ANALYSE DES FLUX GENIQUES PAR POLLEN

La consanguinité

                  La consanguinité résulte de l’union entre des individus possédant un certain degré de parenté ou de l’autogamie. Elle élève la probabilité d’apparition des tares liées à des gènes récessifs (gènes homozygotes) dans leurs descendants. L’ensemble de ces gènes est généralement désigné sous le terme de fardeau génétique. Cette consanguinité se traduit en général par une dépression de vigueur des arbres. L’expérience sur E. grandis, montre que la dépression sur la hauteur dans les familles de demi-frères est de l’ordre de 2 à 26% par rapport à la famille de plein-frères (Hodgson, Cité dans B. Martin, 1987). Mais elle est caractérisée aussi par la présence de «dwarfs», qui sont des plants atteints de nanisme caractérisé (tige multiple, feuilles difformes, arrondies, linéaires, courbées, cloquées, défauts de pigments chlorophylliens,…), parmi les individus autofécondés dans la population. Ces dwarfs ont une espérance de vie allant du stade de repiquage jusqu’à une dizaine d’années.

Marqueurs moléculaires

                 Les marqueurs utilisés en génétique des populations sont des marqueurs de locus polymorphes qui renseignent sur le génotype de l’individu qui les portent. Les plus courants sont les marqueurs morphologiques, les marqueurs moléculaires (ADN) et les marqueurs biochimiques (isozymes, protéines). Mais, un marqueur idéal doit correspondre aux critères suivants :
– un caractère polymorphe qui permet de différencier des génotypes. Il est déterminé par la présence dans une même population de deux ou plusieurs formes d’allèles à un locus donné (multiallélisme).
– un caractère codominant c’est à dire un individu hétérozygote présente simultanément les caractères des deux parents homozygotes,
– non épistasique c’est à dire le génotype peut être lu à partir du phénotype quel que soit le génotype aux autres locus,
– neutre : les substitutions alléliques au locus marqueur n’ont pas d’autres effets phénotypiques que ceux qui permettent de déterminer son génotype,
– un caractère non soumis aux variations de l’environnement.
L’utilisation des marqueurs morphologiques est souvent limitée en raison de leur faible nombre disponible, de leur caractère généralement dominant et pouvant être influencé par le milieu. Les marqueurs biochimiques, qualifiées de marqueurs indirects (isozymes et protéines) de génome ne sont pas très polymorphes et leur production est spécifique selon les organes. Seuls les marqueurs moléculaires (au niveau de l’ADN) répondent à ces critères avec leur grand nombre et leur présence illimitée quel que soit le type de tissu. Le polymorphisme au niveau moléculaire est mis en évidence soit par :
– séquençage des fragments homologues ou le polymorphisme de séquence qui est une technique lourde. La détection de différences de sites d’enzyme de restriction par la technique RFLP (Random Fragment Lenght Polymorph), de différences de conformation par la SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisme), sont des méthodes indirectes.
– la différence du nombre d’unités de répétitions ou de la longueur (nombre de paire de bases) de marqueurs SSR (Single Sequence Repeat).
Il faut remarquer qu’il existe d’autres marqueurs génétiques dont certains sont dominants comme les RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) et AFLP (Amplified fragment Length Polymorphism).

Verger à graines de descendances à Mahela

                Des graines issues de pollinisation libre, récoltées en 1998 sur chacun des 5 arbres choisis pour cette étude, font l’objet de recherche de paternité et de flux de gènes dans le verger. La germination des graines et l’élevage des jeunes plants ont été effectués pour des raisons de sécurité, sur deux pépinières (Mahela et Ambatobe).

La récolte des feuilles sur les semis

               La récolte est faite trois à quatre mois après le semis, soit sur des plantules à la pépinière (en sachet), soit sur des plantules sur le terrain d’essai. Chaque famille est représentée par 60 individus, choisie au hasard parmi les plantules. Un numéro est attribué à chacune des plantules, puis 60 numéros sont tirés au hasard et sont considérés représentatifs de la famille. Le choix des feuilles est fait directement sur pied. Elles sont de type juvénile, non anthocyanées, non coriaces et indemnes de maladies (viroses ou champignons). Pour l’extraction sur matériel frais, le pesage de 100 mg de feuilles sans nervure principale, est effectué immédiatement sur une balance de précision Mettler alimentée par un groupe électrogène. Ainsi, elles sont introduites dans des tubes codés prévus pour le broyage et plongés dans une cuve contenant de l’azote liquide (à –173°C) permettant leur conservation jusqu’au laboratoire à Ambatobe. Par précaution, une réserve constituée de feuilles séchées est conservée dans des enveloppes prévues pour la méthode d’extraction à partir de feuilles sèches.

Contrôle de la quantité et qualité de l’ADN

                Le dosage de la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre permet de lire directement la concentration réelle des échantillons (Annexe 3). Une vérification de la qualité et de la quantité d’ADN est réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose (Annexe 2). Ces deux étapes sont importantes pour le bon déroulement des réactions ultérieures (voir chapitre 2-3-2-1). Une fois les concentrations de chaque échantillon déterminées, les solutions de travail pour la polymérisation in vitro sont préparées à 3 ng/µl

Succès reproducteur mâle

                     Les 138 descendants issus de 5 familles sont pollinisés par 82 pères intra-parcelle (35% de la population totale). Le nombre de pères attendus Ne = 85 est très proche de celui observé No = 82 (tableau 11), ainsi que la distribution individuelle variant de 4,3% et 0,7% montrent que la distribution des succès reproducteurs individuels est assez équilibrée et cela est valable pour chaque famille (figures 3 et figures 4).

Effet de la distance sur le nombre de descendances

               L’étude de paternité effectuée sur chaque famille a permis d’identifier les mâles intra-parcelle impliqués dans la pollinisation (Annexe 9). L’effet de la distance est étudié en traçant des cercles, équidistant de 18m entre eux à partir de chaque pied mère, et de compter le nombre de descendances et le nombre de pères potentiels correspondant à chaque intervalle. Les résultats sont présentés par les histogrammes (figure 5). Les individus dans l’intervalle] 54, 72] et >72 m sont mal représentés à cause de la surface limitée de la parcelle, et ils ne sont pas pris en compte lors de l’interprétation surtout le nombre de pères potentiels correspondants. En général, le nombre de descendants présente un pic dans l’intervalle] 18, 36] et diminue au fur et mesure qu’on s’éloigne de l’arbre mère. En pondérant le nombre de descendants au nombre de pères potentiels, ce dernier atténue l’effet de la distance. Cela veut dire que le nombre de descendants est fonction à la fois de la distance et du nombre de pères potentiels.

Table des matières

LISTE DES TABLEAUX
LISTE DE FIGURES
LISTE DE PHOTOS
INTRODUCTION
Chapitre 1 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Eucalyptus grandis
1.1. Aire d’origine
1.2. Biologie de la reproduction
1.2.1. La floraison
1.2.2. La pollinisation
1.2.3. Fécondation
1.2.4. La consanguinité
1.2.5. Facteurs favorisant à la consanguinité
2. Marqueurs moléculaires
2.1. Les marqueurs microsatellites
2.2. Le principe de détection du polymorphisme
2.3. La PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.1. La technique PCR
2.3.2. Optimisation des conditions de la PCR
2.3.2.1. La qualité et la quantité d’ADN
2.3.2.2. Les conditions d’appariement des amorces
2.3.2.3. La qualité et la quantité de l’enzyme ADN polymérase
Chapitre 2 MATERIELS ET METHODES
1. Méthodologie
2. Présentation du site
3. Matériel végétal
3.1. Verger à graines d’Antsirianala
3.2. Verger à graines de descendances à Mahela
3.3. La récolte des feuilles sur les semis
4. Technique de révélation du polymorphisme moléculaire
4.1. Extraction d’ADN génomique total par la méthode Kit Quiagen
4.2. Contrôle de la quantité et qualité de l’ADN
4.3. La polymérisation in vitro
4.4. Les amorces
4.5. Electrophorèse sur gel Acrylamide à 6%
4.6. Révélation du polymorphisme
5. Méthodes d’analyses
5.1. Analyse de la diversité génétique
5.2. Systèmes de reproduction et flux de gènes par pollen
5.2.1. Les mesures indirectes de phénologie et de fertilité
5.2.2. Analyse de paternité : principe
5.2.2.1. La probabilité d’exclusion
5.2.2.2. Le maximum de vraisemblance (approche probabiliste)
Chapitre 3 RESULTATS ET INTERPRETATIONS
1. Révélation du polymorphisme
2. Variabilité génétique au sein de la population mère
3. Etude de paternité
4. Le taux d’autofécondation
5. Les pères extra-parcelle
6. Les pères intra-parcelle
7. Succès reproducteur mâle :
8. Effet de la distance sur le nombre de descendances 
DISCUSSIONS ET PERSPECTIVES
CONCLUSIONS
LEXIQUE
BIBLIOGRAPHIES
ANNEXES

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