Analyse HPLC/UV-vis-DAD/ESI-MS et HPLC/UV-vis/DAD

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Composition chimique

La plante est riche en composés polyphénoliques, qui sont les meilleurs antioxydants, flavonoïdes et tanins [6]. Elle contient aussi des anthocyanes, des acides phénoliques et d’autres substances en particulier l’ajugarine [7].

Les études phytochimiques ont montrés que l’ivette contient aussi des ecdystéroides, des diterpénoides, des iridoïdes et des saponosides acides [8].

Utilisations de la plante

En médecine traditionnelle, Ajuga iva est utilisé pour traiter le diabète et l’hypertension [9], ainsi que les troubles gastro-intestinales et l’ulcère de l’estomac [10]. L’ivette est efficace contre la fièvre, la diarrhée, les gaz, les maux de tête et les maux de dents. En usage externe, elle est souvent employée en applications locales contre les rhumatismes, comme antiseptique et cicatrisante sur les plaies [11].

La richesse de l’ivette lui donne plusieurs propriétés prouvées scientifiquement. C’est un agent antioxydant [12], antidiabétique et hypolipidémique [13], vasodilatateur et donc anti hypertensif [14], antibactérien et antifongique [4].

Artemisia herba alba (Asso)

Le genre Artemisia appartient à la famille des Astéracées (Composites), avec plus de 350 espèces différentes qui se trouvent principalement dans les zones arides et semi arides d’Europe, d’Amérique, d’Afrique du Nord et d’Asie. Les espèces d’Artemisia sont largement utilisées comme plantes médicinales en médecine traditionnelle [15].

Description botanique

L’armoise blanche est une plante des climats arides et semi-arides qui pousse dans les hautes plaines steppiques, les déserts du Moyen-Orient et de l’Afrique du Nord. C’est une plante herbacée à tiges ligneuses, ramifiées et tomenteuses de 30 à 50 cm de long. Les feuilles sont courtes, sessiles, pubescentes et argentées. Les capitules sont groupés en pannicules de petite taille de 1,5 à 3 mm allongés et étroits contenant de 3 à 6 des fleurs jaunâtres. Les bractées externes de l’involucre sont orbiculaires et pubescentes [16].

Composition chimique

Plusieurs métabolites secondaires ont été isolés et identifiés de l’Artemisia herba alba dont les plus importants sont les sesquiterpènes lactones tels que les eudesmanolides et les germacranolides [17]. Les flavonoïdes détectés dans l’armoise montrent aussi une diversité structurale allant des flavonoïdes communs (flavones glycosides et flavonols) jusqu’aux flavonoïdes méthylés qui sont très inhabituel. Les flavonoïdes glycosides comprennent les O-glycosides tels que quercitine-3-glucoside et des flavones C-glycosides qui sont rares dans le genre Artemisia, ainsi que dans l’ensemble des Astéracée [18,19].

En plus des sesquiterpènes lactones et des flavonoïdes l’analyse phytochimique a montré que la composition des huiles essentielles de l’Artemisia herba alba Asso est riche en monoterpènes, triterpènes pentacycliques, santonines, coumarines et tanins [20].

Utilisations de la plante

L’Artemisia herba alba est très utilisé en médecine traditionnelle lors d’un désordre gastrique tel que la diarrhée et les douleurs abdominales. Elle est aussi utilisée en tant que remède de l’inflammation du tractus gastro-intestinal [21].

Plusieurs études scientifiques ont également prouvées l’efficacité de l’armoise blanche en tant qu’agent antidiabétique [22], leshmanicide [23], antiparasitaire, antibactérien, antiviral, antioxydant, antimalarien, antipyrétique, antispasmodique et antihémorragique [24].

Présentation de la zone d’étude

Localisation géographique

La Wilaya de M’Sila se situe à 35°40’ latitude Nord et 04°30’ longitude Est, sur une altitude d’environ 500 m. Elle est située au Sud Est d’Alger, limitée au Nord par les Wilayates de Médéa, Bordj Bou-Arreridj, Sétif et Bouira ; à L’Ouest par Djelfa ; à l’Est par Batna et au Sud par Djelfa et Biskra (Figure 4). Elle couvre prés de 18.175 km2. Du point de vue géographique, ce territoire ne présente aucune homogénéité [31].

Le sol

Le territoire de la wilaya constitue une zone charnière entre deux grandes chaînes de montagnes qui sont l’Atlas Saharien et l’Atlas Tellien ce qui lui donne une configuration géographique caractérisée par une zone
• de montagne de part et d’autre du chott El-Hodna,
• centrale constituée essentiellement de plaines et de hautes plaines,
• de Chott (Chott El-Hodna) au centre,
• de dunes de sables éoliens [32].

Climat de la région

Le climat de la région de M’Sila est caractérisé par un été sec très chaud et un hiver très froid avec

une pluviométrie faible et irrégulière de l’ordre de 260 mm/an [32].

Les précipitations

Une précipitation moyenne annuelle de 260 mm contribue à la détermination du caractère aride de la région, qui est accentuée par l’extrême irrégularité de la répartition des pluies au cours de l’année. La nature orageuse des pluies constitue l’autre facteur explicatif de la sévérité du régime pluviométrique qui se traduit par une dominance du ruissellement. Les configurations topographiques des bas fonds permettent cependant la rétention d’une grande partie des eaux de pluies [33].

Enquête ethnobotanique

La méthode d’étude est basée sur une fiche questionnaire ethnobotanique modifiée soumise aux enquêtés au cours d’entretiens individuels (Fiche questionnaire) [37].
Ce travail a duré plus de trois ans (2008/2009/2010) pendant lesquels nous avons réalisé des entretiens avec la plupart des herboristes des 48 communes de la Wilaya de M’Sila. Lors de chaque entretien nous avons collecté des informations sur l’enquêté et les plantes médicinales utilisées par celui-ci. Ainsi, le profil de chaque enquêté comprend le sexe, l’âge et le niveau d’étude.
Les données recueillies pour chaque plante comprennent le nom vernaculaire (nom commun), les usages, la partie utilisée et le mode de préparation. L’identification taxonomique des espèces a été réalisée ultérieurement à l’aide de la littérature [38,39] et par comparaison avec les échantillons de l’herbier du Département des Sciences de la Nature et de la Vie, Faculté des Sciences, Université de M’Sila.

Etude phytochimique

Méthode d’extraction

Nous avons utilisé une méthode d’extraction en continue grâce à l’extracteur Soxlhet. 20 g de matériel végétal sont introduits dans une cartouche en cellulose fixée sur un ballon, et surmonté d’un réfrigérant. 400 ml de méthanol à 85 % sont vaporisé puis condensé tout en restant en contact avec le matériel végétal. L’extraction est terminée lorsque le solvant d’extraction devient de plus en plus clair (après 6 heures).
Les extraits obtenus sont évaporés à sec à l’aide d’un rotavapor (Bucchi R210). Ils sont ensuite solubilisés dans du méthanol pur et conserver à 4°C pour les tests d’activités biologiques (antioxydante, antileishmanienne et antimicrobienne). L’extrait aqueux est utilisé pour l’évaluation de l’activité antidiabétique (Figure 6).

Analyses qualitatives et quantitatives des extraits de plantes

Dosage des phénols totaux

Le contenu total de polyphénols a été estimé selon la méthode colorimétrique basée sur le réactif de Folin Ciocalteu [40]. Le réactif est formé d’acide phosphotungestique H3PW12O40 et d’acide phosphomolybdique H3PMo12O4, qui sont réduits lors de l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de molybdène (Mo8O3), ce qui nous aide à doser les phénols dans le visible à une longueur d’onde de l’ordre 765 nm.
Pour cela 100 µl chaque extrait de plante a été mélangé à 200 µl du réactif de Folin et 3.16 ml de H2O. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 3 minutes. Ensuite 600 µl de la solution carbonate de sodium anhydre a 20% (poids/volume) sont ajoutés au mélange. Les polyphénols totaux sont déterminés après 2 h d’incubation à température ambiante par mesure de l’absorbance à 765 nm (Spectrophotometer UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan). La quantification est faite selon la courbe d’étalonnage standard de l’acide gallique. Les résultats sont exprimés en mg équivalent d’acide gallique par ml d’extrait [41].

Analyse HPLC/UV-vis-DAD/ESI-MS et HPLC/UV-vis/DAD

Les analyses HPLC/UV-vis-DAD sont effectuées à l’aide d’un appareil Waters équipé d’une pompe de chromatographie liquide de haute pression 1525 binaires munis d’un détecteur UV à barrettes de diodes (DAD) et d’un spectromètre de masse Quadrupol équipé d’une interface d’ionisation ESI en mode négatif (Micromass ZQ). Les analyses ont été réalisées en phase reverse avec une colonne C18 (5 μm, 250 x 4.6 mm) (Alltech, Italie). La température a été maintenue à 25°C avec un four de fléau (Hitachi L-2300, Italie) et le volume d’injecteur choisi était 20 μl. Les solvants utilisés sont de qualité HPLC et le débit est fixé à 1 ml/min. Les conditions chromatographiques consistent en un gradient ACN/HCOOH 2.5% avec le gradient suivant : 0 mn: 5% B; 10 mn: 15% B; 30 mn: 25 % B; 35 mn: 30% B; 50 mn: 90% B; ensuite laisser pendant 7 mn: 100% B.
Le détecteur UV à barrette diode (DAD) est réglé sur les signaux entre 190 nm et 800 nm en plaçant le détecteur à 330 nanomètres pour les acides cinnamiques et à 340 nanomètres pour les flavonoïdes. Des chromatogrammes d’ion total (TIC) ont été saisis en mode négatif, utilisant une tension de cône de -20 V avec un balayage des masses entre 1500 et 1800 éléments de m/z.
Les autres paramètres utilisés pour la saisie des TIC étaient :
• Tension capillaire : 2.75 kilovolts
• Température de source: 150°C
• Température de dissolvation: 280°C
• Écoulement de gaz (L/hr) : 400 (dissolvation) et 210 (cône).
Les données rassemblées ont été traitées par un logiciel de masse Lynx (v. 4.00) (Waters Milan, Italie).
La quantification des métabolites des extraits aqueux et méthanoliques des trois plantes a été effectuée a l’aide d’un appareil Dionex P580 équipé d’une pompe à haute pression binaire, un détecteur d’alignement de la photodiode PDA-100, un compartiment de fléau de TCC-100 thermostatés et un injecteur ASI-100 automatisé témoin. Les données rassemblées ont été traitées par un système de gestion de l’information de chromatographie Chromeleon (v. 6.70). Des passages chromatographiques ont été exécutés en utilisant les mêmes conditions expérimentales précédemment décrites. La quantification a été effectuée à 330 nanomètres pour les dérivés d’acides chlorogéniques et de verbascoside utilisant des courbes d’étalonnage établies avec de l’acide chlorogénique et le verbascoside (coefficient de corrélation R2 = 0.9992 et R2 = 0.9998, respectivement). La même longueur d’onde a été employée pour quantifié l’apigénine et ses dérivés (apigénine en tant que norme externe, R2 = 0.9999). La lutéoline et les métabolites relatifs ont été mesurés à 340 nanomètre utilisant la lutéoline elle-même pour accumuler la courbe d’étalonnage (R2 = 0.9999). Les analyses ont été effectuées en triple.

Evaluation des activités biologiques

Activité antidiabétique

Matériel végétal et préparation des extraits

Les plantes ont été récoltées pendant la floraison en Mai 2009 dans la région de Hammam Dalaa, M’Sila. La partie aérienne de chaque plante a été lavée, séchée à température ambiante dans l’obscurité et ensuite finement broyée.
L’extrait aqueux a été préparé selon la méthode traditionnelle ; environ 6 g de la poudre de plante sont mis dans de l’eau bouillante.
L’infusé est laissé refroidir pendant 15 minute à température ambiante. Après filtration, le volume final est noté pour le calcul des différentes doses administrées. Il est utilisé tel qu’il est pour le test antidiabétique sur les animaux.

Dosage des HDL/LDL

La méthode est directe et sans prétraitement de l’échantillon. Au cours de la première phase, les particules LDL, VLDL et Chylomicrons libèrent du cholestérol libre qui, soumit à une réaction enzymatique, produit du peroxyde d’hydrogène, lequel est dégradé sous l’effet de la réaction avec la POD et le DSBmt. Aucun dérivé coloré n’est formé [46].

Dosage des protéines totales

Les ions cuivriques dans un milieu alcalin, interagissent avec les liaisons peptidiques des protéines formant un complexe bleu violet où l’intensité de la couleur est proportionnelle à la quantité des protéines plasmatiques [47].

Dosage des transaminases TGO/ TGP

Les transaminases TGO et TGP présentes dans le sérum catalysent le transfert du groupement amine du glutamate vers l’oxaloacétate et le pyruvate dans des réactions réversibles. L’activité de ces enzymes est proportionnelle à la quantité du pyruvate où l’oxaloacétate formée après réaction avec 2. 4- Dintrophénylhydrazine (DNPH) dans un milieu alcalin [48].

Protocole du test de viabilité sur les promastigotes

• Principe
Des concentrations décroissantes de l’extrait à tester (de 100 à 10 µg/ml) sont solubilisées dans du DMSO pour analyse (Sigma-Aldrich), et disposées dans les puits d’une plaque 96 puits a fond plat. La concentration finale de DMSO par puits est inférieure à 1 %. Les parasites sont ajoutés dans les puits à raison d’environ 2.105 par puits (100 µl). Les plaques sont incubées 48 heures à 25°C [55].
La révélation se fait par l’ajout de 10 µl de MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide, 98%, Sigma-Aldrich) à 10 mg/ml. La plaque est incubée pendant 4 heures. Le MTT (de couleur jaune) va être transformé par les déshydrogénases mitochondriales en sel de formasan (de couleur bleu) (Figure 10). La réaction enzymatique est arrêtée par addition de 100 µl d’isopropanol-20% sulfate Dodécyl de sodium.
La plaque est laissée à température ambiante pendant 30 minutes avec agitation. La lecture de l’absorbance à 570 nm permet d’évaluer l’activité des enzymes, responsable de la viabilité des parasites en comparaison par rapport a un:
• Blanc (milieu seul)
• Contrôle positif (le glucantime à 10 µl)
• Contrôle négatif (milieu et parasites seuls)
La lecture se fait avec un spectrophotomètre lecteur de plaques 96 puits (Bio-Rad) [55].
La concentration d’inhibition des 50 % de la croissance des parasites, IC50 (µg/ml) est calculée après l’évaluation des pourcentages d’inhibition de croissance à différentes concentrations par le calcul de la tendance par logiciel Excel.
Tous les essais ont été répétés trois fois.
L’échelle de l’évaluation de l’activité est la suivante [56]:
• Très bonne activité pour une IC50 < 10 µg/ml
• Bonne activité pour une IC50 comprise entre 10 et 25 µg/ml
• Activité moyenne pour une IC50 comprise entre 25 et 50 µg/ml
• Activité faible pour une IC50 > a 50 µg/ml
• Activité nulle > 400 µg/ml

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Table des matières

INTRODUCTION
1. IDENTIFICATION BOTANIQUE DES ESPECES VEGETALES ETUDIEES
1.1. Ajuga iva L
1.1.1. Description botanique
1.1.2. Composition chimique
1.1.3. Utilisations de la plante
1. 2. Artemisia herba alba
1.2.1. Description botanique
1.2.2. Composition chimique
1.2.3. Utilisations de la plante
1.3. Marrubium vulgare
1.3.1. Description botanique
1.3.2. Composition chimique
1.3.3. Utilisations de la plante
MATERIEL ET METHODES
1. Présentation de la zone d’étude
1.1. Localisation géographique
1.2. Le sol
1.3. Climat de la région
3.1. Les précipitations
1.3.2. Les températures
1.3.3. Le couvert végétal
2. Enquête ethnobotanique
3. Etude phytochimique
3.1. Méthode d’extraction
3.2. Analyses qualitatives et quantitatives des extraits de plantes
3.2.1. Dosage des phénols totaux
3.2.2. Analyse HPLC/UV-vis-DAD/ESI-MS et HPLC/UV-vis/DAD
4. Evaluation des activités biologiques
4.1. Activité antidiabétique
4.1.1. Matériel végétal et préparation des extraits
4.1.2. Les animaux
4.1.3. Induction du diabète
4.1.4. Protocole expérimental
4.1.5. Suivi des animaux avant sacrifice
4.1.6. Dosages biochimiques sanguins après sacrifice
4.1.6.1. Dosage du glucose
4.1.6.2. Dosage du cholestérol
4.1.6.3. Dosage des triglycérides
4.1.6.4. Dosage des Lipides totaux
4.1.6.5. Dosage du HDL/LDL
4.1.6.6. Dosage des protéines totales
4.1.6.7. Dosage des transaminases TGO/TGP
4.1.6.8. Dosage de l’urée
4.1.6.9. Dosage de la créatinine
4.1.7. Analyse statistique des résultats
4.2. Activité antioxydante
4.2.1. Test au DPPH
4.3. Activité antileishmanienne
4.3.1. Milieux de culture
4.3.2. Culture des parasites
4.3.3. Protocole du test de viabilité sur les promastigotes
4.4. Activité antibactérienne et antifongique
4.4.1. Microorganismes utilisés
4.4.2. Technique en milieu solide (méthode de la diffusion sur disque)
RESULTATS ET DISCUSSION
1. Enquête ethnobotanique
1.1. Fréquence d’utilisation des plantes médicinales selon le profil des herboristes
1.1.1. Classes d’âge
1.1.2. Sexe
1.1.3. Niveau de scolarisation
1.2. Fréquence d’utilisation des plantes médicinales
1.2.1. Domaines d’indication thérapeutique
1.2.2. Parties utilisées
1.2.3. Mode de préparation
2. Etude phytochimique
2.1. Taux des phénols totaux
2.2. Analyse qualitatif et quantitatif des extraits aqueux et méthanoliques
2.2.1. Analyse qualitatif et quantitative de l’extrait aqueux et méthanolique du Marrubium vulgare
2.2.2. Analyse qualitatif et quantitative de l’extrait aqueux et méthanolique d’Artemisia herba alba
2.2.3. Analyse qualitatif et quantitative de l’extrait aqueux et méthanolique d’Ajuga iva
3. Activités biologiques
3.1. Activité antidiabétique
3.1.1. Activité antidiabétique du Marrubium vulgare
3.1.1.1. Effets de l’extrait aqueux sur la glycémie
3.1.1.2. Effets de l’extrait aqueux sur le poids corporel
3.1.1.3. Effet de l’extrait aqueux sur les différents paramètres biochimiques
3.1.2. Activité antidiabétique d’Artemisia herba alba
3.1.2.1. Effets de l’extrait aqueux sur la glycémie
3.1.2.2. Effets de l’extrait aqueux sur le poids corporel
3.1.2.3. Effet de l’extrait aqueux sur les différents paramètres biochimiques
3.1.3. Activité antidiabétique d’Ajuga iva
3.1.3.1. Effets de l’extrait aqueux sur la glycémie
3.1.3.2. Effets de l’extrait aqueux sur le poids corporel
3.1.3.3. Effet de l’extrait aqueux sur les différents paramètres biochimiques
3.2. Activité antioxydante
3.3. Activité antileishmanienne
3.4. Activité antimicrobienne
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES