AMPLIFICATION EN CHAINE PAR POLYMERASE (PCR) ET SEQUENÇAGE DE LA LOOP

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Ulcère de jambe

L’ulcère est une plaie chronique avec perte de substance pouvant aller de la peau jusqu’à l’os. Il est d’étendue variable, provoqué ou d’apparition insidieuse, ne guérit pas de lui-même et siège le plus souvent au niveau de la jambe (Figure 2). L’ulcère de jambe est principalement dû à une cause vasculaire : veineuse ou artérielle, voire les deux simultanément (ulcère mixte)(ulceredejambe.com).

GÉNÉTIQUE DE L’ULCÈRE DE LA JAMBE

D’après un article de Zamboni et al. (2005), des études jumelles ont démontré une forte héritabilité des fonctions veineuses chez les humains et suggèrent qu’il pourrait y avoir des modificateurs génétiques qui modulent le risque d’ulcères de jambe chez les patients atteints d’anémie falciforme. Cette hypothèse est cohérente d’après la grande variabilité dans le développement de cette complication chez les patients. Cependant, la littérature sur les associations génétiques avec l’ulcère de jambe est très limitée. Les résultats des études de gènes candidats ont été examinés et les résultats préliminaires d’une étude d’association génomique (GWAS) rapportés pour une découverte impartiale des modificateurs génétiques de ce phénotype (Minniti et al., 2010).
Des résultats limités sont disponibles reliant la susceptibilité à l’ulcère de jambe aux variantes génétiques. Une petite étude de 9 cas et 29 témoins a montré des associations possibles d’allèles HLA-B35 et CW14: l’étude a montré que les porteurs des deux allèles augmentent le risque de complications de 17 fois (Ofosu et al., 1987).
Cependant, cette étude était très faible et la région identifiée est très difficile à étudier en raison du déséquilibre de liaison à longue distance (Ofosu et al., 1987). Dans une étude de gène candidat de 243 cas (âgés de 34,8 +/- 12,5 ans) et de 516 témoins (âgés de 30,7 +/- 9,4 ans) du CS SCD, Nolan et al (2006) ont examiné les associations de 250 polymorphismes à un seul nucléotide (SNP) en 60. Les gènes candidats ont été choisis pour leur rôle putatif dans la pathophysiologie de l’anémie falciforme (Nolan et al., 2006). L’analyse a révélé des associations de SNP dans Klotho, TEK et plusieurs gènes dans la voie de signalisation TGF-β / BMP par des analyses d’associations génotypiques (Nolan et al., 2006). KL favorise directement ou indirectement la production de NO endothéliale et le récepteur TEK tyrosine kinase est impliqué dans l’angiogenèse (Nolan et al., 2006). La voie de signalisation TGF-β / BMP module la guérison des plaies et l’angiogenèse, parmi ses autres fonctions (Sebastiani P. et al. (Ashley-Koch., et al., 2008). Certains des mêmes SNP étaient également associés au risque d’accident vasculaire cérébral, de priapisme et d’hypertension pulmonaire (Sebastiani et al., 2006 ; Ashley-Koch et al., 2008). Les résultats sont cohérents avec l’observation que l’ulcère de jambe est associé à l’intensité de l’anémie hémolytique et d’autres sous-phénotypes de HbSS (Taylor et al., 2008).

MATERIEL ET METHODES

POPULATION D’ÉTUDE

Cette étude a été soumise à l’appréciation du Comité d’Ethique et de la Recherche de l’Université Cheikh Anta DIOP de Dakar qui l’a approuvé sous la Référence : Protocole 0238/2017/CER/UCAD. Une lettre d’information et un formulaire de consentement libre et éclairé ont été adressés aux potentiels candidats avant de leur administrer un questionnaire (Cf. Annexe 1). Au cours de cette étude, un recrutement de patients a été effectué dans deux Etablissements Publics de Santé (EPS) : Institut d’Hygiène Sociale (IHS) et Centre National de Transfusion Sanguine (CNTS). Trois populations de cinquante individus chacune ont été ciblé, soit un nombre total de cent cinquante (150) individus. Quatre-vingt-dix-huit (98) individus (18 Témoins Sains, 48 Témoins Drépanocytaires et 32 Drépanocytaires avec Ulcère de jambe) ont pu être recrutés et prélevés. Pour chaque personne recrutée et enquêtée, un prélèvement de sang veineux a été effectué sur tube EDTA. Les prélèvements ont été codifiés comme suit : PTS : Patient Sain, PTD : Patient Drépanocytaire et PDU : Patient Drépanocytaire avec Ulcère de la jambe. Un numéro est affecté à chaque patient suivant l’ordre des prélèvements.

ETUDE GÉNÉTIQUE

EXTRACTION DE L’ADN DU SANG

L’ADN total du sang a été extrait avec le protocole du Kit Zymo Research (Quick-DNA) blood. Pour chaque individu, 200 μl de sang ont été prélevés et déposés dans un tube eppendorf de 1,5 ml. 200 µl de BioFliud & Cell Buffer et 30 µl de Protéinase K ont été ajoutés au mélange et vortéxés pendant 15 s. Le mélange a été incubé à 70°C pendant 30 min. Après cette incubation, 430 µl de Genomic Binding Buffer ont été ajoutés au mélange et vortéxés pendant 15 s. Le mélange obtenu a été déposé dans une colonne Zymo-Spin puis centrifugé à 13000 rotations par minute (rpm) pendant une minute pour retenir l’ADN au niveau de la membrane silice de la colonne. L’ADN étant chargé négativement a été absorbé sur la membrane silice de la colonne (chargée positivement) par interaction ionique alors que les protéines, les lipides et les polysaccharides passent à travers la membrane et se retrouvent au fond du tube collecteur qui sera alors jeté. L’ADN fixé sur la colonne est ensuite purifié par ajout successif de 400 µl de DNA Pre-Wash Buffer et de 700 µl de g-DNA Wash Buffer suivie d’une centrifugation pendant 1 min à 13000 rpm. L’effluent et le tube collecteur ont été jetés. Ensuite 50 μl de tampon d’élution incubé au préalable à 70°C ont été directement versés sur la membrane placée dans un tube de 1,5 ml pour recueillir l’ADN. A la fin de ces processus d’extraction, l’ADN est conservé à -20°C.

AMPLIFICATION EN CHAINE PAR POLYMERASE (PCR) ET SEQUENÇAGE DE LA D-LOOP

La D-Loop, est le marqueur mitochondrial qui a été retenu dans cette étude par ce qu’elle présente beaucoup d’intérêts car elle est la seule région non codante de l’ADNmt. Elle contient l’origine de réplication du brin lourd et les sites d’initiation de la transcription et de la réplication (Larsson et Clayton, 1995). Ses extrémités renferment les régions les plus polymorphes du génome mitochondrial (HV1 et HV2) (NIANE, 2015).
La PCR consiste en une amplification in vitro d’une séquence connue d’ADN double-brin (ADN matrice) par extension de deux amorces par une ADN polymérase, en présence de déoxynucléotides (dNTP) et d’ions Mg2+. La PCR a été réalisée dans un thermocycleur de marque Eppendorf et dans des conditions décrites dans le tableau II. 7 µl du produit PCR et 3 µl de bleu de charge sont ensuite déposés, sur un gel d’agarose de 1,5% suivie d’une visualisation aux UV après une migration de 30 min à 100 volts (Cf. Annexe 2). Les produits PCR positifs ont été purifiés et séquencés avec l’amorce sens (H408). Les réactions de séquençage ont été effectuées dans un thermocycleur de type MJ Research PTC-225 Peltier avec le Kit ABIPRISM et soumises à une électrophorèse dans le séquenceur ABI 3730 XL.

ANALYSE DE LA VARIABILITÉ GÉNÉTIQUE

L’analyse de la variabilité génétique a révélé que la population PDU est plus polymorphe, suivie de la population PTS. De même un plus grand nombre de mutations a été retrouvé chez la population PDU, puis celle PTS. L’analyse du polymorphisme a révélé des valeurs élevées de diversité haplotypique et de faible diversité nucléotidique pour les trois populations prises séparément (Tableau I). L’analyse des fréquences nucléotidiques a montré que les bases C et A sont plus fréquentes pour toutes les trois (3) populations [Pour C : PTS : 29.9 %, PTD : 29.8 %, et PDU : 29.9 % et pour A : PTS : 27.9 %, PTD : 27.8 %, et PDU : 28.1 %). De même, les proportions de [T + C] (55.1 pour PTS, 55 pour PTD et 55 pour PDU) sont supérieures à celles de [A + G] (45 pour PTS, 45 pour PTD et 45.1 pour PDU) pour toutes les trois populations Cf. Annexe 8. Le nombre de sites polymorphes (S), le nombre d’haplotypes (h), la diversité haplotypique (Hd) et la diversité nucléotidique (π) ont été déterminés grâce au logiciel DnaSP 5.10 (Librado & Rozas, 2009). Un haplotype correspond à une combinaison donnée de nucléotides constituant une séquence pouvant être commune à plusieurs individus. Plus la diversité haplotypique est élevée au sein de l’échantillonnage, plus il y a de chances d’observer des haplotypes différents lorsque l’on sélectionne 2 individus au hasard (Nei, 1987). La diversité nucléotidique mesure le nombre moyen de différences entre 2 séquences choisies aléatoirement dans l’échantillonnage (Nei & Li, 1979). Plus les séquences sont distantes en termes de nombres de sites polymorphiques les différenciant, plus la diversité nucléotidique sera élevée.

Mode de recueil des données

– Questionnaire préétabli, standardisé et testé
– Prélèvement de sang recueilli sur tube EDTA
– TE et Electrophorèse de l’hémoglobine faits sur le tube EDTA
– acheminement du tube au laboratoire de biologie moléculaire du centre de Biologie des Populations Animales Sahélo-Soudanienne (BIOPASS) à l’IRD de Bel Air, auprès du Pr Mbacké
– Analyses génétiques au Laboratoire BIOPASS: Extraction, PCR et séquençage des gènes prédisposant à l’ulcère de jambe

Chronogramme des activités

La collecte des prélèvements, les tests d’Emmel et électrophorèses de l’hémoglobine se feront du mois de mai au mois d’octobre 2017, l’analyse des données au mois de novembre 2017.

Analyses génétiques

Les prélèvements de sang total sur tube EDTA acheminés au laboratoire BIOPASS subiront tout d’abord une extraction de l’ADN, puis une amplification par PCR des gènes suspectés responsables de la prédisposition à l’ulcère de jambe (HLA B 35 et CW 14), puis un séquençage de ces produits de PCR permettra leur analyses par comparaison avec un échantillonnage de sujets témoins (sujets sans drépanocytose ni ulcère de jambe). L’analyse des données permettra d’explorer et d’analyser les différents paramètres de la diversité génétique, de la différenciation génétique, et même des tests démo-génétiques. Elle se fera à l’aide de logiciels de bio-informatiques et de génétique des populations comme BioEdit, DNASP5, MEGA6, Arlequin, Genepop, Etc.

Analyses statistiques

Données saisies et traitées à l’aide de plusieurs logiciels statistiques comme Excel 2013, R studio R version 3.1.3 (2015-03-09), et autres pour des test statistiques comme les moyenne, médiane, mode, variances, écart-types, déviation standard…

Aspects éthiques

Le consentement éclairé de chaque patient est requis pour son admission dans l’étude. De plus cette étude sera soumise au comité éthique de l’Université Cheikh Anta DIOP (UCAD) de Dakar pour analyse et autorisation.

Aspects financiers

Etude n’ayant pas bénéficié de financement, elle rentre dans le cadre de mémoire de fin d’étude de Master II de Biologie Animale, option Génétique des Populations.
Les frais du Test d’Emmel (TE) et de l’électrophorèse de l’hémoglobine sont à la charge des patients venus au laboratoire et qui par la suite ont été coptés pour l’étude après les avoir faits sur demande du médecin consultant.
Les analyses génétiques sont assurées par le laboratoire BIOPASS de Bel-Air à ses frais. Certains TE sont assurés par le laboratoire de Biologie dans le cas où il a initialement été réalisé ailleurs et que le patient nous a été adressé pour l’électrophorèse de l’hémoglobine. Les frais à notre charge sont donc :
– les frais de communications : appels téléphoniques, textos, connexion internet, déplacement, …
– photocopies et distribution des questionnaires

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE I. SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1. DRÉPANOCYTOSE
I.1.1. GÉNÉRALITÉS
I.1.2. Traitements
I.2. Ulcère de jambe
I.3. GÉNÉTIQUE DE L’ULCÈRE DE LA JAMBE
CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES
II.1. POPULATION D’ÉTUDE
II.2. ETUDE GÉNÉTIQUE
II.2.1. EXTRACTION DE L’ADN DU SANG
II.2.2. AMPLIFICATION EN CHAINE PAR POLYMERASE (PCR) ET SEQUENÇAGE DE LA LOOP
II.2.4. ANALYSES MOLÉCULAIRES
CHAPITRE III. RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. RESULTATS
III.1.1. TESTS STATISTIQUES
III.1.2. RECHERCHE DES MUTATIONS
III.1.3. ANALYSE DE LA VARIABILITÉ GÉNÉTIQUE
III.1.4. ANALYSE DE LA DIFFÉRENCIATION ET DE LA STRUCTURATION GÉNÉTIQUE
III .1.5. Analyse des tests de neutralité
III.2. Discussion
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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