Soutenance mémoire
Nanomédecine et vectorisation
Malgré les progrès réalisés dans le domaine de la recherche médicale et la conception de molécules actives, certaines limitations demeurent. En effet, les molécules actives qui sont administrées aux patients, sont le plus souvent peu spécifiques d’une cible donnée ce qui limite leur efficacité vis-à-vis de la pathologie visée et induit des effets secondaires indésirables. La conséquence directe de ce manque de spécificité est l’administration de doses plus fortes à des fréquences plus importantes ce qui conduit à des effets indésirables. Outre le manque de spécificité d’action, l’hydrophobicité des principes actifs pharmaceutiques constitue également une limitation. Se pose alors le problème de la formulation de ces principes actifs afin d’en améliorer la compatibilité (solubilité/stabilité) en milieux biologiques. Le recours aux nanotechnologies va permettre de contourner certaines de ces problématiques. Par exemple, l’utilisation de nanoparticules « transporteuses » (vecteurs) constitue une stratégie qui peut se révéler efficace. En effet, le vecteur de par ses propriétés physico-chimiques (taille, charges électrostatiques de surface, hydrophilie…) adaptées, doit permettre une prise en charge, une distribution et une élimination optimales de la molécule active. Le devenir de cette dernière est alors régi par le devenir du vecteur lui-même et ses interactions avec le milieu biologique. L’un des défis de la nanomédecine est également de comprendre la nature de ces interactions.
Vecteurs furtifs : Effet EPR et ciblage passif
De manière générale, l’architecture du vecteur peut être divisée en deux niveaux : le cœur et la surface du vecteur. Le cœur est utilisé pour la prise en charge de la molécule active, alors que la couronne périphérique est en interaction avec le milieu biologique environnant. Bien qu’il n’y ait pas de méthodes génériques permettant de bloquer totalement le phénomène d’opsonisation, une chimie de surface adaptée peut néanmoins influer de manière significative sur ce processus et accroître le temps de demi-vie plasmatique du vecteur. En effet, certaines observations montrent que l’opsonisation de nanoparticules hydrophobes est plus rapide que celle de particules hydrophiles.5 Un rapport entre la charge à la surface de la particule et l’opsonisation a également été démontré in vitro. En effet, des particules neutres ont un taux d’opsonisation beaucoup plus faible que des particules chargées. Une méthode pour ralentir le phénomène d’opsonisation consiste donc à utiliser des groupements à la surface des particules afin de bloquer les interactions hydrophobes et électrostatiques qui aident les opsonines à se lier aux particules.4 Ces groupements sont généralement des polymères hydrophiles et flexibles, en particulier du poly(éthylène glycol) (PEG), qui vont donc agir comme des boucliers en bloquant la fixation des opsonines par des forces de répulsion stériques.6,7 D’autres polymères tels que les polysaccharides, le polyacrylamide ou le polysorbate ont également été décrits dans la littérature. Avec une surface « optimisée », les vecteurs de petite taille vont pouvoir circuler de manière prolongée et diffuser vers des zones inflammatoires ou au niveau des tumeurs grâce à la perméabilité de l’endothélium vasculaire de ces tissus. En effet, dans le cas de tumeurs solides, c’est l’hyper-vascularisation des tumeurs et leur croissance rapide qui engendrent la formation d’espaces interstitiels entre les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, permettant la diffusion des nanoparticules des vaisseaux vers les tissus tumoraux. Ce phénomène d’extravasation est également associé à un drainage lymphatique défaillant, ce qui favorise l’accumulation des vecteurs dans les tissus tumoraux (Figure 3). Cet effet de perméabilité accrue et de rétention appelé EPR (Enhanced Permeability and Retention) permet l’accumulation par voie passive des nanoparticules et à conduit à l’émergence de systèmes nanoparticulaires pour la délivrance ciblée de principes actifs mais aussi pour le diagnostic de tumeurs solides.
Composition des nanoparticules organiques
Les nanoparticules organiques doivent posséder des propriétés de biodégradabilité et/ou de biocompatibilité pour pouvoir être administrées chez l’Homme ou l’animal. En effet, elles ne doivent pas persister sur le long terme dans l’organisme et induire des réactions toxiques ou inflammatoires. C’est la raison pour laquelle un nombre limité de composants organiques ont été utilisés jusqu’à présent pour l’assemblage de vecteurs nanoparticulaires, les lipides et les polymères étant les constituants majoritaires. Les composés lipidiques sont particulièrement intéressants puisqu’ils font partie intégrante des membranes cellulaires. Les lipides sont par ailleurs les premières molécules à avoir été utilisées sous forme de liposomes pour la vectorisation. Les lipides dont les acides gras, glycérolipides, glycérophospholipides, sphingolipides, stérols, sont généralement utilisés comme excipients dans la formulation de principe actif. Un exemple de formulation utilisant l’huile d’arachide, principalement composée d’acide oléique et d’acide linoléique, a par exemple été utilisée pour l’administration par voie intra-péritonéale et sous-cutanée de Tamoxifène. Outre leur utilisation en tant qu’excipients, les lipides peuvent également être utilisés en tant que constituants de vecteurs, sous forme de liposomes, nanosphères ou nanocapsules et parfois en association avec des polymères afin d’améliorer leur stabilité. En effet, certains polymères, qu’ils soient naturels ou synthétiques, entrent dans la composition de vecteurs organiques ce qui permet d’accéder à une grande diversité structurale. Les polymères naturels (protéines, polysaccharides…) ont d’abord été utilisés en nanomédecine comme par exemple pour le cas de l’Abraxane® qui a été commercialisé aux USA en 2005 pour le traitement du cancer du sein. Cette formulation est basée sur des nanosphères d’albumine (polymères d’acides aminés) et prend en charge un anticancéreux, le paclitaxel.16 Des polymères de synthèses ont par la suite été utilisés, mais ne répondent pas forcément aux critères de biocompatibilité ou de biodégradabilité d’un vecteur. En effet, certains polymères ne sont que partiellement dégradables voire non dégradés, comme le poly(éthylèneglycol) mais vont cependant fournir des fragments solubles en milieu biologique pour être facilement excrétés. Aujourd’hui, la plupart des nanoparticules sont à base de copolymères et sont composés de polymères dits « structurels » et de polymères dits « fonctionnels » de manière à améliorer la stabilité de la formulation. Les polymères structurels, tels que le poly(acide lactique) (PLA) ou le poly(acide glycolique) (PGA), et les copolymères poly[lactide-co-glycolide] (PLGA), vont définir la morphologie du vecteur alors que les polymères fonctionnels, sont utilisés pour contrôler les interactions avec le milieu environnant. En effet, en fonctionnalisant un polymère hydrophobe avec du PEG, on va chercher à améliorer le temps de circulation des vecteurs afin de minimiser les interactions avec les protéines plasmatiques. Les recherches s’orientent de plus en plus vers le développement de polymères biodégradables qui sont sensibles à des stimulus environnementaux : variation de pH, température, concentrations en ions… Par exemple le poly(acrylamide-n-isopropyle) est connu pour être sensible à des modifications de températures. Le polymère sera alors dégradé sous l’effet d’une variation de température, permettant ainsi la libération du principe actif. Selon leur nature et le type d’interactions entre polymères, il est également possible d’obtenir des auto-assemblages aux morphologies différentes : des nanocapsules, des nanosphères, des micelles de polymères. L’obtention de telles structures est détaillée ci-après.
Les nanoparticules de carbone
Les fullerènes, le graphène et les nanotubes de carbone sont les principales catégories de nanoparticules à base de carbone que l’on retrouve en nanomédecine notamment parce qu’elles possèdent des morphologies et propriétés physico-chimiques uniques. Avec une très grande surface spécifique, ces objets sont capables de prendre en charge une quantité importante de molécules actives.23 Par ailleurs, il est possible de fonctionnaliser la surface de ces matériaux ce qui permet d’accéder à des plateformes multivalentes pour des applications biomédicales. Du fait de leur composition entièrement carbonée, ces objets sont difficilement dispersables dans l’eau. Pour contourner cette limitation, une modification de leur surface est nécessaire par adsorption, interactions électrostatiques ou en introduisant des groupements carboxyliques de surface par oxydation. La forme oxydée du graphène, permet par exemple d’obtenir une forme hydrosoluble, facilement fonctionnalisable et biocompatible. La surface des nanoparticules carbonées peut être également fonctionnalisée par des transformations chimiques comme la réaction de cycloadddition 1,3-dipolaire. Des nanotubes de carbone ont été ainsi fonctionnalisés pour y accrocher un anti-cancéreux (taxoïde) et la biotine, permettant un ciblage des cellules cancéreuses (Figure 11). Ces nanotubes incorporent également un lien clivable qui permettra le relargage du principe actif après internalisation cellulaire et interaction avec du glutathion (GSH – tri-peptide réducteur présent dans le réticulum endoplasmique qui a la particularité de cliver les ponts disulfures). A l’heure actuelle, de nombreuses recherches s’orientent sur la biocompatibilité et la toxicité in vivo et in vitro des nanomatériaux à base de carbone. Ces nanoparticules exercent des degrés de toxicité différents en fonction de leur voie d’administration, des modèles utilisés, et du type de fonctionnalisation de surface. Par ailleurs, il est difficile de contrôler la taille des nanoparticules ce qui complique l’interprétation des données de toxicité. Cependant, ces matériaux peuvent être dégradés par des systèmes biologiques. Il a par exemple été montré en 2008 que la peroxidase du raifort (HRP pour horseradish peroxidase) pouvait dégrader les nanotube de carbone en 12 semaines, en présence de peroxyde d’hydrogène.27 Une équipe s’est par la suite inspirée de ces travaux pour modifier chimiquement la structure du graphène en y incorporant des molécules spécifiques en surface permettant d’activer leur dégradation enzymatique.25 Il est donc possible que d’autres peroxydases (comme la myéloperoxidase) puisse agir de cette manière in vivo.
Interactions entre auto-assemblages
Les amphiphiles sont des composés qui possèdent à la fois un bloc hydrophile et un bloc lipophile. De manière générale, le bloc lipophile, que l’on nomme également « queue », est composé d’une longue chaîne hydrocarbonée (saturée ou insaturée), alors que la « tête » hydrophile peut être ionique ou neutre. On retrouve par exemple des amphiphiles non ioniques composés d’une chaine oxyde de PEG en tant que tête hydrophile et d’une longue chaîne alkyle comme queue hydrophobe. Les amphiphiles ioniques sont souvent utilisés comme détergents ou savons et sont généralement anioniques avec des têtes polaires chargées négativement (carboxylate, sulfate, sulfonate…) et des contre-ions chargés positivement (ions sodium, potassium, ammonium…). Les structures des amphiphiles les plus communs sont représentées dans la Figure 15. On retrouve également des amphiphiles zwitterioniques où la tête polaire possède à la fois une charge positive et négative. C’est par exemple le cas du phospholipide phosphatidyl choline. La tête polaire permet d’interagir avec l’eau et donc de solubiliser la molécule amphiphile. Le bloc lipophile va quant à lui se mettre à l’interface : soit dans l’air soit dans un liquide non polaire ou simplement être replié sur lui-même. Cela va donc modifier la tension de surface existante, c’est notamment pour cela que l’on appelle ces composés des tensio-actifs. Les amphiphiles sont soumis à un certain nombre de forces et d’interactions faibles. Cependant la multitude d’interactions faibles va produire un effet coopératif permettant de stabiliser les auto-assemblages et de maintenir les amphiphiles ensemble en solution. Les principales interactions faibles (non covalentes) qui sont impliquées dans le phénomène d’autoassemblage d’amphiphiles sont : – Les liaisons hydrogène : suffisamment fortes pour lier certaines molécules entre elles mais faibles pour être cassés dans les cellules vivantes lorsque cela est nécessaire – Les effets hydrophobes : vont réguler la tendance qu’ont les molécules hydrophobes à s’auto-agréger – Les interactions électrostatiques – Les forces de van der Waals Ces forces, qui sont largement moins intenses que des liaisons covalentes (400 kJ mol-1) lorsqu’elles sont considérées individuellement, peuvent varier de 5 kJ mol-1, pour les forces de van der Waals, à 120 kJ mol-1 pour certaines liaisons hydrogènes. Cela rend les structures des autoassemblages plus flexibles et mobiles leur permettant d’une part, de résister à des perturbations mineures mais aussi, de préserver la réversibilité de la structure.
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Table des matières
Abréviations
Avant-propos
Introduction générale : utilisation de micelles en nanomédecine
I – Les systèmes nanométriques pour le diagnostic et la thérapie
1- Nanomédecine et vectorisation
2- La vectorisation : définitions et optimisation du concept
2.1- Vecteurs furtifs : Effet EPR et ciblage passif
2.2- Ligands de surface : reconnaissance cellulaire et ciblage actif
II- Etat de l’art sur le développement de vecteurs nanoparticulaires
1- Composition des nanoparticules organiques
2- Nanoparticules : outils de vectorisation
2.1- Les liposomes
2.2- Les nanocapsules et les nanosphères
2.3- Les nanoparticules de carbone
2.4- Les systèmes mono-macromoléculaires
2.5- Les micelles
III- Auto-assemblage d’amphiphiles et formation de micelles
1- Interactions entre auto-assemblages
2- Structures des auto-assemblages : concepts historiques
3- Concentration micellaire critique
4- Stabilisation de la micelle
4.1- Stabilisation par réticulation
4.2- Stabilisation par des composés perfluorocarbonés
V – Conclusion et objectifs de la thèse
Chapitre 1 : Micelles polydiacétyléniques pour le diagnostic et le traitement de l’athérosclérose
I- Plaque d’athérome et micelles PDA-PEG : état de l’art
1- L’athérosclérose et la découverte du GW3965
1.1- Développement de la plaque d’athérome
1.2- Identification du GW3965 comme agoniste partiel des LXR
2- Micelles PDA-PEG : développement et études préliminaires
2.1- Historique sur le développement des micelles PDA-PEG
2.1.1- Amphiphiles DA-NTA
2.1.2- Amphiphiles DA-PEG
2.2- Fonctionnalisation des micelles pour un ciblage actif
3- Objectifs
II- Formulation d’un composé agoniste des LXR
1- Synthèse des amphiphiles
2- Assemblage des micelles et caractérisations
3- Étude de toxicité
3.1 – Effet de la polymérisation
3.2- Distribution intracellulaire
4- Synthèse du GW3965
5- Formulation du GW3965
5.1- Encapsulation du GW3965
5.2- Caractérisations de la formulation
5.2.1- Détermination de la taille des particules
5.2.2- Cinétique de libération du GW3965
5.2.3- Stabilité au stockage
5.2.4- Efficacité in vitro
III- Études de pharmacocinétique et de biodistribution
1- Principes généraux sur la pharmacocinétique
2- Choix du modèle animal
3- Étude de pharmacocinétique et de biodistribution des micelles
3.1- Formulation des micelles encapsulant un fluorophore
3.2- Étude de pharmacocinétique après administration par voie intraveineuse
3.4- Étude de biodistribution après injection par voie intra-veineuse
4- Étude pharmacocinétique de la formulation du GW3965
IV- Formulation de deuxième génération
1- Optimisation structurale et formulation
1.1- Synthèse des dérivés du GW3965
1.2- Formulation dans les micelles PDA-PEG et caractérisations
1.3- Études in vitro sur l’efficacité de la formulation
2- Études in vivo des formulations des dérivés du GW
2.1- Étude de pharmacocinétique
2.2- Étude de l’activité transcriptionnelle in vivo
V- Fonctionnalisation pour du ciblage actif
1- Modification de l’amphiphile pour un ciblage actif
1.1- Fonctionnalisation des micelles
1.2- Caractérisations
2- Étude in vivo avec le RXP470.1
VI- Conclusions et perspectives
Chapitre 2 : Micelles fluorées pour l’imagerie par résonance magnétique du fluor
I- L’IRM 19F en tant qu’outil diagnostique de tumeurs solides
1- Principe de l’IRM
1.1- Principe physique
1.2- Agents de contraste développés pour l’IRM
2- IRM du fluor-19
2.1- Avantages du fluor-19
2.2- Développement de sondes fluorées
3- Applications à l’imagerie de tissus tumoraux
4- Vers la conception de micelles fluorées
5- Objectifs
II- Formulation du PERFECTA à l’aide de micelles fluorées
1- Synthèse des amphiphiles PFTD-PEG
2- Assemblage des micelles et caractérisations
2.1- Détermination de la CMC
2.2- Assemblage
3- Formulation de la molécule de PERFECTA
3.1- Synthèse du PERFECTA
3.2- Formulation dans les micelles PFTD-PEG
3.3- Détermination du taux de chargement par RMN 19F
4- Caractérisations
4.1- Détermination de la taille et de la structure des nanoparticules
4.2- Étude de stabilité de la formulation
III- Études de toxicité et imagerie cellulaire
1- Tests de cytotoxicité
2- Imagerie cellulaire
IV- Évaluation du potentiel diagnostique des micelles de PERFECTA par IRM
1- Mise au point du protocole IRM
1.1- Préparation des échantillons et gamme de concentration
1.2- Optimisation de la séquence IRM
2- Études préliminaires in vivo
3- Évaluation du potentiel diagnostique
3.1- Croissance et implantation des tumeurs
3.2 – Optimisation du protocole in vivo
3.3- Acquisition des données IRM
3.4- Résultats
3.5- Analyses ex vivo
3.5.1 Expérience IRM
3.5.2 Expérience RMN 19F
VI- Conclusion et perspectives
Chapitre 3 : Nanoparticules d’or pour l’imagerie et la radiothérapie
I – Applications des nanoparticules d’or en nanomédecine
1- Propriétés optiques des nanoparticules d’or
2- Préparation de nanoparticules d’or
2.1- Synthèses de nanoparticules sphériques par voie chimique
2.1.1- Synthèse de Turkevich,
2.1.2- Synthèse de Brust
2.2- Stratégies de fonctionnalisation
2.2.1- La fonctionnalisation directe
2.2.2- La fonctionnalisation indirecte
3- Nanoparticules d’or en imagerie et thérapie
3.1- Nanoparticules d’or pour l’imagerie par tomodensitométrie
3.1.1- Principe de fonctionnement du contraste aux rayons X
3.1.2- Intérêt diagnostique des nanoparticules d’or
3.2- Utilisation de nanoparticules d’or pour la radiothérapie
3.2.1- Principe de la radiothérapie
3.2.2- Intérêt thérapeutique des nanoparticules d’or
4- Objectifs
II – Préparation des micelles encapsulant les nanoparticules d’or
1- Stratégie mise en œuvre
2- Préparation des micelles encapsulant les nanoparticules d’or
2.1- Synthèse des nanoparticules d’or
2.2- Échange du ligand
2.3- Encapsulation des nanoparticules d’or dans les micelles
3- Quantification de l’or
4- Caractérisations
4.2- Analyses de SAXS
4.3- Études de stabilité
III – Imagerie par tomodensitométrie
1- Mise au point par tomodensitométrie
2- Expériences de tomodensitométrie in vivo
IV – Conception de micelles pour la radiothérapie
1- Imagerie TEP-scan et choix du radionucléide
2- Synthèse des amphiphiles
3- Essais de chélation du zirconium
4- Assemblage des micelles et caractérisations
5- Encapsulation des nanoparticules d’or
6- Solubilisation du dioxygène
V – Conclusion et perspectives
Conclusion Générale
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