ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE

ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE

Définition, Principe et Appareillage 

La chromatographie permet la séparation ou la purification d’un ou de plusieurs composés d’un mélange en vue de leur identification et de leur quantification.La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui n’étaient auparavant pas possible avec les techniques sur couche mince ou en phase gazeuse.A l’origine la chromatographie en phase liquide se faisait sur des colonnes en verre. Le liquide traversait la phase stationnaire par gravité ou sous faible pression. Puis pour augmenter le débit, des manipulations ont été réalisées sous pression plus forte. C’est ce que l’on appeler la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC). Très rapidement le P de pression est devenu le P de performance lorsque l’on a optimisé la technique (diminution de la taille de particules de la phase stationnaire, régularité de cette phase…).

Principe 

Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique. Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire.En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.

Appareillage 

Réservoir de la phase mobile (solvant)

La phase mobile est pompée à partir d’une bouteille et parcourt en permanence le chromatographe : l’injecteur, la colonne dans le four et le détecteur. La température du four est maintenue constant, le signal du détecteur est amplifié et enregistré.Le plus souvent ce réservoir est une bouteille en verre dans lequel plonge un tube avec une extrémité filtrante en téflon. S’il est nécessaire le dégazage peut se faire par agitation puis conservation du solvant sous atmosphère d’hélium.

Pompe

Elle délivre en continu la phase mobile. Elle est définit par la pression qu’elle permet d’atteindre dans la colonne, son débit, et la stabilité du flux. Actuellement les paramètres d’une pompe sont :
* débit : 0,01 à 10 mL/min
* stabilité < 1% (<0,2% pour des chromatographies d’exclusion diffusion)
* pression maximale > 350 bars
Certaines sont pilotées par informatique (bien utile lors de l’utilisation de gradient
d’élution)

Injecteur

Le type d’injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle d’échantillonnage d’une capacité fixe (10, 20, 50 µL…). Cette boucle permet d’introduire l’échantillon sans modifier la pression dans la colonne.Vanne à boucle d’échantillonnage Elle possède 2 positions. La première permet le remplissage de la boucle d’injection de volume fixe (load), la seconde permet la mise en circulation de l’échantillon dans le système chromatographique (inject). Le remplissage de la boucle d’injection se fait à l’aide d’une seringue.

Colonne

En mode analytique, les colonnes en inox ont généralement un diamètre interne de 4,6mm. La longueur est de 5, 10, 15, ou 25cm. Le remplissage (en silice, silice greffée ou particules polymériques) a une granulométrie de 3, 5, ou 10µm. Le diamètre interne d’une colonne est usuellement de 4 ou 4,6 mm. Si des substances pures doivent être collectées en fin de chromatogramme des colonnes de gros diamètre seront nécessaires.

Détecteurs

Le détecteur suit en continu l’apparition des solutés. Pour détecter, on utilise différents phénomènes physico-chimiques. Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps. Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase mobile et le soluté à celui de la phase mobile seule.Le détecteur le plus utilisé en CLHP est un spectrophotomètre d’absorption UV-visible (190-600 nm) relié à la sortie de colonne.
Il existe d’autres détecteurs :
• réfractomètre différentiel
• UV à barrette de diodes
• électrochimique
• fluorimétrique…
Ainsi que différents types de couplage :
• Spectrométrie infrarouge
• Spectrométrie de masse
• Résonance Magnétique Nucléaire…

Intégrateur

La chromatographie est une méthode de séparation utilisée en vue d’un dosage. Il faut donc avant tout chercher à séparer correctement les pics avant de les intégrer. Une intégration consiste à mesurer la surface sous un pic.
La détection d’un pic chromatographique par l’intégrateur, dépend de 2 paramètres :
* la largeur attendue des pics
* le seuil d’intégration (sensibilité)
La largeur de pic est à peu près prévisible en fonctions de la technique d’analyse et des conditions opératoires. Elle détermine la fréquence d’échantillonnage du signal. Le pic est alors découpé en tranches. Le seuil d’intégration est la valeur du signal à partir de laquelle le calculateur repère un début de pic.

 Précaution d’utilisation des modules de la HPLC

Utilisation des colonnes d’HPLC 

Les colonnes sont conditionnées avec un solvant ou un mélange de solvant. Il faut impérativement utiliser un solvant miscible avec les solvants contenus dans la colonne. Pour passer d’un solvant à un autre et si les 2 solvants ne sont pas miscibles entre eux (passage de l’eau au cyclohexane par exemple), il faut utiliser un solvant intermédiaire pour purger la colonne. L’isopropanol ( propan-2-ol) convient dans un grand nombre de cas ( eau →isopropanol→cyclohexane).Pour garantir une meilleure durée de vie de la colonne, il faut éviter les changements brutaux de débits et de viscosité afin de toujours faire varier la pression graduellement. Respecter les consignes des fabricants : pression et température maximale admissible, phase
mobile.

Choix de la phase mobile 

Les solvants utilisés doivent avoir impérativement une qualité HPLC (HPLC Grade). Si le solvant est de l’eau issue d’un purificateur, il faut vérifier sa résistivité. Une eau de qualité HPLC, doivent être de préférence pré-filtrés et dégazés et leur pH doit rester dans les spécifications de la colonne.Lors de l’utilisation de solutions tampons, d’acides ou de sels dissous, il faut purger la colonne avec de l’eau. Le temps de purge varie selon la taille de la colonne et les conditions expérimentales.Les échantillons injectés doivent être filtrés et miscibles dans la phase mobile.Régénérations de la colonne: des séquences de passage de solvants permettent de régénérer la colonne. Se conformer aux indications du fabricant.

pH de la phase mobile 

Le pH de la phase mobile doit être compris entre 2 et 7,5. Des pH plus élevés dissolvent le gel de silice et des pH inférieurs à 2 peuvent détacher une partie du greffage. L’ajustement du pH doit être exclusivement effectué sur le composant aqueux de la phase mobile et non sur le mélange .si des solutions tampons sont utilisées, il convient de rincer soigneusement le système avec un mélange d’eau et du modifiant organique de la phase mobile (5 % V/V) une fois la chromatographie terminée, afin d’éviter la cristallisation des sels.

Installation de la colonne 

Avant de raccorder votre colonne, assurez-vous que les tubulures de votre système HPLC soient bien purgées de toute phase mobile préalablement utilisée. (Cela permet d’éviter d’envoyer vers votre colonne HPLC de la phase mobile potentiellement incompatible avec la colonne ou son solvant de stockage.) Vérifiez le sens du débit et connectez la colonne.Il est recommandé d’utiliser une colonne de garde, avec son support, afin de protéger la colonne des produits contaminants et d’allonger sa durée de vie.

Solvants et échantillons 

Utilisez des solvants frais, de qualité HPLC.
· Filtrez les tampons avec un filtre 0,45μm, avant leur utilisation.
· S’assurer que les solvants utilisés soient miscibles. (Tableau de miscibilité des solvants).
· Si on veut utiliser un mélange de solvants organiques et de tampons, testez la
miscibilité et la solubilité de l’échantillon dans ce mélange, avant utilisation.
· Filtrez votre échantillon avec un filtre 0,45μm.

Stabilité des conditions expérimentales 

Toute variation du débit ou de la composition de la phase éluant entraîne une modification de la forme ou de la position du pic d’élution enregistré sur le chromatogramme.

Influence du débit 

La plupart des détecteurs utilisés en CPL sont des détecteurs différentiels qui mesurent des variations de grandeurs proportionnelles à la concentration du soluté dans l’effluent. Il existe une relation entre l’aire enregistrée A et le débit de l’effluent : Toute variation du débit entraîne, toutes choses égales par ailleurs, une modification de l’aire enregistrée. Il est donc impératif de stabiliser parfaitement le débit de l’éluant pendant les analyses pour pouvoir baser les déterminations quantitatives sur l’aire des pics d’élution.
Si le débit de l’effluent ne peut être stabilisé, il est alors préférable de mesurer la hauteur du
pic d’élution plutôt que sa surface.En effet, la hauteur d’un pic d’élution correspond à la concentration maximale Cmax du soluté : celle-ci est donnée par la relation :
N : nombre de plateaux théoriques contenus dans la colonne chromatographique.
Le volume de rétention VR étant indépendant du débit de la phase éluant, seul le nombre de
plateaux N contenus dans la colonne varie ; mais Cmax ne varie que comme N1/2. De plus, si
l’on choisit un débit de phase éluant correspondant à une vitesse réduite voisine de la vitesse
optimale, les fluctuations du débit n’entraînent qu’une variation négligeable de la hauteur de
plateau théorique et par là du nombre de plateaux N.

Influence de la composition de la phase mobile 

Si la composition de la phase mobile varie, en raison par exemple de la volatilité d’un des solvants ou de la non-reproductibilité d’un gradient d’élution, le facteur de capacité des solutés varie et par là les caractéristiques de la séparation. Dans ces conditions, il est préférable de mesurer l’aire du pic d’élution, qui est sensiblement indépendante des fluctuations de la composition de la phase éluant, plutôt que sa hauteur qui varie avec celles-ci.

Caractéristiques du détecteur 

Les conditions de la détection sont sûrement un des points les plus critiques de l’analyse
quantitative en chromatographie en phase liquide.
Avant tout traitement du signal, il faut s’assurer :
Ø De la compatibilité du détecteur avec les conditions opératoires et la nature du soluté ;
Ø De la linéarité de sa réponse ;
Ø De la stabilité de sa ligne de base ;
Ø De sa sensibilité qui doit être compatible avec la mesure des concentrations envisagées.

Par ailleurs, il est important d’estimer les perturbations entraînées par les variations de la température de la phase mobile, les pulsations éventuelles du système de pompage, etc., et de se rappeler que, sans précautions particulières, les intégrateurs électroniques retranchent l’aire
des pics négatifs.

Stockage des colonnes 

Ø Phase inverse (C18 – C8…)
Après avoir utilisé la colonne avec un éluent contenant du tampon, enlevez toutes traces de tampons et de sels en rinçant la colonne avec de l’eau de qualité HPLC. Après que la colonne ait été minutieusement rincée, passez 10 volumes de colonne d’un mélange acétonitrile / eau, avant de la stocker.
Ø Phase normale (Si)
Nettoyez avec chlorure de méthylène et stockez sous hexane.
Quand la colonne n’est pas utilisée, bouchez bien chacune de ses extrémités avec les vis
prévues à cet effet et stockez à une température stable (20 – 25°C).
Ø Compatibilité des solvants avec les colonnes :

 utilisation des solvants selon le type de la colonne
· Le tableau illustre les solvants utiles pour garder les colonnes dans un bonne états aussi les solvants de stockage de ces dernières, ainsi les solvants a éviter pour ne pas détériorer la phase stationnaire des colonnes.

Table des matières

Introduction générale
Présentation générale du laboratoire SYNTHEMEDIC
CHAPITRE I : CARACTERISTIQUES DU PRODUIT (Acétate de lecainide)
I.1 Dénomination du médicament
I.2. Composition qualitative et quantitative
I.3.Structure du principe actif : acétate de flécainide
I.4. Donnes cliniques
I. 4.1. Indications thérapeutiques
I.4.2. Posologie et mode d’administration
I.4.3. Contre-indications
I.4.4. Précautions d’emploi
CHAPITRE II : ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE
(HPLC)
II.1. Définition, Principe et Appareillage
II.2. Précaution d’utilisation des modules de la HPLC
II.2.1.Utilisation des colonnes d’HPLC
II.2.2.Choix de la phase mobile
II.2.3.pH de la phase mobile
II.2.4.Installation de la colonne
II.2.5.Solvants et échantillons
II.2.6.Stabilité des conditions expérimentales
II.2.7. Influence du débit
II.2.8. Influence de la composition de la phase mobile
II.2.9.Caractéristiques du détecteur
II.2.10.Stockage des colonnes
CHAPITRE III : VALIDATION D’UNE METHODE ANALYTIQUE PAR L’APPROCHE DE
L’ERREUR TOTALE
III.1.Cycle de vie d’une méthode
III.1.1.Sélection de la méthode
III.1.2.Mise au point de la méthode
III.1.3.Validation de la méthode
III.1.4.Estimation de l’incertitude et vérification de l’aptitude
III.1.5. Utilisation en routine
III.1.6. Revalidation
III.2. Définition et objectif de la validation
III.2.1.Définition
III. 2.2.Objectif
III.3.Les critères de la validation analytique
III.4 .Approche de l’erreur totale
III.4.1.Définition et objectif
III.4.2.Avantage de l’approche de l’erreur totale
III.4.3.Etapes de la validation analytique basée sur le concept de l’erreur totale
CHAPITRE IV : VALIDATION DE LA METHODE DU DOSAGE D’ACETATE DE FLECAINIDE
PAR HPLC
IV .1.Mode opératoire :
IV. 2.Validation analytique
IV. 2.1.vérification de la sélectivité
IV. 2.1.Réalisation des gammes STD d’étalonnage, STD de validation
IV .3.Données brutes recueillies
IV. 4.Réalisation des étapes du concept de l’erreur totale
IV. 4.1.Fonction de réponse
IV. 4.2.Alignement des concentrations introduites par la fonction de réponse : Droite linéaire
IV. 4.3.Prédiction inverse
IV. 4.4.Calcul de la fidélité
IV. 4.5.Calcul de la justesse
IV. 4.6.Calcul des intervalles de tolérance
IV. 4.7.Profil d’exactitude
IV. 5.Génération de profil d’exactitude par la fonction de réponse transformation logarithmique et
racine carré :
Conclusion

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