules fines présentant une faible profondeur d’eau. Ce site a été choisi car les sédiments ont été peu remaniés (pas de dragage).
Figure II-1. Estuaire de la Seine et sites de prélèvements. A. Estuaire de la Seine et localisation des deux campagnes de prélèvements : Partie aval du bassin versant de la Risle (encadrée en marron) et darse des Docks (encadrée en bleu) (GIP-SA, 2015). B. Localisation des quatre sites de prélèvement dans la partie aval du bassin versant de la Risle (Google Maps). C. et D. Localisation de la darse des Docks et du site de prélèvement de la campagne RHAPSODIS 2008 (site 2) (Geoportail, Boust et al., 2012). E. Photo de l’un des tronçon de la carotte de vase consolidée prélevée dans la darse des Docks (Boust et al., 2012).
Les campagnes de prélèvements ont été réalisées du 7 au 9 avril 2008 et plusieurs carottes ont été prélevées sur deux sites de la darse des Docks : une carotte superficielle de vase molle (VM) et une carotte de sédiments consolidés (VC). Les carottages ont été doublés sur chacun des sites. Les carottes de vase molle ont été prélevées à l’aide d’un carottier de type Amaury et celles de vase consolidée à l’aide d’un carottier à percussions. Les premières carottes du site 2 ont été retenues et la carotte 2VC1 fractionnée en trois tronçons (Figure II-2A). Enfin, ces quatre tronçons (la carotte VM et les trois tronçons VC) ont été fractionnés en échantillons de 5 cm de hauteur dont 16 qui ont été sélectionnés pour la suite des analyses. Le détail des campagnes de prélèvements sont présentés dans les manuscrits de thèse d’Assia Kaci (Kaci, 2014) et d’Anne Vrel (Vrel, 2012) et le rapport final du projet RHAPSODIS (Boust et al., 2012). La reconstitution du profil de la carotte sédimentaire à partir des carottes VM et VC a été possible grâce à la mesure de la teneur en eau (Figure II-2B). Cette reconstitution a été validée et affinée par de nombreuses données : la datation réalisée par l’analyse des radionucléides et l’analyse d’images SCOPIX® notamment (Boust et al., 2012 ; Vrel, 2012)

Analyse de la contamination chimique de la carotte sédimentaire prélevée dans la darse des Docks

Dans le cadre du projet RHAPSODIS, de nombreux contaminants ont été analysés dans la carotte sédimentaire prélevée dans la darse des Docks. L’analyse de 46 métaux et métalloïdes stables a été réalisée au laboratoire SARM-CRPG de Nancy selon différentes méthodologies décrites dans les manuscrits de thèse d’Assia Kaci (Kaci, 2014) et d’Anne Vrel (Vrel, 2012). L’analyse des contaminants organiques a été réalisée par le laboratoire de physico et toxico-chimie des systèmes naturels à Bordeaux (LPTC, UMR EPOC) selon une méthodologie décrite dans le manuscrit de thèse d’Assia Kaci (Kaci, 2014). Parmi ces contaminants, les contaminants suivants ont été dosés dans chacune des fractions sédimentaires étudiées dans le cadre de cette thèse :
 16 HAP (Hydrocarbure Aromatique Polycyclique) : Naphtalène, Acénaphtylène, Acénaphtène, Fluorène, Phénanthrène, Anthracène, Fluoranthène, Pyrène, Benzo[a]anthracène, Triphénylène + Chrysène, Benzo[a]pyrène, Benzo[e]pyrène, Benzo[b]fluoranthène + Benzo[k]fluoranthène + Benzo[j]fluoranthène, Indéno[1,2,3-cd]pyrène, Dibenzo[a,h]anthracène + Dibenzo[a,c] anthracène, Benzo[g,h,i]perylène

Milieux de cultures

Certaines analyses réalisées dans le cadre de cette thèse ont nécessité l’utilisation de divers milieux de culture présentés dans le Tableau II-2.

Analyses microbiologiques des souches d’E. coli des sédiments de surface prélevés dans le bassin versant de la Risle

Dénombrement et isolement

La recherche, l’isolement et le dénombrement des Escherichia coli dans les sédiments de surface (0 – 1 cm de profondeur) ont été réalisés au niveau des quatre sites, à partir de 3 g de sédiment le jour de la campagne de prélèvements. Les 3 g de sédiments ont été vortexés à vitesse maximale dans 27 ml d’une solution d’eau physiologique contenant du pyrophosphate à 1 mM. Une série de dilutions au dixième a été réalisée. Les suspensions de sédiments aux dilutions appropriées ont été filtrées sur une membrane de nitrate de cellulose 0,45 m (Sartorius). Les filtres ont ensuite été déposés chacun sur un milieu solide sélectif et chromogénique : le milieu Rapid’E. coli (Bio, USA, Tableau II-2) supplémenté d’eau REC2 et ont été ainsi incubés 24h à 37°C. Le dénombrement des E. coli a été réalisé par comptage des colonies violettes obtenues à partir des différentes dilutions.
Certaines de ces colonies d’E. coli ont été isolées et stockées pour la suite des analyses. Les colonies les plus isolées ont été choisies et re-isolées sur milieu LB solide (Tableau II-2) et incubées 24h à 37°C afin d’obtenir assez de biomasse. Les souches ont ainsi pu être stockées à -80°C dans un tube contenant des cryo-billes (AES Laboratories, France).

Détermination de la résistance aux antibiotiques

Les phénotypes de résistance aux antibiotiques des souches d’E. coli ont été déterminés par antibiogrammes, méthode de diffusion sur gélose, selon les recommandations de 2015 du comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie (SFM, 2015). Une suspension d’E. coli dans de l’eau stérile avec NaCl à 0,85% (Biomérieux) a été réalisée pour chaque souche à tester à partir de cultures fraiches (incubées depuis moins de 24h sur milieu LB gélosé) et ajustée à 0,5 McFarland. Ainsi, la résistance à 16 antibiotiques (i2A, France ; Tableau II-3) a été testée à partir des suspensions d’E. coli sur géloses Mueller-Hinton (Tableau II-2) incubées à 37°C pendant 20  4h. Cette méthode permet d’attribuer, pour chaque antibiotique, l’un des deux ou trois phénotypes possibles : résistant, sensible et intermédiaire. Ce dernier phénotype peut résulter d’une incertitude due à la méthode ou d’un mécanisme de résistance d’efficacité moindre.

Outils moléculaires

Extraction des ADN

Extraction des ADN à partir de souches bactériennes

Les souches d’E. coli stockées à -80°C ont été ressorties sur milieu LB solide (Tableau II-2) et incubées à 37°C pendant 24h. Une demi öse de biomasse fraiche (2 à 4 colonies de souche pure) a été remise en suspension dans 500 μl d’eau MilliQ stérile et vigoureusement agitée par vortex jusqu’à obtention d’une suspension homogène. Les différents inocula ont été chauffés à 95°C pendant 10 min afin de réaliser une lyse thermique, puis centrifugés à 12000 x g pendant 5 min. Les suspensions contenant les acides nucléiques ont été conservées à -20°C jusqu’à utilisation.

Extraction des ADN à partir d’échantillons environnementaux

Les ADN environnementaux ont été extraits par lyses chimiques et mécaniques à partir de 0,3 g de sédiment à l’aide du kit PowerSoil DNA extraction (MoBio Laboratories Inc.) selon les instructions du fabricant. Des triplicats d’extraction ont été réalisés pour chacun des échantillons.
Les ADN extraits des sédiments du bassin versant de la Risle ont été ensuite purifiés à l’aide du kit AllPrep DNA/RNA Mini (QIAGEN). Tout d’abord, 600 μl de tampon RLT ont été ajoutés aux suspensions d’ADN, puis, après homogénéisation, les mélanges ont été chargés sur des colonnes DNA Mini Spin du kit AllPrep, et lavés selon les instructions du fabricant.
La qualité des ADN, purifiés ou non, a été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 0,8% (m/v). Les concentrations des suspensions d’ADN ont été mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop 2000c (Thermo Scientific) mis à disposition sur la plateforme PRIMACEN (Université de Rouen).

Amplification et détection de gènes et de séquences d’ADN par PCR (réaction de polymérisation en chaîne)

Amplification de séquences d’ADN par PCR et visualisation des résultats

La plupart des analyses moléculaires réalisées dans le cadre de cette thèse ont nécessité au moins une étape d’amplification génique : détection de gènes, analyses de la structure des populations d’E. coli par phylogroupage, amplification de gènes et fragments d’ADN en vue d’une analyse de diversité par séquençage (clonage – séquençage et séquençage haut-débit Illumina) et préparation des gammes étalon pour des quantifications de gènes par qPCR. L’ensemble des gènes et séquences d’ADN ciblées, des amorces utilisées ainsi que la taille des amplicons attendus sont présentés dans le tableau II-4. Les réactions de PCR ont été réalisées à partir de 1 à 5 μl d’extrait non dilué dans le cas des ADN issus d’échantillons environnementaux et de 3 μl de suspension dans le cas des ADN extraits des souches pures d’E. coli. Les réactifs et leurs concentrations respectives utilisés dans les mélanges réactionnels des PCR et qPCR sont présentés dans le tableau II-5. Les paramètres de températures utilisés lors les différentes PCR sont présentés dans le tableau II-6 et ont été appliqués à l’aide des thermocycleurs suivants : thermocycleurs 2720 et GeneAmp PCR System 9700 de Applied Biosystems, thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 de Perkin Elmer, thermocycleur PTC100 de MJ Research et PTC200 de Bio-Rad.
Matériel et méthodes
La bonne réalisation des amplifications a été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose de concentration comprise entre 1 et 2% d’agarose (m/v) dissous dans une solution de TAE (Tris-Acétate EDTA ; pH 8) ou TBE (Tris-Borate-EDTA ; pH 8,3) à 0,5X ou 1X supplémenté ensuite de BET (bromure d’éthidium, agent fluorescent et intercalant des acides nucléiques). Les ADN et produits de PCR à analyser ont été chargés dans le gel à l’aide d’un tampon de charge (à base notamment de glycérol, de bleu de bromophénol et de xylène cyanol) et les migrations ont été réalisées à une tension de 50 à 100 V.cm-1 dans une solution de migration de TAE à 0,5X. Les gels ont ensuite été visualisés sous lumière UV à l’aide d’un analyseur d’images (Vilber Lourmat, Quantum ST4 3000 ou UVITEC, Cambridge).
L’ADNr 16S a été recherché par amplification génique d’un fragment de 1480 pb (Tableaux II-4, II-5 et II-6) dans l’ensemble des ADN extraits des échantillons environnementaux afin de vérifier la faisabilité de la réaction de PCR, en guise de bonne qualité de l’ADN pour les analyses moléculaires à suivre.
Les intégrons cliniques de classes 1, 2 et 3 ont été recherchés dans les ADN extraits des sédiments prélevés dans le bassin versant de la Risle par l’amplification des gènes intI1, intI2 et intI3 codant les intégrases des intégrons de classes 1, 2 et 3 respectivement (Tableaux II-4, II-5 et II-6). La recherche du gène uidA (codant la -D-glucuronidase) dans ces mêmes sédiments a nécessité l’optimisation des conditions de PCR, notamment de la concentration en MgCl2 (Tableau II-5).
Les conditions des PCR réalisées dans le cadre des expérimentations de quantification et de séquençage sont détaillées dans les paragraphes 5.3 et 5.4. respectivement.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE ET OBJECTIFS
CHAPITRE I ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Anthropisation des estuaires, cas de l’estuaire de la Seine
1.1. Les estuaires
1.1.1. Définition
1.1.2. L’estuaire de la Seine et son bassin versant
1.1.3. Marées et dynamique particulaire des estuaires
1.1.4. Le compartiment sédimentaire
1.2. Les contaminants chimiques de l’estuaire de Seine
1.2.1. Les métaux et métalloïdes
1.2.2. Les contaminants organiques
1.2.3. Les antibiotiques et autres composés pharmaceutiques
1.3. La contamination microbiologique des estuaires
1.3.1. Contaminants microbiologiques et agents pathogènes
1.3.2. Suivi de la contamination microbiologique : les indicateurs de contamination fécale
1.3.3. Sources de la contamination fécale
1.3.4. Risques sanitaires liés à la contamination fécale
1.3.5. Contamination fécale de l’estuaire de la Seine
2. Génétique de l’adaptation bactérienne
3. Intégrons
3.1. Structure et fonctionnement des intégrons
3.1.1. La partie constante
3.1.2. La partie variable
3.2. L’intégrase d’intégron et la réaction de recombinaison
3.2.1. Structure de l’intégrase d’intégron
Les tyrosine-recombinases
L’intégrase d’intégron
3.2.2. Recombinaison des cassettes de gènes
3.3. Intégrons et antibiorésistances
3.3.1. Intégrons de classe 1
3.3.2. Intégrons de classe 2
3.3.3. Intégrons de classe 3
3.3.4. Origines des intégrons cliniques porteurs de gènes de résistance à des antibiotiques
3.3.5. Intégrons non cliniques porteurs de gènes de résistance à des antibiotiques
3.4. Les intégrons dans l’environnement
3.4.1. Ubiquité des intégrons
3.4.2. Intégrons d’origine clinique, indicateurs de pression anthropique
3.4.3. Diversité des intégrases d’intégrons et classification
3.4.4. Diversité des cassettes de gènes des intégrons
4. Objectifs des travaux de thèse
CHAPITRE II MATERIEL ET METHODES
1. Caractéristiques des sites d’étude et stratégie d’échantillonnage
1.1. Le bassin versant de la Risle
1.2. La darse des Docks
2. Analyse de la contamination chimique de la carotte sédimentaire prélevée dans la darse des Docks
3. Milieux de cultures
4. Analyses microbiologiques des souches d’E. coli des sédiments de surface prélevés dans le bassin versant de la Risle
4.1. Dénombrement et isolement
4.2. Détermination de la résistance aux antibiotiques
5. Outils moléculaires
5.1. Extraction des ADN
5.1.1. Extraction des ADN à partir de souches bactériennes
5.1.2. Extraction des ADN à partir d’échantillons environnementaux
5.2. Amplification et détection de gènes et de séquences d’ADN par PCR (réaction de polymérisation en chaîne)
5.2.1. Amplification de séquences d’ADN par PCR et visualisation des résultats
5.2.2. Etude de la distribution des groupes phylogénétiques des souches d’E. coli
5.3. Quantification de gènes par qPCR (PCR quantitative)
5.3.1. Quantification de l’ADNr 16S et du gène intI1 par qPCR simplex dans les sédiments de la carotte prélevée dans la darse des Docks
Quantification de l’ADNr 16S et du gène intI1 dans les sédiments
Réalisation de la gamme étalon
5.3.2. Quantification des gènes intI1, intI2 et intI3 par qPCR multiplex et de l’ADNr 16S dans les sédiments prélevés dans le bassin versant de la Risle
5.4. Séquençage haut-débit du gène intI au sein de matrices environnementales
5.4.1. Choix des amorces et optimisation des conditions de PCR
5.4.2. Etude de la diversité obtenue avec les couples d’amorces retenus par clonage – séquençage
5.4.3. Etude de la diversité du gène intI dans des échantillons environnementaux par séquençage haut-débit
5.5. Séquençage haut-débit de l’ADNr 16S au sein de matrices environnementales
6. Outils bioinformatiques
6.1. Traitement des séquences issues du clonage – séquençage Sanger du gène intI dans des boues de STEP
6.2. Traitement des séquences issues du séquençage haut-débit de la région V4-V5 de l’ADNr 16S dans la carotte sédimentaire prélevée dans l’estuaire fluviale de la Seine
6.3. Traitement des séquences issues du séquençage haut-débit du gène intI dans la carotte sédimentaire prélevée dans l’estuaire fluviale de la Seine
7. Analyses de la diversité des intégrons et de la communauté bactérienne
7.1. Analyse de la diversité intra-échantillon (diversité alpha)
7.2. Analyse de la diversité inter-échantillon (diversité bêta)
8. Sélection des intégrases d’intégrons majoritaires et/ ou présentant un profil d’abondance particulier
9. Outils statistiques
9.1. Traitement des données de contamination chimique
9.2. Analyses statistiques des données biologiques
9.3. Analyses statistiques des données biologiques en vis-à-vis des données chimiques et de la datation
CHAPITRE III EFFET DE LA PRESSION ANTHROPIQUE SUR L’OCCURRENCE ET L’ABONDANCE DES INTEGRONS DE CLASSES 1, 2 ET 3 ET DEVENIR DES POPULATIONS D’ESCHERICHIA COLI DU COMPARTIMENT SEDIMENTAIRE ESTUAR
1. Contexte et objectifs
2. Caractérisation du site d’étude
3. Contamination microbiologique des sédiments du bassin versant de la Risle, le long d’un continuum « exploitation agricole – STEP – milieu récepteur »
4. Evolution des intégrons de classe 1, 2 et 3 le long du continuum et maintien dans le compartiment sédimentaire
5. Conclusion et perspectives
CHAPITRE IV ETUDE DE LA DIVERSITE DES INTEGRONS DANS DES SEDIMENTS ESTUARIENS ANTHROPISES
CHAPITRE IV – PARTIE I MISE EN PLACE ET VALIDATION D’UNE METHODE D’ANALYSE DE LA DIVERSITE DES INTEGRASES D’INTEGRONS AU SEIN DE MATRICES ENVIRONNEMENTALES PAR SEQUENÇAGE HAUT-DEBIT
1. Contexte et objectifs
2. Validation du couple d’amorces et optimisation des conditions d’amplification en vue du séquençage haut-débit du gène intI
3. Traitement bioinformatique des séquences
3.1. Traitement des séquences nucléiques
3.1.1. Visualiser la qualité des séquences nucléiques
3.1.2. Concaténation des reads 1 et reads 2
3.1.3. Nettoyage des séquences nucléiques par filtres de qualité
3.1.4. Elimination des amorces
3.1.5. Concaténation des séquences en un fichier
3.1.6. Assignation des noms des échantillons d’origine
3.1.7. Elimination des chimères
3.2. Traduction des séquences nucléiques
3.2.1. Création d’une base de données protéique
3.2.2. Traduction des séquences nucléiques en séquences protéiques
3.3. Obtention de la table d’OTU
4. Application et évaluation de la méthode mise en place
4.1. Application du workflow pour le traitement bioinformatique de données résultant du séquençage haut-débit du gène intI
4.2. Premières analyses de la table d’OTU obtenues à partir des séquences protéiques d’IntI issues d’une carotte sédimentaire prélevée dans l’estuaire fluvial de la Seine
5. Conclusion et perspectives
CHAPITRE IV – PARTIE II EFFET DES CONTAMINATIONS CHIMIQUES SUR LA DIVERSITE, DES INTEGRASES D’INTEGRONS
1. Contexte et objectifs
2. Contamination chimique de la carotte sédimentaire prélevée dans l’estuaire fluviale de la Seine
3. Diversité des intégrons et de la communauté bactérienne dans la carotte sédimentaire
3.1. Modification de la diversité totale du pool d’intégrases d’intégron le long de la carotte de sédiment
3.2. Relation entre les contaminants chimiques et la diversité totale du pool d’intégrases d’intégron le long de la carotte de sédiment
3.3 Principaux résultats et conclusions sur l’effet des contaminants chimiques et de la datation sur la diversité des intégrases d’intégrons et la diversité bactérienne
4. Effet de la contamination chimique sur les différentes classes d’intégrons
4.1. Caractéristiques des classes d’intégrons sélectionnées pour la suite de cette étude
4.2. Les intégrases d’intégrons majoritaires
4.3. Les intégrases d’intégrons de surface
4.3.1. Les intégrases d’intégrons spécifiques des sédiments de surface
4.3.2. Les intégrons de classe 1 dans la carotte sédimentaire
4.4. Autres exemples d’intégrases d’intégrons particulières
4.5. Les intégrases d’intégrons non fonctionnelles
5. Conclusions et perspectives
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
Quel est le devenir des contaminants fécaux et de leur ADN en milieu estuarien ?
Les intégrons de classe 1 sont-ils de bons indicateurs de pression anthropique ? Quelles informations peuvent-ils nous apporter et quelles en sont leurs limites ?
Qu’a apporté et peut encore apporter la méthode mise en place pour l’analyse de la diversité du gène intI dans des matrices environnementales ?
Quels sont les facteurs et phénomènes intervenant dans la structuration du pool d’intégrases d’intégrons dans le compartiment sédimentaire en milieu estuarien ?
Les intégrons comme proxys de pollution anthropique et de contamination chimique ?
LEXIQUE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
ANNEXES
RESUME
MOTS CLE

Télécharger le rapport complet