Analyses microbiologiques pour l’isolement et l’identification de Salmonella

Analyses microbiologiques pour l’isolement et l’identification de Salmonella

Salmonelles et antibiorésistance

Les mécanismes

Plusieurs mécanismes de résistance différents ont été décrits chez les bactéries. Ces mécanismes sont l’inhibition enzymatique, l’imperméabilité de la membrane, les pompes à efflux, l’altération du ribosome-cible, l’altération de précurseurs cibles de la paroi cellulaire, l’altération des enzymes cibles et la surproduction d’enzymes cibles.
L’antibiorésistance s’explique par la présence, chez les bactéries résistantes, de mécanismes leur permettant d’échapper à l’action de certains antibiotiques. Cependant une bactérie résistante à un antibiotique peut demeurer sensible à d’autres. On distingue classiquement 2 formes de résistances, l’une dite « constitutive », l’autre dite « acquise ».
La résistance constitutive est une caractéristique propre à certaines espèces bactériennes pour lesquels tous les représentants de ces espèces possèdent un bagage génétique qui leur permet d’échapper à l’action de certains antibiotiques. Cette forme de résistance n’est pas véritablement préoccupante contrairement à la résistance acquise. Cette dernière est issue d’erreurs occasionnelles de réplication des gènes (mutations). Dans certains cas, les nouveaux gènes confèrent la capacité de résister à l’action d’un antibiotique, voire à plusieurs antibiotiques appartenant à une même famille (résistance croisée). Cette apparition d’un gène de résistance au niveau chromosomique peut résulter soit d’une mutation spontanée indépendante de l’action d’un antibiotique sélectionnant soit de l’altération par un antibiotique, doté d’un potentiel mutagène, du matériel génétique porté par les chromosomes des bactéries.
Parfois les bactéries devenues résistantes sont capables de transférer leurs gènes de résistance à d’autres bactéries initialement non résistantes qui deviennent alors résistantes. La capacité de transfert de résistance dite chromosomique, c’est à dire inscrite dans le patrimoine génétique d’une bactérie est relativement limitée. Par contre si le caractère de résistance est porté par les plasmides, éléments d’acide nucléique extra-chromosomiques, la capacité de transfert est beaucoup plus importante, car elle peut résulter de la mise en œuvre de divers mécanismes : conjugaison, transformation, transduction. Cette capacité est d’ailleurs d’autant plus grande que la taille du plasmide portant ce gène de résistance est importante.
La résistance bactérienne peut être qualitative (résistance même à des doses élevées d’antibiotiques) ou quantitative (résistance à dose faible et sensibilité à dose élevée).
La rapidité d’acquisition de résistance et l’importance relative des différents modes d’acquisition (mutation, transfert) varient considérablement selon les espèces bactériennes.
Les échanges de gènes peuvent avoir lieu entre bactéries de même espèce ou non, et entre bactéries pathogènes et non pathogènes.
Avec le temps, certaines bactéries acquièrent des résistances vis-à-vis de plusieurs familles d’antibiotiques (souches multirésistantes). Ainsi Salmonella Typhimurium DT 104 est résistante à 5 voire 6 familles d’antibiotiques (Broes et Boutin, 2003). Elle résiste habituellement à l’amoxicilline/ampicilline, à la streptomycine et à la spectinomycine, aux sulfamides, au chloramphénicol/florfénicol et à la tétracycline (Weill X. et al., 2003).

Antibiorésistance des salmonelles

On rencontre désormais souvent des souches de salmonelles multirésistantes et la fréquence de la pharmaco-résistance multiple a considérablement augmenté ces dernières années. Pire encore, certaines variantes de Salmonella ont développé une multirésistance qui fait partie intégrante de leur matériel génétique et sont par conséquent susceptibles de conserver des gènes de pharmaco-résistance même si l’on n’utilise plus les antimicrobiens concernés, situation dans laquelle d’autres souches résistantes perdraient en règle générale leur résistance.
L’émergence de salmonelles pharmacorésistantes répond à l’utilisation d’antimicrobiens chez les animaux d’élevage. La pression sélective résultant de l’emploi d’antimicrobiens est l’une des principales forces conduisant à l’apparition de cette résistance, mais d’autres facteurs doivent également être pris en compte. Certains sérotypes de salmonelles, par exemple, sont plus enclins à développer une résistance que d’autres. En outre, on observe régulièrement des variations importantes de la fréquence des sérotypes de Salmonella chez les animaux d’élevage et chez l’homme. On a ainsi récemment relevé la propagation à l’échelle mondiale, chez l’homme et certains animaux, d’une souche de S. Typhimurium multirésistante lysotype 104. Bien que la propagation de cette souche puisse avoir été facilitée par l’utilisation d’antimicrobiens, on pense qu’elle résulte principalement du commerce national et international d’animaux infectés.

Réglementation salmonelles

La nouvelle réglementation Européenne  » zoonose « , après plusieurs années de discussions à Bruxelles, a été adoptée fin 2003. Deux textes en fixent le cadre : la directive 2003/99/CE, ayant pour objet la surveillance des zoonoses et le règlement 2003/2160/CE, qui, lui, s’intéresse à la maîtrise des risques, c’est-à-dire à la mise en place de plans de surveillance et d’amélioration. Les salmonelles sont tout particulièrement concernées par ces textes.
La directive prévoit la surveillance des zoonoses et des résistances microbiennes, l’étude épidémiologique des foyers de toxi-infections alimentaires collectives ainsi que des échanges d’informations entre les Etats-membres. La liste des zoonoses concernées, fixée dans deux annexes, est très exhaustive ; parmi celles-ci, les principales sont la Brucellose, la Campylobactériose, la Cryptosporidiose, l’Échinococcose, la Listériose, la Salmonellose, la Trichinellose, la Tuberculose et les infections par Escherichia coli vérotoxinogène.
La surveillance doit s’exercer aux stades pertinents de la chaîne alimentaire, c’est-à-dire en élevage, en abattoir et aux autres stades de la transformation. Fait nouveau, l’alimentation animale sera, elle aussi, concernée. Les résultats de chaque Etat-membre seront communiqués annuellement à la Commission et rendus publics.
Concernant les sérotypes de salmonelles, ce texte prévoit  » tous les sérotypes présentant un intérêt pour la santé publique « , ce qui en pratique, en filière porc, semble signifier  » tous les sérotypes de salmonelles ».
L’objectif, clairement annoncé dans ce règlement, est une réduction de la prévalence des salmonelles. Chaque État membre devra proposer à la Commission un plan de contrôle avec des objectifs en termes de diminution de prévalence et de délai d’obtention de cette baisse de prévalence.
Les contrôles devront porter sur l’alimentation animale, les animaux, les carcasses et la transformation. Le règlement ne fixe pas les méthodes de contrôle, mais stipule que le plan proposé devra préciser :
la liste des laboratoires agréés, les méthodes d’analyses utilisées, les plans d’échantillonnage, les mesures prises sur les prélèvements positifs pour assurer la santé publique, la proposition d’un guide de bonnes pratiques en élevage et des mesures d’hygiènes à appliquer pendant le transport pour limiter la contamination. La Commission validera ou non chaque plan selon des critères qui ne sont pas précisés dans le texte.
Le principe des différents plans mis en place en Europe repose sur le classement des élevages selon leur niveau de risque de contamination en salmonelles, en distinguant deux ou trois niveaux, des mesures correctives étant mises en place uniquement dans les élevages les plus à risque. Les pourcentages d’animaux séropositifs conduisant au classement d’un élevage dans un niveau donné ont été fixés en fonction des capacités techniques et économiques de la filière à gérer ces élevages à risque. C’est ainsi que le taux d’élevages danois  » à risque élevé  » oscille de 5 % en 1995 à 3 % en 2004 (Corrégé I., 2008).
La réglementation Européenne exige aussi de raisonner le problème en terme de marge de progrès. Celle-ci est à adapter dans chaque pays, chaque État étant tenu de fixer ses propres objectifs : pourcentage d’élevages non conformes et délai pour l’atteindre.
Ainsi, dans un premier temps, une évaluation économique des mesures spécifiques dans les élevages à risques et des mesures à prendre lors de l’abattage de leurs animaux doit être réalisée pour fixer ensuite un pourcentage effectivement gérable par la filière française, de l’élevage jusqu’au produit remis au consommateur.

Analyses microbiologiques pour l’isolement et l’identification de Salmonella

La recherche de Salmonella nécessite 4 étapes successives, qui s’étalent sur 4 jours. (Société Française de microbiologie, 20007)

Phase une : pré-enrichissement.
Ensemencer la prise d’essai (10g dans 90ml ou 25g dans 225ml) dans l’eau peptonnée tamponnée stérile à température ambiante, puis incuber à 37°C pendant 20h-24h.

Phase deux : enrichissement.
Cette phase est réalisée sur deux milieux sélectifs, Rappaport vassiliadis modifié (RVS) et Muller Kauffman au Tétrationate / Novobiocine (MKT).
L’incubation du bouillon MKT se fait à 37°C pendant 24h et celle du bouillon RVS à 42°C pendant 24h.

Phase trois : ensemencement
Se fait sur trois milieux sélectifs solides : le milieu Hektoen, le milieu XLD et le milieu SS permettent l’isolement et l’identification des Salmonella. Les milieux sont mis à incuber 24 h à 37 °C, puis les boîtes sont examinées afin de rechercher la présence des colonies susceptibles ou non d’être des Salmonella. Afin d’obtenir des souches pures, un ré-isolement est effectué à partir des colonies obtenues en isolement.

Phase quatre : La confirmation
Elle est réalisée via une série de tests biochimiques : Hajna/Kligler, Simmons, urée, indole, ONPG, mannitol mobilité, catalase et oxydase qui permettent de mettre en évidence les caractères biochimiques de Salmonella :
Le test de Kligler permet la recherche simultanée du lactose, du glucose, de la production de gaz, d’H2S et de la β-galactosidase pour les bactéries lactose -.La lecture de l’utilisation du lactose se fait sur la pente du tube : pente jaune lactose +, pente rouge, lactose -. La fermentation du glucose est décelée dans le culot : Culot jaune = glucose +, culot rouge = glucose -.
La production de H2S est déterminée par une coloration noire du culot, et le dégagement gazeux est visualisé par une bulle d’air dans la gélose ;
Le test de Simmons permet de voir si le citrate est utilisé comme source de carbone (le virage au bleu indique un virement de pH par alcalinisation du milieu, dans ce cas la souche est citrate de Simmons +) ;
Le test à l’urée met en évidence la présence d’uréase. La coloration rouge traduit une alcalinisation du milieu suite à l’hydrolyse de l’urée et formation de carbonate d’ammonium.
Pour la mise en évidence de la production d’indole, quelques gouttes du réactif de Kovacs sont ajoutées dans les tubes du milieu urée-indole. La dégradation du tryptophane est marquée par l’apparition d’un anneau jaune, pour les Salmonella qui sont dites indole négatif. Dans le cas contraire, nous avons un anneau rouge.
Le milieu mannitol/mobilité est utilisé pour rechercher la mobilité et l’utilisation du mannitol. Lorsque le milieu reste jaune la souche est mannitol +, et lorsque le milieu se trouble la mobilité est positive.
Le test Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside (ONPG) se fait sur les bactéries lactose – (pente du milieu Hajna/Kligler rouge à 24 heures). Si la suspension reste incolore la souche est ONPG -, s’il y a virage au jaune la souche est ONPG +

Méthode pour la Réalisation des antibiogrammes

L’utilisation de la méthode par diffusion des disques imprégnés d’antibiotiques et la mesure des diamètres sont réalisées selon la méthode de Kirby Bauer, méthode recommandée par l’OMS permettant d’évaluer la résistance et la sensibilité de chaque antibiotique.
Les disques d’antibiotiques sont déposés sur une gélose Hinton classique pour Salmonella et d’une gélose Hinton enrichie à 5 % de sang de cheval pour Campylobacter . Après une incubation de 24h à 37°C pour Salmonella à atmosphère classique, la lecture se fait par mesure des diamètres des zones d’inhibition.
Les données appliquées pour la lecture proviennent de méthodes reconnues (recommandations du comité de l’antibiogramme de la société Française de microbiologie) . Les diamètres critiques des souches bactériennes nous permettent de déterminer la sensibilité vis-à-vis d’un panel d’antibiotiques.
Le choix des antibiotiques a été fait en fonction de données bibliographiques et de façon à étudier plusieurs familles d’antibiotiques : aminosides (streptomycine et gentamicine), les céphalosporines (céfalotine), les phénicolés (chloramphénicol), les inhibiteurs de la β lactamase (amoxicilline/acide clavulanique), les pénicillines (amoxicilline), les macrolides (érythromycine), les sulfamides (triméthoprime/sulfamethoxazole), les tétracyclines et enfin les quinolones (acide nalidixique et ciprofloxacine).

Table des matières

Introduction
I. Partie bibliographique 
1. Généralités
2. Salmonelle et antibiorésistance
3. Contexte de l’étude
4. La filière porcine à la Réunion
5. Objectif général
6. Objectifs spécifiques
II. Matériel & Méthodes
Echantillonnage
Période et lieu d’étude
Récolte de données et enquêtes de terrain
1. Questionnaire
2. Prélèvements
Analyses microbiologiques
3. Analyses microbiologiques pour l’isolement et l’identification de Salmonella
4. Méthode pour la Réalisation des antibiogrammes
III. Résultats
Prévalences
1. Prévalence en élevage
2. Evolution du statut salmonella des lots selon les différentes étapes
Sérotypes majoritaires
3. Sérotypes par lot aux différentes étapes
Antibiorésistance
4. Résistance des salmonelles aux différents antibiotiques
5. Répartition des multirésistances
6. Profil des résistances
Analyse Statistique et facteurs de risque
IV. Discussion
Méthodologie
1. Echantillonnage et prélèvements
2. Analyses microbiologiques
Résultats
3. Prévalences observées
4. Facteurs de risque
5. Sérotypes
6. Antibio-résistance
Conclusion & Perspectives
Bibliographie

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