Amplification des marqueurs par PCR

Matériel et méthodes

Obtention de matériel biologique

Isolats de référence

La première étape de ce travail a été l’identification des isolats de Ganoderma spp. pertinents pour cette étude, et disponibles sous forme de cultures pures dans les collections fongiques. Ces isolats constitueront les souches de référence pour les études phylogénétiques de la famille des Ganodermataceae. Après une analyse de la littérature, nous souhaitions obtenir :
– Des isolats de différentes espèces appartenant aux sept groupes monophylétiques caractérisés dans la littérature pour le genre Ganoderma
– Des isolats des différentes espèces du genre Ganoderma identifiées dans la littérature comme pathogènes du palmier à huile
– Des isolats des différentes espèces du genre Ganoderma dont la présence à été rapportée au Cameroun Pour cela, la base de données référençant les souches fongiques du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS-KNAW Fungal Biodiversity Center) a été analysée afin de sélectionner les isolats de Ganoderma spp. correspondant à nos critères. Les 20 souches sélectionnées sont présentées dans le Tableau 2.

 Échantillonnage en plantations

La deuxième étape de ce travail a été l’échantillonnage de sporophores de Ganoderma spp. au Cameroun, durant une mission de terrain qui s’est déroulée du 24 février au 22 mars 2013. Les sporophores (ou sporophores – organes de la fructification) produits par le champignon et localisés à la périphérie du stipe ont été récoltés sur 4 sites de plantations de palmier à huile du groupe SOCAPALM (SOciété CAmerounaise des PALMeraies) et sur un site du groupe CDC (Cameroon Development Corporation). Les sites ont été choisis en fonction des rapports d’incidence de la maladie, et les plantations peu affectées n’ont pas été considérées pour cette étude. Ainsi, des prélèvements de sporophores frais en conditions d’infection naturelle sur des palmiers à huile atteints de pourriture du stipe ont été réalisés sur les sites de Dibombari, d’Edéa, de Kienké et de SAFACAM pour la SOCAPALM, et sur le site de Mungo pour la CDC (cf. Figure 3). Le protocole de prélèvement des échantillons ainsi que la fiche de collecte détaillée sont présentés en Annexe 2.

Préparation des isolats

Isolats de référence (laboratoire GFP, Montpellier)

Lors de la réception des 20 isolats du CBS au laboratoire (cf. Figure 4), nous avons immédiatement procédé à une multiplication des isolats en boite de Petri sur de nouveaux milieux de culture PDA (Potato Dextrose Agar) supplémentés en chloramphénicol, ainsi que sur ces mêmes milieux auxquels ont été ajoutés des disques de nitrocellulose. Cet élément permet par la suite de séparer facilement le mycélium de la gélose, afin de limiter les impuretés lors des processus d’extraction de l’ADN fongique. Pour chaque isolat, il a été réalisé 2 cultures sur milieu PDA-chloramphénicol ainsi que 2 cultures sur PDAchloramphénicol avec film de nitrocellulose. Les cultures ont été incubées à 28°C à l’obscurité pour stimuler la croissance du mycélium, et ont été observées chaque semaine. Les détails de composition des différents milieux de culture sont présentés en Annexe 3.

Isolats du Cameroun (laboratoire de phytopathologie de Dibombari, Cameroun)

Après la collecte des sporophores frais sur les palmiers à huile infectés des différentes plantations, ils ont été conservés à 4°C et acheminés au laboratoire de phytopathologie de Dibombari (SOCAPALM), ou se sont déroulées les étapes de mise en culture et de purification des isolats (cf. Figure 5).Tout d’abord, les sporophores ont été nettoyés à l’eau distillée avec l’aide d’une brosse, pour éliminer les débris végétaux et les éventuels contaminants. Ils ont été ensuite séchés à l’aide de papier absorbant, puis les parties externes du sporophore ainsi que l’hyménium ont été éliminés à l’aide d’un couteau et d’un scalpel stérilisés. L’hyménium doit être éliminé car, contrairement à l’hyménophore qui est dicaryotique, il s’agit d’un tissu cellulaire majoritairement monocaryotique (Carlyle et al., 2001). Dans le but d’obtenir un isolat génétiquement identique à celui ayant produit la fructification récoltée, nous devons utiliser uniquement du tissu dicaryotique. Cela est important afin d’éviter la mise en culture puis la fusion de deux mycélium haploïdes qui produiront, certes, un mycélium diploïde, mais génétiquement différent de l’isolat d’origine. Après cette étape de préparation du sporophore,le cube d’hyménophore ainsi obtenu est brièvement immergé dans de l’éthanol à 96° sous une hotte à flux laminaire pour désinfecter l’échantillon, puis il est déposé dans une boite de Petri stérile sous la hotte quelques minutes pour permettre à l’alcool de s’évaporer. Les parties externes du cube sont encore une fois éliminées à l’aide d’un scalpel stérile afin d’obtenir un fragment d’environ 1cm3. Elles seront déshydratées et conservées dans des sachets contenant du SilicaGel, ce qui nous permet de conserver du matériel biologique de chaque échantillon qui servira à réaliser l’extraction d’ADN si les isolats en culture pure ne peuvent pas être obtenus. Le cube est alors débité en 16 fragments de quelques millimètres, qui seront déposés dans 4 boîtes de Petri contenant un milieu Water-Agar supplémenté en chloramphénicol et en streptomycine, à raison de 4 fragments équitablement répartis dans chaque boite de Petri (cf.Figure 6). Ce milieu de culture est un milieu sélectif non nutritif, ce qui permet d’isoler efficacement le mycélium issu des sporophores de Ganoderma spp. tout en limitant la présence et le développement de contaminants. Les cultures ont été incubées à 28°C à l’obscurité pour stimuler la croissance du mycélium, et ont été observées quotidiennement.
Lorsqu’un mycélium d’aspect pur est observable, un fragment de ce dernier est transféré sur milieu PDA supplémenté en chloramphénicol, et incubé à 28°C (cf. Figure 6). Les détails de composition des différents milieux de culture sont présentés en Annexe 3.Après environ 10 jours d’incubation, 8 fragments de gélose des isolats purifiés sur PDA-chloramphénicol ont été transférés dans des tubes Wheaton stériles contenant 5 ml d’eau Milli-Q stérile, sous la hotte à flux laminaire. Cette étape nous permet de conserver l’isolat en culture pure durant 6 mois sans perte de vigueur, et facilite également son transport. De la même façon, pour chaque isolat, un fragment de gélose PDA-chloramphénicol colonisé par le mycélium a été déposé de façon stérile dans un tube Wheaton contenant 2 ml de milieu PDAchloramphénicol. Les tubes ont ensuite été incubés à 28°C à l’obscurité jusqu’à la colonisation complète du milieu de culture. Cette étape nous permet de nous assurer que, en cas de contamination des tubes Wheaton contenant de l’eau stérile et les fragments de milieux de culture colonisés, nous pourrons tout de même remettre en culture l’isolat après l’acheminement des échantillons en France.Lors du retour en France, les différents isolats ont été remis en culture sur milieu PDA-chloramphénicol, à la fois dans des boites de Petri classiques et dans des boites de Petri où le milieu de culture a été recouvert d’un film de nitrocellulose. Les isolats ont été incubés à l’obscurité à 28°C à 80% d’humidité jusqu’à colonisation complète du milieu de culture.

Table des matières

I – Introduction
Programme de recherche
II – Matériel et méthodes
II.1 – Obtention de matériel biologique
II.2 – Préparation des isolats
II.3 – Extraction d’ADN
II.4 – Amplification des marqueurs par PCR
II.5 – Séquençage, traitement, et construction des arbres phylogénétiques
III – Résultats
III.1 – Matériel biologique
III.2 – Extraction d’ADN
III.3 – Amplification des marqueurs par PCR
III.4 – Séquençage, traitement, et construction des arbres phylogénétiques
IV – Discussion
IV.1 – Obtention du matériel biologique
IV.2 – Préparation des isolats
IV.3 – Extraction d’ADN
IV.4 – Amplification des marqueurs par PCR
V – Conclusion
Bibliographie
Annexes

Télécharger le rapport complet