Soutenance mémoire
ANATOMIE DU CERVEAU ET NEUROPATHOLOGIES
Anatomie des régions cérébrales étudiées
Le point commun des 11 régions étudiées, est leur lien anatomique ou leur appartenance aux GB, appelés également noyaux gris centraux . Les GB sont l’ensemble des noyaux siégeant en profondeur dans le cerveau antérieur, comprenant le striatum (le noyau caudé et le putamen), le globus pallidus (externe et interne), le noyau sous-thalamiques et la substance noire (pars reticulata). Son organisation paraît complexe à la fois par la multiplicité des connexions et par la diversité des neurotransmetteurs impliqués (la dopamine, le GABA, l’acétylcholine, le glutamate).
Les GB sont impliqués dans des aspects supérieurs, cognitifs et émotionnels, du contrôle moteur par la planification des stratégies motrices en relation avec l’état interne du sujet. Par conséquent, il fait intervenir différentes régions provenant de trois principaux circuits qualifiés de : sensori-moteur (le thalamus, le cortex moteur et somatosensoriel), associatif (le striatum, la substance noire, cortex enthorinal, orbital) et limbique (cortex cingulaire, cortex prélimbique, noyau accumbems, région ventrale tegmentale). Pour la plupart, ces circuits ne sont pas strictement associés à la motricité, mais sont impliqués dans la mémorisation des habilités motrices (Striatum), dans les processus émotionnels (région limbique) et dans le traitement des processus cognitifs (cortex associatifs).
Toutes ces connexions constituent une « boucle motrice » qui est présentée d’une façon simplifiée , c’est-à-dire n’impliquant que les connexions et les neurotransmetteurs qui sont à l’origine des dysfonctionnements pathologiques d’Huntington et de Parkinson.
Sur le plan fonctionnel, la boucle motrice débute depuis le cortex vers les GB, où le striatum constitue la voie d’entrée tandis que le globus pallidus (externe et interne) et la zone réticulée de la substance noire constituent les noyaux de sortie ; les influx issus du striatum gagnent, via le globus pallidus, le thalamus et, de là, reviennent au cortex. Une région particulièrement importante dans ce phénomène de canalisation des informations est le striatum. Il est situé à un point stratégique de la « boucle motrice » car il reçoit des informations de différentes aires du cortex cérébral et il les restitue (par l’intermédiaire du globus pallidus et de la substance noire) aux noyaux thalamiques et aux aires motrices corticales impliquées dans l’exécution des mouvements.
Le striatum reçoit des projections dopaminergiques à partir de la partie compacte de la substance noire. Il est sous la dépendance directe du néocortex et intervient dans des opérations relatives à l’habilité motrice. De ce fait, le striatum représente une structure critique pour la mémoire procédurale impliquée dans la formation des habilités motrices. A côté de cela, le striatum est également impliqué dans des processus émotionnels (cortex limbique) et cognitifs (cortex associatif) par l’intermédiaire de projections glutamatergiques provenant de ces régions. De plus, le striatum constitue la première région atteinte de neurodégénérescence dans la MH et de dysfonctionnement dans la MP.
Neurodégénérescence du striatum
Maladie d’Huntington
La MH est une anomalie neurodégénérative héréditaire, autosomale-dominante qui fait parti des 14 maladies dites à expansion du trinucléotide CAG (codant pour le résidu glutamine) dont l’amyotrophie bulbospinale (SBMA pour Spinal and Bulbar Muscular Atrophy), due à une mutation du gène codant pour le récepteur androgène qui comporte également une expansion anormale du trinucléotide CAG (Banno et al., 2009). L’origine moléculaire de la MH est une mutation dominante sur un gène qui code pour une protéine de haut poids moléculaire (350 kDa), dénommée Huntingtine (Htt). Cette mutation est localisée au niveau de l’exon 1 du gène codant pour la protéine Huntingtine mutée (mHtt). La conséquence est une répétition anormale du trinucléotide CAG codant pour au moins quarante résidus glutamines (expansion polyQ localisée à l’extrémité N-terminale de la Htt), alors que la protéine normale possède entre 10 et 34 résidus glutamines.
Les symptômes de la MH sont des mouvements et des postures involontaires et anormaux (chorée, dyskinésie et dystonie), de la jambe, du torse et de la face. Des troubles du langage (dysarthrie) sont souvent observés. Les autres symptômes de démences correspondent à des troubles psychiatriques et de l’humeur, ainsi que des déficits cognitifs. Ces troubles sont caractérisés par des atteintes de la planification et de l’adaptation ainsi qu’une atteinte de la perception de l’environnement par le malade. Avec la progression de la maladie, la rigidité motrice et la démence prédominent. La maladie est fatale entre 15 et 20 ans après l’apparition des premiers symptômes. La Htt sauvage est une protéine ubiquitaire présente dans de nombreuses régions cérébrales et dans de nombreux tissus périphériques et cette distribution n’est pas modifiée en présence d’Huntingtine mutée (Aronin et al., 1995). La fonction physiologique de la protéine n’est pas totalement connue, mais de nombreux arguments suggèrent qu’elle joue un rôle prépondérant dans les voies de survie cellulaire. La perte d’un allèle sauvage chez les patients pourrait ainsi créer, par « perte de fonction », un effet délétère ou du moins fragilisant sur les neurones. Néanmoins, son expression ubiquitaire n’explique pas l’atteinte sélective de la région striatale, en particulier, les neurones GABAergiques du putamen projetant vers le globus pallidus .
Le profil d’expression de mHtt n’est pas corrélé avec l’augmentation de la vulnérabilité d’une population neuronale spécifique du striatum et du cortex moteur. Cette perte sélective d’une population neuronale est suggérée comme le résultat d’une vulnérabilité sélective de ces cellules par un gain d’une fonction toxique associée à l’expansion polyQ anormale dans la protéine mHtt. La mutation de la Htt génère des changements de conformation et une propension à l’agrégation (par la nature relativement hydrophobe du segment polyQ). La présence d’inclusion intranucléaire et d’agrégats cytoplasmiques sont des caractéristiques importantes de la MH. Néanmoins le rôle des ces inclusions et agrégats reste mal compris. Les polymères d’Htt mutée, relativement solubles seraient les espèces moléculaires toxiques pour les cellules. Les mécanismes physiopathologiques de la MH sont souvent considérés comme « multifactoriels ». En effet de nombreuses fonctions cellulaires sont altérées par la Htt mutée, comme la transcription, le métabolisme énergétique, l’homéostasie du calcium, le transport axonal et la machinerie de la neurotransmission (Damiano et al., 2009). Pourtant, l’effet toxique de l’expansion polyQ de mHtt n’est pas restreint à une population neuronale. Les mécanismes incriminés ne peuvent expliquer à eux seuls la vulnérabilité préférentielle du striatum. L’hypothèse serait que les caractéristiques moléculaires de la population neuronale du striatum pourraient être à l’origine de l’augmentation de sa vulnérabilité associée à la toxicité de mHtt (Han et al., 2010).
Maladie de Parkinson
La MP est associée à une dégénérescence des neurones dopaminergiques de la région nigrostriatale (liant la substance noire au putamen). Ces fibres nerveuses qui se projettent de la substance noire vers le putamen et le noyau caudé (striatum) sont directement affectées par la diminution du taux de dopamine produit par ces neurones dopaminergiques. Cette diminution de dopamine est à l’origine de la perte du contrôle moteur .
Dans la majorité des cas, la maladie se déclare d’une façon sporadique, autour de 60 ans. Il existe des formes héréditaires de la maladie qui ne représentent que 5% des cas. Cette lésion de la voie nigrostriée débouche sur la triade symptomatique qui définit le tableau Parkinsonien : l’hypokinésie qui est une réduction considérable de la capacité à réaliser les mouvements, la bradykinésie qui est un ralentissement moteur et l’akinésie qui est une augmentation du tonus musculaire. La manifestation clinique la plus caractéristique de la MP est l’akinésie, une posture voûtée, une rigidité et un tremblement au repos.
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE 1 INTRODUCTION
A. ANATOMIE DU CERVEAU ET NEUROPATHOLOGIES
A.1. Anatomie des régions cérébrales étudiées
A.2 . Neurodégénérescence du striatum
A.2.1. Maladie d’Huntington
A.2.2. Maladie de Parkinson
B. DONNEES TRANSCRIPTOMIQUES
B.1. Présentation
B.2. La technique sage
B.3. Résultats et discussion
B.4. Conclusion
C. INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE SUR LA PROTEINE mCRYM
C.1. CRYM : une µ-crystalline avec une fonction de CTBP
C.2. La superfamille des crystallines : un exemple original d’évoluti
C.3. Les CTBPs : fonction enzymatique et/ou fonction structurale ?
C.4. Les Hormones thyroïdiennes
C.4.1. Biosynthèse
C.4.2. Libération des THs et modulation de la biodisponibilité de la T3
C.4.3. Les diverses fonctions physiologiques des THs
C.4.4. Les modes d’action des THs
C.4.4.1. Mode d’action génomique
C.4.4.2. Mode d’action non génomique
C.5. Les transporteurs plasmiques des THs
C.6. Transport nucléo-cytoplasmique et régulation de la T3 dans le noyau
C.7. Les études fonctionnelles sur CRYM de mammifères
C.7.1. Implication de CRYM dans la surdité non syndromique
C.7.2. Relation entre la protéine hCRYM et le récepteur aux androgènes
C.8.Les études structurales sur CRYM de mammifères et ses homologues
C.8.1. La structure de hCRYM humaine complexée au NADPH
C.8.2. Structures cristallographiques de mCRYM apo et mCRYM/NADP(H)
C.8.3. Les homologues de CRYM et la famille des µ-crystallines/OCDs
C.8.3.1. Ornithine cyclodésaminase de P.putida
C.8.3.2. Alanine déshydrogénase d’A.fulgidus
CHAPITRE 2 Matériel et Méthodes
A. CLONAGE, EXPRESSION ET PURIFICATION DES PROTEINES SOLUBLES
A.1. Clonage et criblage de l’expression et de la solubilité des protéines
A.1.1. Compte-rendu de la plate-forme RoBioMol
A.1.2. Clonage et tests d’expression de la protéine DCLK3
A.2. Purification des protéines solubles
A.2.1. La protéine DYSBINDIN1
A.2.2. La protéine mCRYM
B. CARACTERISATION BIOCHIMIQUE
B.1. Spectrométrie de masse dénaturante
B.1.1. La protéine Dysbindin1
B.1.2. La protéine mCRYM
B.2. Analyse par RMN-1D de la protéine DYSBINDIN1
C. CRISTALLISATION DE mCRYM COMPLEXEE AU NADPH ET A LA T3
C.1. Principe de la cristallogenèse
C.2. Techniques de cristallogenèse utilisées
C.3. Co-cristallisation de mCRYM en présence de T3 et NADPH
C.3.1. Premiers essais de cristallisation
C.3.2. Résolution du problème de solubilité de la T3
D. OPTIMISATION DES ETAPES DE CRISTALLISATION ET DE CRYOPROTECTION
D.1. Ensemencement des germes de cristaux de mCRYM/T3/NADP(H)
D.2. Cryoprotection et tests de diffraction
E. RESOLUTION DE LA STRUCTURE DE mCRYM/T3/NADP(H)
E.1. L’enregistrement et le traitement des données de diffraction
E.2. La validation des données de diffraction
E.3. Détermination de la phase par remplacement moléculaire
E.4. L’affinement et la construction du modèle
E.5. Problème d’affinement des données de diffraction de mCRYM/T3/NADP(H)
E.6. Optimisation de la cryoprotection
E.7. Résolution de la structure du complexe mCRYM/T3/NADPH
F. CARACTERISATION THERMODYNAMIQUE DE LA T3
F.1. Présentation et principe de l’ITC
F.2. Déroulement de l’expérience
F.3. Résolution du problème de solubilité de la T3
CHAPITRE 3 Etude structurale du complexe mCRYM/T3/NADPH
A. RESULTATS ET DISCUSSION
A.1. Présentation générale de la structure
A.1.1. La molécule T3 et la particularité des atomes d’iode
A.1.2. Structures secondaires de mCRYM/T3/NADP(H)
A.1.3. Structure tertiaire de mCRYM
A.1.3.1. Domaine de fixation du NADP(H)
A.1.3.2. Domaine de dimérisation et de fixation de la T3
A.2. Interaction de la T3 avec la protéine mCRYM et le NADPH
A.3. Comparaison des structures de mCRYMs
A.3.1. Comparaison de mCRYM/T3/NADP(H) avec mCRYM apo
A.3.2. Comparaison de mCRYM/T3/NADP(H) avec mCRYM/NADP(H)
A.4. Comparaison de mCRYM avec hCRYM et les homologues
A.4.1. Homologie de séquence
A.4.2. Comparaison de mCRYM/T3/NADP(H) avec hCRYM/NADPH
A.4.2.1. Site de fixation du NADP(H) : comparaison avec mCRYM/NADP(H)
A.4.2.2. Flexibilité de la boucle β4-β5
A.4.2.3. Site de l’ion potassium
A.4.2.4. Superposition du site de la T3 de hCRYM et mCRYM
A.4.2.5. Comparaison avec le modèle hCRYM/T3/NADPH
A.4.3. Comparaison de mCRYM/T3/NADP(H) avec l’enzyme AfALDH
A.4.4. Comparaison de mCRYM/T3/NADP(H) avec l’enzyme PpOCD
B. CONCLUSION
B.1. Présence de NADPH ou NADP+ dans les structures des complexes mCRYM?
B.1.1. Tableau de synthèse des données structurales
B.1.2. Présence du complexe mCRYM/T3/NADP+ et du complexe mCRYM/NADPH
B.2. Spécificité du domaine de fixation du NAD(P) des µ-crystallines/OCDs/AfAlaDH
B.3. Interaction avec des partenaires physiologiques
B.4. Site à ions monovalents : physiologiques ou artefacts cristallographiques ?
CONCLUSION
