Analyses de lait pour détecter les excrétrices

REALISATION DES PRELEVEMENTS EN ELEVAGE

Analyses de lait pour détecter les excrétrices

L’excrétion de mycoplasme peut se faire à bas bruit et de façon intermittente, de telle sorte qu’avec un unique prélèvement de lait, on puisse avoir des faux-négatifs. Les prélèvements ont eu lieu au début de la période de traite (voire en période d’allaitement pour les antenaises), période favorable à l’identification d’une excrétion mammaire, mais il est possible que certaines brebis excrétrices n’aient pas été détectées par cette méthode.

Afin d’améliorer la sensibilité de la détection et de réduire les coûts analytiques, les brebis présentant des signes de mammite chronique pouvant être liées à l’agalactie contagieuse ont été notées et l’analyse par qPCR s’est faite en mélangeant le lait de ces animaux.

Les laits ont été regroupés selon l’âge des brebis ; en effet il est plus probable que les brebis présentes au moment de la déclaration aient été contaminées et continues d’excréter (BERGONIER et al.2010). A nouveau, en mélangeant le lait de ces animaux, on réduit le nombre de groupes de laits positifs à traiter individuellement (MAURY, 1996) Lors de ce protocole, les PCR ont été considérées comme positives dès qu’il y avait amplification d’ADN, même avec des Ct très importants (jusqu’à 39).

Une surveillance sur le lait de tank au cours de la campagne 2012-2013

Dans les cheptels 1, 2 et 3, l’analyse du lait de tank n’a plus révélé la présence de mycoplasme audelà du second (voire premier) prélèvement. L’absence de mycoplasme détectable dans le lait de tank peut soit s’expliquer par la réforme des brebis excrétrices (détectées suite à nos analyses individuelles), soit par une excrétion à trop faible niveau pour être détectable (brebis infectées chroniquement ayant échappé à la détection individuelle).

On sait que l’excrétion est maximale après la mise-bas, les résultats négatifs pourraient aussi être dus au fait que les prélèvements sont trop éloignés dans le temps de l’agnelage, et donc que les brebis n’excrètent pas à ce moment.

Dans le cheptel n°4, tous les prélèvements sur lait de tank sont négatifs, tout comme les mélanges par dix de prélèvements individuels. Ce qui est conforme aux résultats individuels qui étaient tous négatifs en PCR et en sérologie (sauf une brebis).

Concernant le cheptel n°5, qui a subi une rechute clinique d’agalactie contagieuse, on observe une explosion des comptages de mycoplasmes dans le lait de tank. On peut se demander si la négativation du tank en mars peut être due à la réforme des brebis PCR+ suite aux prélèvements de début de campagne.

La surveillance sur le lait de tank au cours de la campagne 2013-2014

L’excrétion galactophore a été surveillée via la positivité du lait de tank au cours de la campagne 2013-2014. La qPCR étant très sensible, le fait de rechercher le mycoplasme sur lait de tank est intéressant, en revanche, il aurait été intéressant de prélever plus souvent après l’agnelage, voire de prélever individuellement les brebis. Ceci aurait augmenté la probabilité de détecter des brebisfaiblement excrétrices ou à excrétion intermittente, qui ont pu passer au travers des prélèvements de lait de tank. Mais pour des raisons de coûts, il a été choisi de se fier aux résultats sur lait de tank.

Analyses individuelles de lait

L’élevage n°4 est entièrement négatif : aucune brebis ne semble excréter du mycoplasme. Dans les cheptels n°2 et 3 on n’observe aucune excrétion de la part des animaux nés après la date de déclaration d’agalactie.

L’élevage n°5 a fait une rechute clinique au cours de la campagne 2013, il sort donc du protocole d’assainissement. Cet élevage avait déclaré l’agalactie contagieuse en avril 2010, on remarque que les brebis qui excrètent sont celles présentent dans l’élevage au moment de l’épisode clinique et celles nées lors de la campagne suivante (2010).

Les dernières générations ne semblent pas multiplier le mycoplasme. Près d’un tiers du troupeau est constitué de brebis « 2011 » et « 2012 ». On peut penser que la rechute clinique qu’a subi cet élevage est en parti du au renouvellement du troupeau : une grande proportion de jeunes brebis non immunisées, ce qui fait pencher la balance vers la déclaration d’une forme clinique. (CORRALES J.C. et al., 2006)

Corrales rapporte que cette situation a déjà été observée dans des troupeaux surveillés par son équipe pendant plus de sept ans : les épisodes cliniques sont séparés par des périodes dites asymptomatiques pendant lesquelles aucun mycoplasme n’a pu être isolé, que ça soit dans le lait de tank ou sur les brebis ayant un CMT (Californinan Mastitis Test) (CORRALES et al., 2006) entre le mycoplasme et l’immunité du troupeau a été rompue.

INTRODUCTION 
I. MATERIELS ET METHODES 
I.1: CONTRIBUTION A L’EVALUATION DE LA PCR EN TEMPS REEL APPLIQUEE AU LAIT DE TANK
A. SELECTION DES ELEVAGES
B. REALISATION DES PRELEVEMENTS EN ELEVAGE
C. ANALYSE DES LAITS (LABORATOIRE DES PYRENEES ET DES LANDES)
1. Echantillons réalisés
2. Inclusion des laits
3. PCR en temps réel
4. Méthodes statistiques
I.2: UTILISATION DE LA PCR EN TEMPS REEL POUR LA REFORME CIBLEE
A. SELECTION DES ELEVAGES
B. EXAMENS ET PRELEVEMENTS REALISES DANS LES ELEVAGES
2. Prélèvements
3. Suivi des troupeaux au cours de la campagne 2013
4. Mesures de biosécurité
D. TECHNIQUES ANALYTIQUES
1. PCR en temps réel sur le lait
2. Trousses Elisa utilisées sur le sang
II. RESULTATS 
II.1. CONTRIBUTION A LA VALIDATION DE LA PCR EN TEMPS REEL SUR LE LAIT DE TANK
A. REPRESENTATION GRAPHIQUE DE LA VARIABILITE OBTENUE
1. Ensemble des valeurs
2. Variabilité de l’échantillon de surface « S »
3. Variabilité de l’échantillon au fond du tank « F »
C. REPETABILITE ET REPRODUCTIBILITE : ENSEMBLE DES VALEURS
1. Répétabilité et reproductibilité de premier ordre (R1)
2. Reproductibilités de deuxième et troisième ordres (R2 et R3)
D. VALEURS PAR FRACTION
II.2. UTILISATION DE LA PCR EN TEMPS REEL POUR LA REFORME CIBLEE
A. SYMPTOMATOLOGIE
B. RESULTATS DES PCR SUR LAITS DE TANK
C. RESULTATS DES PCR SUR PRELEVEMENTS INDIVIDUELS DE LAIT
1. Résultats globaux
2. Cheptel n° 1
3. Cheptel n° 2
4. Cheptel n° 3
5. Cheptel n° 4
6. Cheptel n° 5
D. RESULTATS DES SEROLOGIES
1. Trousse Elisa P48 (Idexx)
2. Trousse Elisa à antigène total (LSI)
E. COMPARAISON DES RESULTATS OBTENUS EN PCR ET EN SEROLOGIE
G. SUIVI DES TROUPEAUX SUR LA CAMPAGNE 2013-2014
III. DISCUSSION
III.1. CONTEXTE SPECIFIQUE DE L’AGALACTIE CONTAGIEUSE DANS LES PYRENEES-ATLANTIQUES
A. NECESSITE D’ASSAINIR LA SITUATION DANS LES PYRENEES-ATLANTIQUES
1. Une région touchée par l’Agalactie Contagieuse
2. Un impact économique et zootechnique important
B. INTRODUCTION DE LA PCR EN TEMPS REEL
III.2. CONTRIBUTION A L’EVALUATION DE LA PCR EN TEMPS REEL APPLIQUEE AU LAIT DE TANK
A. EN ELEVAGES, UN PROTOCOLE SIMPLE POUR UNE ETUDE PRELIMINAIRE
B. AU LABORATOIRE, UNE ETUDE COMBINEE DE LA REPETABILITE ET DE LA REPRODUCTIBILITE
C. INTEGRER LA VARIABILITE DES RESULTATS OBTENUS POUR AMELIORER LA SENSIBILITE DE LA DETECTION
III.3. UTILISATION DE LA PCR EN TEMPS REEL ET DE LA SEROLOGIE POUR LA REFORME CIBLEE
A. PERTINENCE DE L’UTILISATION DE LA PCR EN TEMPS REEL
1. Analyses de lait pour détecter les excrétrices
2. Une surveillance sur le lait de tank au cours de la campagne 2012-201
3. La surveillance sur le lait de tank au cours de la campagne 2013-2014
4. Analyses individuelles de lait
B. TESTS SEROLOGIQUES ET SEUILS
C. ELIMINATION DES BREBIS EXCRETRICES.
D. BREBIS PRESENTANT DES SIGNES DE MAMMITES CHRONIQUES
E. ELIMINATION DES BREBIS PRESENTANT UN RESULTAT DE SEROLOGIE POSITIF
F. CAUSES POSSIBLES D’ECHEC DU PROTOCOLE
1. Insuffisance de sensibilité et entretien de l’excrétion : rôle des brebis infectées chroniquement
2. Rôle des autres animaux et de la faune sauvage
3. Recontamination du cheptel
G. PERTINENCE D’UN PROTOCOLE D’ASSAINISSEMENT PAR ABATTAGE PARTIEL
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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