ANALYSE DES EXTRAITS PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

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LOCALISATION GEOGRAPHIQUE

Notre plante Schefflera longipedicellata est trouvée dans les forêts denses et humides de l’Est de l’Île.
En effet, elle a été localisée dans la forêt de tataoBe et d’Antsaralahy, district d’Anjozorobe, province d’Antananarivo et à Ambatovy , district de Moramanga, province de Toamasina.
Elle pousse aussi dans d’autres provinces comme celles de Fianarantsoa, plus précisément dans la commune de Farafangana, distric de Vondrozo ou dans la forêt de Ranomafana ; dans la province d’Antsiranana : dans la réserve nationale d’Ambohitra (Montagne d’Ambre).

LIEU ET DATE DE RECOLTE

Notre plante a été récoltée dans le district d’Anjoz robe (sur la RN3, PK90), plus précisément dans le fokontany d’Antsahabe Est, forêt d’Antsaralahy, au mois d’août 2007, période où la plante est en phase végétative.

PREPARATION ET CONSERVATION DU MATERIEL VEGETAL

Les feuilles ont servi de matériel d’étude. Elles onts séchées à l’abri du soleil pendant trois semaines. Ensuite, à l’aide d’un mixer (BLEND ER, GT500), elles sont broyées jusqu’à l’obtention d’une poudre fine qui constitue le matériel de départ. Celle-ci est conservée dans une boîte hermétiquement fermée, à la température mbiante.

LES PRODUITS CHIMIQUES

Dans notre laboratoire, les produits chimiques, c’est-à-dire les réactifs et solvants utilisés sont de qualité pour analyse et de marqueMERCK ou PROLABO.
Les supports chromatographiques utilisés sont des plaques de gel de silice (MERCK) 60F254, d’épaisseur 0,2 mm, étalé sur une feuille en plastique de dimensions 20 x 20 cm, immédiatement utilisables.

METHODES

METHODES D’EXTRACTION DES PRINCIPES TOXIQUES

EXTRACTION A FROID

La poudre végétale est mise en suspension dans lesolvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique 75 % ou éthanol absolu)suivant le rapport 1/10 (p/v), c’est-à-dire 1g de poudre dans 10 ml de solvant. Le mélangeest soumis à une agitation magnétique pendant 3 h à la température ambiante, puis laissémacérer à +4°C pendant au moins 12 h.
Le macérat est de nouveau agité pendant 30 min à latempérature ambiante avant sa filtration sur quatre épaisseurs de gaze pour éliminer le marc.
Le filtrat est ensuite centrifugé à 12 000 trs/min pendant 20 min au moyen d’une centrifugeuse BREMSE (modèle T52).
Pour l’extraction aqueuse, le surnageant qui constituera ultérieurement l’extrait brut est concentré, alors que pour l’extraction hydroéthanolique ou éthanolique, il est débarrassé du solvant d’extraction par évaporation sous pression réduite au moyen d’un évaporateur rotatif (voir méthode de concentration au paragraphe II.2.3, p. 13).
Pour les trois types de solvant d’extraction, le volume final est réduit à 1ml pour chaque gramme de poudre de départ, c’est-à-dire suivant le rapport 1/1 (p/v).
Une deuxième centrifugation à 12 000 trs/min pendant 15 min à l’aide d’une centrifugeuse JOUAN (modèle TH12), est nécessaire pour éliminer le précipité éventuel.

EXTRACTION A CHAUD

La poudre est mélangée avec le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique 75 %), dans le rapport 1/10 (p/v) .
L’extraction est effectuée à reflux. La solution est chauffée sur une plaque chauffante sous agitation magnétique à la température d’ébullit on du solvant d’extraction, c’est-à-dire 100 °C pour l’eau distillée et +65 °C pour l’éthanol (GAUTIER et MIOCQUE, 1968).
Après 3 h de chauffage, le décocté est enlevé duispositifd d’extraction, puis laissé refroidir à la température ambiante. Il est ensuite laissé macérer à +4°C pendant au moins 12 h.
La suite de la manipulation est la même que pour ’extractionl à froid.

METHODES DE PURIFICATION

FRACTIONNEMENT PAR LE n-BUTANOL

La technique est fondée sur la distribution d’un soluté entre deux solvants non miscibles, l’eau et le n-butanol, en fonction de sa solubilité dans chacun d’eux (MAHUZIER et HAMON, 1986 ; KAMOUN, 1987).

Mode opératoire

Dans une ampoule à décanter sont introduits un volume de l’extrait à traiter préalablement dilué 2  fois (pour diminuer sa viscosité) et le même volume de n-butanol. Après agitation énergique, le mélange est laissé aurepos dans l’ampoule débouchée jusqu’à la décantation totale des deux liquides, donnant deux phases nettes : la phase supérieure organique et la phase inférieure aqueuse. Les deuxphases sont alors récupérées et leur volume mesuré. L’opération est répétée deux fois en remplaçant le n-butanol.
Les trois phases organiques sont alors réunies, débarrassées du solvant organique par évaporation après ajout d’un grand volume d’eau, puis concentrées pour avoir le rapport 1/1 (p/v).
La phase aqueuse est débarrassée du n-butanol résiduel par évaporation.

PRECIPITATION PAR L’ECETATE NEUTRE DE PLOMB

Divers sels de métaux lourds comme l’acétate neutr de plomb (ANP) permettent d’éliminer différentes substances comme les protéines, les acides organiques, les acides nucléiques, les polysaccharides, les tanins et d’autres substances phénoliques,… en les précipitant (MAHUZIER et HAMON, 1986).

Mode opératoire

La solution d’acétate neutre de plomb à 20 % (p/v) de volume déterminé est versée goutte à goutte dans l’extrait placé sous agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par centrifugation à l’aide de la centrifugeuse BRE MSE (modèle T52), à 12 000 trs/min pendant 5 min à +5 °C. Le traitement est répété jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de précipité.
L’excès de plomb est éliminé par précipitation à ’aidel d’une solution aqueuse de phosphate disodique à 10 % (p/v). Le précipité formé est écarté par centrifugation comme précédemment.

DIALYSE

Principe

Cette technique est basée sur la capacité des molécules de traverser une membrane hémi-perméable suivant leurs poids moléculaires. Cette membrane cylindrique appelée sac à dialyse ou boudin à dialyse agit comme un tamis mol éculaire et possède un seuil de filtration bien déterminé. Elle sépare ainsi les petites molécules des grosses molécules en induisant deux phénomènes :
– L’osmose : définie comme le mouvement d’eau du milieu le plus dilué (liquide de contre-dialyse) vers le milieu le plus concentré (extrait à dialyser).
– La diffusion : les substances de faible poids moléculaire sorten vers le liquide contre-dialyse.
Plusieurs paramètres influencent la vitesse de la dialyse :
– le diamètre des pores de la membrane
– la différence de concentration, entre les deux compartiments
– le temps de contact
– la température
– le pH.

Mode opératoire

Préparation de la membrane de dialyse

Le boudin à dialyse (marque Cellu Sep, 33mm de larg e, seuil 6000 à 8000 Da) est bouilli trois fois dans l’eau distillée pendant 5 min tout en remplaçant chaque fois l’eau distillée. Cela permet d’éliminer la couche protectrice formée de glycérine, de métaux lourds et de composés sulfurés. Après ce traitement, le boudin est conservé à +4 °C dans la dernière eau bouillie.
Avant chaque utilisation, il est nécessaire de rincer le boudin à dialyse avec de l’eau distillée.

Déroulement de la dialyse

Le boudin de dialyse est rempli au tiers avec l’extrait à traiter, laissant ainsi un espace suffisant pour les échanges. Ceci permet d’éviter ’éclatement du boudin par augmentation de volume de l’extrait à traiter.
Avant de nouer les deux extrémités du boudin à dialyse, l’air est éliminé pour permettre son immersion totale dans de l’eau distillée de volume égal à cent fois celui de l’extrait à dialyser. Une agitation continue du liq uide de contre-dialyse est nécessaire pour éviter la formation d’un gradient de concentration des molécules diffusibles autour du boudin.
Le liquide de contre-dialyse est changé trois foisen 48 h.
A la fin de l’opération, le dialysat, liquide à l’extérieur du boudin et l’adialysat, liquide à l’intérieur du boudin, sont concentrés jusqu’au rapport 1/1 (p/v).

PRECIPITATION PAR L’ETHANOL 50%

Elle est basée sur la diminution de la solubilité ed certaines substances dans l’eau, après addition d’un solvant organique moins polaire miscible tel que l’éthanol. Cela va entraîner la précipitation de ces substances (MAHUZIER et HAMON, 1986).

Mode opératoire

L’extrait à traiter de volume déterminé, soumis à une agitation magnétique continue, est additionné goutte à goutte d’éthanol absolu demême volume.
Le mélange est ensuite laissé macérer à +4°C pendant 15 min. Le précipité formé est éliminé à 12 000 trs/min pendant 15 min à l’aide de la centrifugeuse JOUAN, TH12.
Enfin, le solvant contenu dans le surnageant est éliminé par évaporation au moyen d’un évaporateur rotatif.

FRACTIONNEMENT PAR L’ACETATE D’ETHYLE

Elle est basée sur la distribution d’une substance en fonction de son affinité relative dans deux solvants non miscibles (MAHUZIER et KAMON, 1986 ; KAMOUN, 1987).

Mode opératoire

La manipulation est la même que pour le fractionnement par le n-butanol, seulement, le solvant organique utilisé est l’acétate d’éthyle.

METHODE DE CONCENTRATION

L’évaporateur rotatif (HEIDOLPH) est l’appareil utilisé pour évaporer les solvants organiques ou concentrer un extrait. Une pompe à vi de est nécessaire pour réduire la pression au cours de l’évaporation. L’opération est effectué à 60°C.
La concentration initiale des extraits (rapport 1/1, P/V) à étudier peut être calculée à partir de la relation ci-après : Poids du résidu sec (mg) Concentration (mg/ml) = Volume de l’extrait de départ (ml).

CALCUL DE RENDEMENT

L’extrait résultant d’une extraction ou d’une étapede purification est évaporé à sec. Le résidu sec obtenu est pesé. Le rendement est le raport entre le poids du résidu sec et celui du matériel de départ selon la formule : Poids du résidu sec (g) Rendement (%) = * 100 Poids du matérielde départ (g).

METHODES D’ANALYSE

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

La chromatographie sur couche mince (CCM) est un procédé de microanalyse utilisant comme support le gel de silice 60 F254 étalé sur une feuille plastique. Le long de ce support, une phase liquide entraîne à vitesse inégale les substances à séparer, suivant une direction déterminée.
La vitesse de migration est fonction de l’affinité des constituants vis-à-vis de la phase liquide mobile et/ou de la phase fixe adhérant au support chromatographique (RANDERATH, 1964 ; VERNIN, 1970 ; BOREL et RANDOUX, 1987 ; MAHUZIER et coll., 1990).

Mode opératoire

Préparation de la plaque

Avant le dépôt des extraits sur la plaque, la ligne de dépôt est tracée à 1,5 cm du bord inférieur de la plaque. A 1,3 cm des bords latérauxsont déposés les extraits sous forme de tirets de 0,8 cm, espacés de 0,6 cm. Les dépôts sont séchés à l’aide d’un séchoir à main.

Développement du chromatogramme

Dans une cuve chromatographique (DESAGA) contenant le solvant de chromatographie dont les vapeurs ont préalablement saturé l’enceinte, la plaque préparée est introduite. Cette dernière est positionnée verticalement (c’est-à-dire la ligne de dépôt en bas). Le solvant migre par capillarité vers le haut le long de la plaque (chromatographie ascendante). La migration est arrêtée lorsque le ontfr du solvant arrive à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque. Elle est ensuite retirée dela cuve et séchée par un courant d’air chaud pour évaporer le solvant.

Révélation du chromatogramme

Examen sous lumière ultraviolette (UV)

A des longueurs d’onde égales à 254 nm et 366 nm, de nombreuses substances deviennent visibles sous forme de taches violettes ou roses ou fluorescentes sous l’effet de la lumière UV.

Réactions colorées

La vanilline sulfurique (voir composition en annexe I) est le révélateur universel utilisé pour révéler les composés carbonés ayant minimumau 2 atomes de carbone. Elle est pulvérisée à la surface du chromatogramme. Après séchage à l’étuve de la plaque, des taches violettes ou roses apparaissent.

Flavonoïdes (Test de WILSTATER)

La réaction colorée, dite de la cyanidine, met en videnceé les flavones, flavonols et flavonones par traitement avec du magnésium en milieu chlorhydrique (BRUNETON, 1987).
Deux tests sont à effectuer :
– Pour le premier, 2 ml d’extrait sont additionnés de 4 gouttes de HCl 12N et de deux tournures de magnésium. Après 10 min, le virage dela couleur au rouge indique la présence de flavones, au rouge pourpre celle des flavonols et au rouge violacé celle des flavonones et flavonols.
– Pour le deuxième, le mélange précédent (2 ml d’extrait + 4 gouttes de HCl 12N + 2 tournures de magnésium) est également préparé maiscette fois ci, il est additionné de 0,5 ml d’eau distillée et 0,5 ml d’alcool isoamylique. Une coloration rouge à rouge violacé de la phase supérieure indique la présence de flavonoïdes.

Leucoanthocyanes (Test de BATE-SMITH)

L’extrait de volume égal à 2 ml, est additionné de 0,5ml de HCl 12 N. Le tout est chauffé dans un bain-marie bouillant pendant 30 min. La réaction positive correspond à l’apparition de la couleur rouge après refroidissement.

Tanins et polyphénols

L’extrait aqueux est utilisé pour la détection destanins et polyphénols.
Trois tests sont nécessaires pour observer la présence des variétés de tanins.

Test à la gélatine

Quatre gouttes de gélatine salée à 1 % (p/v) sont versées dans 0,5 ml d’extrait. Ce test indique la présence des tanins condensés de type catéchique, qui se traduit par la formation d’un précipité blanc.

Test à la gélatine salée

Quatre gouttes de gélatine salée 10 % (c’est-à-direde la gélatine 1 % dans une solution de NaCl 10 %). La formation d’un précipité montre al présence de tanins hydrolysables de type pyrogallique.

Table des matières

PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. MATERIELS
II.1.1. Matériel végétal
II.1.1.1. Position systématique
II.1.1.2.Description botanique
II.1.1.2.1. Description du genre Schefflera
II.1.1.2.2. Description de l’espèce Schefflera longipedicellata
II.1.1.3.Localisation géographique
II.1.1.4.Date et lieu de récolte
II.1.1.5. Préparation et conservation du matériel végétal
II.1.2. Les produits chimiques
II.2. METHODES
II.2.1. Méthodes d’extraction des principes toxiques
II.2.1.1.Extraction à froid
II.2.1.2.Extraction à chaud
II.2.2. Méthodes de purification
II.2.2.1. Fractionnement par le n-butanol
II.2.2.1.1. Principe
II.2.2.1.2. Mode opératoire
II.2.2.2. Précipitation par l’acétate neutre de plomb
II.2.2.2.1. Principe
II.2.2.2.2. Mode opératoire
II.2.2.3.Dialyse
II.2.2.3.1. Principe
II.2.2.3.2. Mode opératoire
II.2.2.3.2.1. Préparation de la membrane de dialyse
II.2.2.3.2.2. Déroulement de la dialyse
II.2.2.4. Précipitation par l’éthanol 50%
II.2.2.4.1. Principe
II.2.2.4.2. Mode opératoire
II.2.2.5. Fractionnement par l’acétate d’éthyle
II.2.2.5.1. Principe
II.2.2.5.2. Mode opératoire
II.2.3. Méthode de concentration
II.2.4. Calcul de rendement
II.2.5. Méthodes d’analyse
II.2.5.1.Chromatographie sur couche mince
II.2.5.1.1. Principe
II.2.5.1.2. Mode opératoire
II.2.5.1.2.1. Préparation de la plaque
II.2.5.1.2.2. Développement du chromatogramme
II.2.5.1.2.3. Révélation du chromatogramme
II.2.5.1.2.3.1. Examen sous lumière ultraviolette
II.2.5.1.2.3.2. Réactions colorées
II.2.5.2.Criblage phytochimique
II.2.5.2.1. Préparation des extraits à tester
II.2.5.2.1.1. Extraits aqueux
II.2.5.2.1.2. Extraits chloroformiques
II.2.5.2.1.3. Extraits hydroéthanoliques
II.2.5.2.1.4. Extraits acides
II.2.5.2.2. Détermination des familles chimiques
II.2.5.2.2.1. Alcaloïdes
II.2.5.2.2.2. Flavonoïdes et leucoanthocyanes
II.2.5.2.2.3. Tanins et polyphénols
II.2.5.2.2.4. Stéroïdes et triterpènes
II.2.5.2.2.5. Anthraquinones
II.2.5.2.2.6. Désoxyoses
II.2.5.2.2.7. Iridoïdes
II.2.5.2.2.8. Saponines
III. RESULTATS
III.1. PREPARATION DES EXTRAITS TOXIQUES
III.1.1. Extraction
III.1.2. Purification
III.1.2.1. Méthodes adoptées dans le protocole de purification
III.1.2.1.1. Précipitation par l’éthanol 50%
III.1.2.1.2. Fractionnement par le n-butanol
III.1.2.1.3. Dialyse
III.1.2.2. Méthodes non adoptées dans le protocole de purification
III.1.2.2.1. Précipitation par l’acétate neutre de plomb
III.1.2.2.2. Fractionnement par l’acétate d’éthyle
III.2. CONCENTRATION DES SUBSTANCES TOXIQUES
III.3. RENDEMENT DE PURIFICATON
III.4. ANALYSE DES EXTRAITS PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
III.5. CARACTERISATION CHIMIQUE
III.5.1. Propriétés physico-chimiques
III.5.2. Nature chimique
IV.DISCUSSION ET CONCLUSIONS
DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. MATERIELS
II.1.1. Les animaux d’expérimentation
II.1.1.1.Les animaux à sang chaud : la souris
II.1.1.2.Les animaux à sang froid
II.1.1.2.1. Les têtards
II.1.1.2.2. Les alevins
II.1.1.3.Les insectes : les larves de moustique
II.1.2. Les végétaux d’expérimentation
II.1.3. Les microorganismes
II.1.3.1.Les souches
II.1.3.2.Les milieux de culture
II.2. METHODES
II.2.1. Méthodes d’étude des effets sur les animaux
II.2.1.1. Sur les animaux à sang chaud
II.2.1.1.1. Chez la souris
II.2.1.1.1.1. Estimation de la toxicité
II.2.1.1.1.2. Détermination de la DL50
II.2.1.2. Sur les animaux à sang froid
II.2.1.2.1. Principe
II.2.1.2.2. Mode opératoire
II.2.1.2.2.1. Test sur les têtards
II.2.1.2.2.2. Test sur les alevins de Baraoa
II.2.1.2.2.3. Test sur les larves de moustique
II.2.2. Méthodes d’étude des effets sur les végétaux
II.2.2.1.Expériences sur le pouvoir germinatif
II.2.2.1.1. Principe
II.2.2.1.2. Mode opératoire
II.2.2.2.Expériences sur la croissance des plantules
II.2.2.2.1. Principe
II.2.2.2.2. Mode opératoire
II.2.2.2.2.1. Trempage
II.2.2.2.2.2. Germination
II.2.2.3.Expériences sur le développement des bourgeons axillaires
II.2.2.3.1. Principe
II.2.2.3.2. Mode opératoire
II.2.3. Méthodes d’étude sur les microorganismes
II.2.3.1.Test de sensibilité des microorganismes
II.2.3.1.1. Principe
II.2.3.1.2. Mode opératoire
II.2.3.1.2.1. Stérilisation
II.2.3.1.2.2. Test
II.2.3.2.Détermination de la CMI
III. RESULTATS
III.1. EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX
III.1.1. Sur les animaux à sang chaud
III.1.1.1. Sur souris
III.1.1.1.1. Description des symptômes d’intoxication
III.1.1.1.2. Détermination de la DL50 (24h)
III.1.2. Sur les animaux à sang froid
III.1.2.1. Sur les têtards
III.1.2.2. Sur les alevins de Baraoa
III.1.3. Sur les insectes : les larves de moustique
III.2. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX
III.2.1. Sur le pouvoir germinatif des graines
III.2.2. Sur la croissance des jeunes plantules
III.2.3. Sur le développement des bourgeons axillaires
III.3. EFFETS SUR LES MICROORGANISMES
IV. DISCUSSION ET CONCLUSIONS
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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