ANALYSE SPECTRALE DES SOUCHES PAR SPECTROMETRIE MALDI-TOF

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Classification génotypique

La classification basée sur des critères morphologiques seuls s’avère ainsi peu fiable, des méthodes moléculaires se sont développées. L’étude des isoenzymes a montré un polymorphisme au sein d’une même groupe selon la classification de Pussard et Pons. La classification phylogénétique des acanthamibes repose désormais sur le séquençage de l’ADNr (Acide Désoxyribonucléique ribosomal) 18S. A travers l’analyse des variations de séquences, vingt génotypes d’Acanthamoeba (T1-T20) ont été établis : T1-T12 [16], T13 [17], T14 [18], T15 [19], T16 [20], T17 [21], T18 [22], T19 [23] et T20 [24] (Figure 2). Les génotypes T21 et T22 ne sont pas mentionnés sur la figure 2 car les séquences n’ont pas encore été décrites dans des publications mais les informations disponibles démontrent l’existence de ces deux autres génotypes d’Acanthamoeba (Numéros d’ordre CDEZ00000000.1 et KX840327.1).

Ecologie des Acanthamoeba spp.

Les Acanthamoeba spp. sont des protozoaires ubiquitaires, naturellement et largement répandus dans la nature [25] [26], Ils peuvent être retrouvés dans des environnements très différents : mer, sédiments océaniques [27], plages, rivières et lacs [28], sol [29], poussière et dans l’air [30]. Ils ont également été isolés de bouteilles d’eau minérale [31] et d’eau déminéralisée, de tours de refroidissement de centrales nucléaires et électriques [32], de piscines [33] mais aussi sur des légumes [34], et d’animaux (poissons, reptiles, …) [35].
En France, les eaux potables peuvent renfermer entre 103 à 104 amibes par litre, résistant à la chloration et ozonisation, l’exposition humaine aux amibes est fréquente.
Ainsi, des amibes peuvent être isolées dans divers échantillons d’origine humaine (sécrétions pulmonaires, sinus maxillaire, autogreffes de mandibules, lésions cutanées, selles) et des lentilles de contact.
Leur présence a également été rapportée dans des hôpitaux dont au niveau des services de dialyse [36], et des unités dentaires [37]. Les Acanthamibes sont capables d’endosymbiose avec les autres micro-organismes et peuvent ainsi servir d’hôtes pour des bactéries pathogènes telles que Legionella spp., Francisella tularensis, Mycobacterium massiliense [38] [39] [40] et pour certains virus tels Echovirus [41]. Véritable cheval de Troie, Acanthamoeba spp. présente ainsi un risque sanitaire en milieu hospitalier ou thermal. Au vu de la répartition cosmopolite de ces parasites et de leur large distribution dans l’environnement, il n’est pas surprenant de retrouver des anticorps antiAcanthamoeba chez la majorité des individus sains, comme le rapporte Cursons et al. [42]

Cycle de vie et Morphologie d’Acanthamoeba

La structure d’Acanthamoeba correspond à la structure de base des amibes (Figure 3).
L’étude par microscopie électronique de son organisation cellulaire rapporte la présence de différents compartiments et organites:
-la membrane plasmique ou plasmalemme qui sépare le cytoplasme du milieu extérieur;
-le cytoplasme constitué de l’ectoplasme : partie périphérique du cytoplasme qui vaintervenir dans la formation de pseudopodes; et de l’endoplasme : partie centrale granuleuse de l’amibe contenant les organites ;
-un noyau : proéminent et central il contient le matériel génétique de l’amibe ;
– des vacuoles alimentaires dont le rôle est la digestion ;
-des vacuoles contractiles : vacuoles permettant d’évacuer l’eau en excès dans le cytoplasme et d’assurer l’osmorégulation;

Forme kystique

Le kyste d’Acanthamoeba est ainsi plus petit que le trophozoïte, avec une taille variable comprise entre 15 et 30 µm de diamètre selon l’isolat, et se caractérise par la présence d’une double paroi qui lui confère sa grande résistance dans l’environnement.
La paroi du kyste mature est constituée d’une couche externe ou ectokyste, et d’une couche interne ou endokyste. L’ectokyste contient des protéines et des polysaccharides [48] alors que l’endokyste est composé de cellulose. L’endokyste peut adopter une forme variable : il peut être ovale, sphérique, polygonal ou encore étoilé (Figure 6 [49]). Le kyste est uninucléé et possède un noyau rond et central. Il possède également des pores nommés ostioles, situés à la jonction de l’exokyste et de l’endokyste, qui permettent de détecter les variations des conditions environnementales. Grâce à sa morphologie, le kyste d’Acanthamoeba représente la forme de résistance du parasite, sa double paroi lui assurant une extrême résistance à de fortes variations de températures, à la dessication, aux agressions chimiques et médicamenteuses ainsi qu’à de fortes variations de pH [50,51]. Il peut rester viable plusieurs années dans l’environnement, faisant ainsi perdurer le potentiel pathogène d’Acanthamoeba et la transmission des infections [52].

Nutrition d’Acanthamoeba

L’alimentation des Acanthamoebae se compose de bactéries [53], d’algues, de champignons [54] et d’autres protistes présents sur des surfaces favorisant la formation de biofilms [55], dans divers environnements, et même parfois à l’interface air-eau [56].
Ils se nourrissent selon deux mécanismes différents :
-la phagocytose qui leur permet d’internaliser et d’ingérer des particules et des microorganismes. Il s’agit d’un processus particulier d’endocytose au cours duquel les pseudopodes vont faciliter la captation de la particule ou du micro-organisme cible qui va être ingéré(e), déclenchant alors la libération d’une substance toxique et la formation d’une vacuole digestive : les éléments sont phagocytés ensemble dans une vésicule, formant ainsi des phagosomes qui vont fusionner avec des lysosomes dans le cytoplasme et permettre la digestion des nutriments ;
-la pinocytose qui est un processus d’endocytose non spécifique, continu lors de la croissance cellulaire. Elle permet d’ingérer, par invagination de la membrane, de grandes quantités de liquides et d’éléments nutritifs dissouts.
Les Acanthamoebae peuvent ainsi subvenir à leurs besoins nutritionnels en autonomie.
Elles possèdent en outre la capacité d’héberger d’autres micro-organismes, tels que Legionella spp. , leur assurant une survie prolongée et une résistance accrue à l’action de certains antibiotiques et antiseptiques [57]

La Kératite Amibienne (AK)

o Epidémiologie
La kératite amibienne est une infection oculaire rare mais sévère, de mauvais pronostic.
Elle représente aujourd’hui la pathologie la plus fréquente à Acanthamoeba spp.. Rapportée pour la première fois en 1974 par Nagington et al. [1] au Royaume-Uni et en 1975 par Jones et al. aux Etats-Unis [58], son incidence n’a cessé de croître à travers le monde, le port de lentilles de contact constituant le principal facteur de risque de kératite amibienne . Les chiffres recueillis dans la littérature montrent une incidence plus forte dans les pays développés : le nombre de kératites amibiennes est estimé entre 17.53 et 19.50 cas par million de porteurs de lentilles au Royaume-Uni contre 1,65 à 2.01 cas par million de porteurs de lentilles aux Etats-Unis [59]. En France, 1 cas pour 30 000 porteurs de lentilles de contact est rapporté en 2007 mais ce chiffre est en constante augmentation [60]. La distribution des Acanthamoebae étant ubiquitaire, des cas d’AK ont été décrits dans le monde entier, notamment au Mali [61] et au Ghana [62]. Ces chiffres sont liés à l’exposition à des facteurs de risque (port de lentilles, facteurs environnementaux : températures, …) mais également à la capacité à détecter l’infection.
o Facteurs de risque
La kératite amibienne survient principalement chez des patients immunocompétents.
Différents facteurs de risque ont été identifiés, le principal facteur de risque étant le port de lentilles de contact associé à un contact avec de l’eau contaminée [63]. Ils sont répertoriés dans le tableau 3 ci-dessous.

Les Matériaux à Changement de Phase

Critère de sélection d’un bon MCP

La sélection d’un MCP nécessite de se poser les bonnes questions quant à l’application et l’implantation du système de stockage futur. Une réflexion et analyse autour de la densité de stockage souhaitée, des puissances de charge et de décharge mais aussi des critères économiques et environnementaux sont à entreprendre pour sélectionner le meilleur MCP. Plusieurs méthodes ont été proposées par différents auteurs afin de choisir au mieux un matériau pour une application spécifique [20-24]. Cependant, il n’existe aucune méthode privilégiée.
Dans ce paragraphe, les propriétés idéales sont donc présentées à titre indicatif et classées en quatre catégories : propriétés thermophysiques, propriétés cinétiques et chimiques, propriétés économiques et propriétés mécaniques.
Propriétés thermophysiques
Il existe un grand nombre de matériaux qui peuvent être identifiés comme MCP, du point de vue de la température de fusion et de la chaleur latente.
Les propriétés thermiques idéales sont les suivantes [22;24]:
– Le point de fusion/solidification se situe dans la plage de fonctionnement du procédé.
– Le MCP a une grande chaleur latente de fusion afin qu’une petite quantité de matériau stocke une grande quantité d’énergie. Cette valeur est essentielle pour obtenir une grande densité énergétique de stockage exprimée en J/m3 (kWh/m3) ou J/kg (kWh/kg).
– Une capacité calorifique élevée fournit un effet supplémentaire de stockage de chaleur sensible.
– Le MCP présente une grande conductivité thermique, de sorte que le gradient de température entre le fluide caloporteur et la température de fusion est faible. Cette valeur est déterminante quant à la puissance échangée dans le système de stockage aussi bien en charge qu’en décharge. Pour la majorité des MCP, la valeur de la conductivité thermique ne dépasse cependant pas 0.5 W/(m.K)
Les propriétés physiques idéales sont les suivantes [22;24] :
– La densité du MCP est élevée, afin que la densité énergétique soit élevée, ce qui permet de réduire les volumes de stockage.
– L’expansion volumique lors du changement de phase est faible afin de limiter les surpressions et les risques de fuite dans le réservoir. L’expansion volumique est souvent de l’ordre de 10 % pour les MCP. Cette expansion volumique peut cependant être favorable aux transferts thermiques, notamment à la charge.
– La pression de vapeur saturante doit être faible pour limiter les risques de vaporisation. En effet, si la pression de vapeur saturante est trop élevée, un ciel gazeux en surpression devra être mis en place dans le réservoir de stockage pour éviter la perte du produit par vaporisation.
– Le produit présente une fusion/solidification congruente : les différentes phases présentent un équilibre favorable et ne se séparent pas au fur et à mesure des cycles, ce point est sensible pour les hydrates de sels.
Propriétés cinétiques et chimiques
Les propriétés cinétiques idéales sont les suivantes [22;24] :
– Le matériau ne présente pas de surfusion pour que la chaleur stockée puisse être restituée à la même température que la température de stockage. La surfusion est la capacité du MCP à descendre sous le point de cristallisation tout en restant sous forme liquide. Il s’agit d’un état métastable qui est rompu soit par une perturbation extérieure (choc, impureté), soit par abaissement de la température jusqu’au point de nucléation, c’est-à-dire lorsque le premier germe de solide apparaît. Ainsi, si cette surfusion est assez importante, la chaleur est restituée à une température plus faible que la température de stockage. Il est remarqué dans la littérature qu’un degré de surfusion de 5-10 °C peut aller jusqu’à empêcher la décharge du système de stockage [24].
– Par ailleurs, la vitesse de cristallisation est déterminante pour la puissance du système de stockage. Si le produit est long à cristalliser, il rendra sa chaleur très lentement et limitera la puissance échangée avec le fluide caloporteur.
Les propriétés chimiques idéales sont les suivantes [22;24]:
– La stabilité chimique à long terme permet le cyclage des MCP, sans dégradation chimique du matériau. Pour un système de stockage, on appelle « cyclage », la succession des charges et des décharges.
– Le MCP n’est ni toxique, ni explosif, ni dangereux pour l’environnement.
– Son potentiel de corrosion est faible et il est compatible avec les matériaux utilisés dans la construction de l’échangeur (acier, inox, cuivre, aluminium etc…) ainsi qu’avec le fluide caloporteur (vapeur, eau, huile thermique etc…)

Les composés organiques

On trouve dans les composés organiques principalement les paraffines, les alcools de sucre, les acides gras et d’autres composés moins utilisés comme les cétones ou les esters.

Paraffines

Les paraffines sont une famille d’hydrocarbures saturés de formule brute CnH2n+2, aux propriétés très similaires. Parmi les MCP solide-liquide, elles sont les plus utilisées, surtout pour les applications à basse température (de -10 à 100 °C) car elles offrent l’avantage d’avoir une chaleur latente qui dépend de la masse molaire et des températures de changement de phase variables, donnant de la flexibilité pour choisir le MCP approprié à chaque application. Dans cette catégorie, on peut citer notamment les paraffines n-Hexadecane (Tfusion = 22 °C), n-Nonacosane (Tfusion = 63,4 °C) ou encore le n-Triacontane (Tfusion= 65,4 °C) [26].

Avantages

En général, plus la longueur moyenne de la chaîne hydrocarbonée est élevée, plus la température de fusion et la chaleur latente sont grandes [27]. En utilisant cette relation, des mélanges de différentes paraffines peuvent être faits pour imaginer le MCP approprié à chaque cas [26]. Les paraffines ne montrent pas de tendance à la ségrégation des phases lors de leur transition et sont chimiquement stables. En effet, Hadjieva et al. [28] a pu tester la robustesse de trois échantillons de paraffine pendant 900 cycles d’opération. A. Sharma et al. [24] affirme même que les propriétés des paraffines restent stables après 1500 cycles. Parmi les avantages des paraffines, on peut aussi citer la faible pression de vapeur saturante qui limite les risques de vaporisation. De plus, certaines sont considérées comme non toxiques, inoffensives écologiquement et compatibles avec les réservoirs métalliques car elles ne provoquent pas ou peu de corrosion. Enfin, elles sont produites en quantités importantes par l’industrie des procédés chimiques et sont donc facilement disponibles et peu coûteuses [29].

Inconvénients

Cependant, leur conductivité thermique reste très faible (≈ 0,25 W/m.K) et elles présentent une expansion volumique assez élevée (≈ 15 %) [30] et une densité peu importante. (≈ 800 kg/m3 [26]). Par ailleurs, des précautions sont à prendre lors de l’utilisation des réservoirs en plastique, car les paraffines ont tendance à s’infiltrer dans certains plastiques et à les ramollir [31].
On notera que la gamme de température des paraffines (-10 à 150 °C) ne couvre pas le spectre de l’application de la valorisation de la chaleur fatale. L’élargissement de la gamme de MCP aux composés non-paraffiniques permet de couvrir plus largement les domaines de température et de choisir des MCP avec des propriétés très variées. On peut identifier deux groupes majeurs : les acides gras et les alcools de sucre présentés ci-après.

Acides gras

Les acides gras sont caractérisés par la formule chimique CH3(CH2)2nCOOH et ont à peu près les mêmes propriétés thermophysiques que les paraffines. L’intérêt d’utiliser les acides gras comme MCP est de couvrir une gamme de température allant de 40 à 150 °C selon la longueur de la chaîne carbonée. Les acides gras les plus connus pour leur utilisation comme MCP sont l’acide stéarique (Tfusion = 57.5 °C), l’acide sébacique (Tfusion = 132 °C), l’acide palmitique (Tfusion =61-63 °C) et l’acide myristique (Tfusion = 51.5-53.6 °C) [32].

Avantages

Les acides gras présentent une chaleur latente de fusion du même ordre que celle des paraffines, voire légèrement en-dessous et un comportement similaire lors de la transition de phase, avec pas ou très peu de surfusion et une variation de volume du même ordre de grandeur. Par ailleurs, plus le nombre de carbones dans leur chaîne carbonée est élevé, plus la température de fusion, la chaleur latente ainsi que le degré de cristallisation sont grands [26]. La possibilité d’obtenir des mélanges eutectiques d’acides gras a permis d’élargir la plage de température des matériaux et ainsi la plage des applications [33]. Les acides gras sont facilement produits à partir d’huiles végétales et animales. Ainsi, ils donnent l’assurance d’un approvisionnement bio-sourcé.

Inconvénients

Quelques auteurs constatent un problème de stabilité des acides gras au-dessus du point de fusion [34]. Cette dégradation peut être cependant due à la vaporisation du produit lorsqu’il est sous forme liquide et non à une réelle dégradation du produit.

Alcools de sucre

Les alcools de sucre sont des composés organiques appartenant à la famille des polyols. Les plus connus sont le sorbitol, le mannitol, le xylitol, le lactitol, le malitiol et l’érythritol [35]. Ces produits sont extraits des plantes et peuvent être qualifiés de bio-sourcés. Par exemple, le mannitol provient des algues alors que le sorbitol est extrait du sirop de maïs.

Avantages

Les alcools de sucre possèdent des valeurs d’enthalpie de phase élevées. On relève ainsi une enthalpie de fusion de 344 J/g pour l’érythritol, de 280 J/g pour le xylitol ou encore 341 J/g pour le mannitol [36]. Ils présentent aussi une grande masse volumique de l’ordre de 1500 kg/m3, ce qui conduit à une densité énergétique très élevée. Ce sont par ailleurs des produits peu coûteux et non toxiques. Akihide et al. [37] ont mesuré les propriétés thermophysiques et de transfert de chaleur de six alcools qui pourraient être utilisés comme MCP dans les systèmes de transport des rejets thermiques. Ces essais montrent que l’érythritol (C4H10O4) est le matériau le plus approprié par sa chaleur latente élevée et sa stabilité chimique, suivi du mannitol.

Inconvénients

Un des inconvénients les plus connus des alcools de sucre est leur tendance à la surfusion, qui peut d’ailleurs être utilisée pour faire du stockage inter-saisonnier [35] car elle permet de maintenir le MCP liquide sous le point de solidification sans qu’il libère ainsi sa chaleur. Seulement, cet état métastable empêche la restitution de la chaleur à la température de changement d’état souhaitée. Plusieurs techniques ont été développées pour pallier ce problème de surfusion. Les ultrasons, la micro-encapsulation, le bullage, l’ensemencement ou encore l’agitation sont proposés comme techniques pour maîtriser l’apparition des premiers cristaux.
Par ailleurs, beaucoup d’alcools peuvent exister dans deux ou plusieurs états cristallins, appelés polymorphes [38]. Diverses formes peuvent apparaître pendant le processus de cristallisation, en fonction de facteurs tels que le solvant, la température, les additifs, et la méthode de préparation. Différents polymorphes peuvent montrer des propriétés physico-chimiques très différentes [39]. Par ailleurs, certains alcools de sucre présentent des problèmes de compatibilité avec l’air ambiant car ils réagissent avec l’oxygène [39].
Les trois familles de composés présentés dans ce paragraphe sont les principaux composés organiques actuellement rencontrés dans la littérature. S’ajoutent à cette catégorie également des cétones, tels que l’hydroquinone ou la quinone, ou encore des acides non gras tels que l’acide benzoïque ou l’acide salicylique mais aussi des polymères tels que le polyéthylèneglycol.

Les composés inorganiques

Les matériaux inorganiques sont classés en trois catégories : les sels, les hydrates de sels et les métaux.

Hydrates de sels

Les hydrates de sel sont des sels inorganiques qui contiennent de l’eau et dont la formule générale est AB.nH2O. Pendant la charge, la déshydratation du sel a lieu. Le produit de cette déshydratation peut être un hydrate de sel avec moins molécules d’eau selon la formule :
. n 2O → . m 2O + (n − m) 2O Ou bien le même sel sous sa forme anhydre :
. n 2O → + 2O
Le sel hydraté le plus utilisé par son faible coût est le CaCl2.6H2O (Tfusion = 28-30 °C). On peut citer aussi le Mn(NO3)2.6H2O pour les applications de climatisation, et un nouveau matériau obtenu à partir de Al2(SO4)3.18H20 utilisé avec des additifs pour des applications industrielles autour de 100°C. On peut aussi citer la bischofite comme exemple d’un mélange d’hydrates de sels composée à 95 % massique de MgCl2.6H2O et à 5 % massique de KMgCl3.6H2O, Li2SO4.H2O et autres sels ioniques tels que NaCl et KCl et ayant une température de fusion autour de 98.9 °C [40].

Avantages

Les hydrates de sel sont appropriés pour leur utilisation dans le stockage thermique parce qu’ils présentent une grande chaleur latente (≈ 100-300 kJ/kg), une température de fusion adaptée aux applications à basse température (≈ 8-100 °C) et sont largement compétitifs en termes de coût et de rentabilité [26]. Ils sont en effet déjà commercialisés pour servir comme matériaux de stockage et disponibles en gros volume. Par ailleurs, ils présentent une conductivité thermique plus élevée que les paraffines (environ 0,5 W/m.K) [41].

Inconvénients

Le principal problème qui se pose lors de l’utilisation des hydrates de sels est leur fusion non congruente, ce qui veut dire que le sel n’est pas totalement soluble dans l’eau d’hydratation au niveau du point de fusion. Ainsi, au moment de la fusion, il peut se former une solution aqueuse saturée en sel et le surplus de solide peut se déposer au fond du container par sa différence de masse volumique, ce qui empêche la solidification suivante [42]. Différentes solutions ont été proposées, comme par exemple : l’agitation mécanique, l’encapsulation du MCP, l’utilisation d’un excès d’eau pour éviter la saturation de la solution ou encore l’ajout d’additifs [41].

Table des matières

INTRODUCTION
I. LES ACANTHAMIBES : GENERALITES
I.1 PRESENTATION GENERALE
I.2 CLASSIFICATION MORPHOLOGIQUE ET GENOTYPIQUE
Classification morphologique
Classification génotypique
I.3 ECOLOGIE DES ACANTHAMOEBA SPP.
I.4 CYCLE DE VIE ET MORPHOLOGIE D’ACANTHAMOEBA
Les trophozoïtes
Forme kystique
I.5 NUTRITION D’ACANTHAMOEBA
I.6 PATHOGENICITE HUMAINE
I.6.1 La Kératite Amibienne (AK)
I.6.2 Autres pathologies liées à Acanthamoeba spp
I.7 PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 SOUCHES DE REFERENCE ET ISOLATS CLINIQUES
II.2 CULTURE DES SOUCHES
II.3 GENOTYPAGE DES SOUCHES
II.4 CARACTERISATION PROTEOMIQUE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE MALDI-TOF
II.4.1 Préparation des échantillons et extraction protéique
I.4.2 Paramètres utilisés sur spectromètre de masse MALDI-TOF
III. RESULTATS
III.1 GENOTYPAGE
III.2 ANALYSE SPECTRALE DES SOUCHES PAR SPECTROMETRIE MALDI-TOF
III.2.1 En fonction du protocole d’extraction
III.2.2 En fonction du stade du parasite
III.2.3 En fonction du parasite (parasite, genre, espèce, génotype)
III.2.4 Répétabilité et reproductibilité
III.2.5 En fonction du temps de culture
IV DISCUSSION
V. PERSPECTIVES
VI CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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