Amélioration de la détection des vésicules extracellulaires issues des polynucléaires neutrophiles

Définition

   Les vésicules extracellulaires (VE) représentent un continuum de vésicules délimitées par une membrane constituée d’une bicouche lipidique, avec une taille comprise entre 50 et 3000nm. Toutes les cellules de l’organisme sont capables de vésiculer et ainsi les VE peuvent être retrouvées dans tous les fluides biologiques tels que le sang, le liquide pleural, la salive ou le liquide céphalo-rachidien rendant plus ou moins facile l’accès aux VE. Elles sont étudiées dans de nombreux domaines comme des éléments participants à des processus physiopathologiques ou comme étant le reflet d’un événement biologique (biomarqueur). Certaines études les envisagent également comme vecteurs ou cibles thérapeutiques. Classiquement, 3 catégories de VE sont distinguées selon leurs mécanismes de formation : les corps apoptotiques (CA), les microvésicules (MV) et les exosomes (Tableau 1). C’est en 2005 que pour la première fois un sous-comité de standardisation de biologie vasculaire est créé au sein de l’International Society of Thrombosis and Heamostasis (ISTH), dans le but de démarrer un travail de nomenclature et de standardisation sur les VE2. Puis en 2011, une société internationale pour les VE (ISEV) est créée et reprend largement les travaux initiaux pour clarifier et proposer un consensus sur les différentes sous-populations de VE3. Cette société propose donc d’utiliser le terme de « vésicule extracellulaire » comme terme générique pour parler de particules libérées de façon physiologique ou pathologique par la cellule, formée d’une bicouche lipidique, ne pouvant pas se répliquer et ne contenant pas de noyau fonctionnel. Depuis, l’ISEV publie régulièrement des recommandations aux chercheurs : les MISEV pour Minimal information for studies of extracellular vesicles. Les dernières recommandations datent de 2018 et concernent non seulement la nomenclature, mais également les outils à mettre en œuvre pour prouver l’origine vésiculaire des échantillons, ou encore les bonnes de pratiques de préparation des échantillons. Les méthodes d’isolement des VE ne permettent pas actuellement d’obtenir des préparations ne contenant qu’une seule catégorie de VE. Pour cette raison l’ISEV préfère l’utilisation des termes suivants pour qualifier les préparations de VE : les « petites » VE et « larges » VE4 .

Biomarqueur, notion de biopsie liquide

   Le NIH Biomarkers Definitions Working Group définit un biomarqueur comme une caractéristique mesurable objectivement et évaluée comme un indicateur des processus biologiques normaux ou pathogènes ou d’une réponse pharmacologique à une intervention thérapeutique. Le biomarqueur permet ainsi de diagnostiquer une maladie, d’évaluer sa gravité, le risque de récidive ou encore prédire la réponse ou monitorer la posologie d’un traitement. Les MV véhiculent un grand nombre d’informations de par leur contenu en lipides, protéines et acides nucléiques. Elles ont rapidement été considérées comme de potentiels nouveaux biomarqueurs. Elles sont retrouvées dans de nombreux fluides biologiques tels que le sang, le liquide pleural, l’urine ce qui constitue également un avantage dans l’utilisation comme biomarqueur. Ceci permettrait notamment d’éviter le recours à des gestes invasifs tels qu’une biopsie d’organe. En effet, il est possible de retrouver dans le sang circulant des MV issues de cellules non circulantes comme le cancer du pancréas28, ou de la prostate, le myélome multiple30, mais également dans les cancers liquides31. D’autres contextes physiopathologiques sont également étudiés pour le développement de la biopsie liquide comme les pathologies cardiovasculaires ou les pathologies de la grossesse32. C’est de ce constat que les MV ont montré leur intérêt comme biomarqueur lors de biopsie liquide. À ce jour, de nombreuses études proposent la mesure des MV circulantes dans différents contextes physiopathologiques tels que les pathologiques cardiovasculaires, neurologique, ou néoplasique33 (Figure 4).

Propriétés non cellulaires des NDMV

   Les NDMV possèdent diverses propriétés grâce aux nombreuses protéines qu’elles portent, en l’absence d’interaction avec une cellule cible. Une propriété antibactérienne d’une sous-population de NDMV a été décrite. Ces NDMV produites lors d’une stimulation par le récepteur Mac-1 (Macrophage 1 antigen) ou en présence d’agents opsonisants ont la capacité de former des agrégats avec les bactéries permettant de limiter la croissance bactérienne au moment des stades précoces d’une infection. Les NDMV interviennent également dans l’hémostase. Tout d’abord, une activité procoagulante médiée par les NDMV a également été détecté dans certaines études notamment lorsque les cellules mères étaient stimulées par fMLP, anticorps anticytoplasmique des PNN (ANCA) par augmentation de la génération de thrombine in vitro. Cette propriété procoagulante peut être médiée par la présence de phospholipides négatifs, de facteur tissulaire40 activant la voie extrinsèque de la coagulation mais aussi par l’intermédiaire du facteur XII41 qui cette fois ci activera la voie intrinsèque de la coagulation. De plus, une autre étude montre, cette fois ci, la capacité des NDMV à pouvoir intervenir dans la lyse d’un thrombus grâce à l’expression du système urokinase et de son récepteur.

Chromatographie d’exclusion de taille

   Cette technique sépare en fonction de la vitesse de déplacement des différents éléments dans une matrice contenant des billes poreuses69,70 (Figure 9). Ces pores peuvent avoir une taille variable et conditionnent donc la taille des MV récupérées à la fin de l’élution de l’échantillon dans la colonne de chromatographie. Les MV sont alors récupérés dans le tampon d’élution de la colonne de chromatographie, qui peut être modifié, séparer des autres éléments contenus dans l’échantillon initial (protéines, ions…). Cette méthode possède donc l’un des rendements de purification les plus élevés des MV vis-à-vis des protéines solubles. Une colonne est remplie d’une phase stationnaire constituée de bille avec des nanopores ne pouvant laisser entrer des éléments de taille inférieure à environ 70 nm. Les MV les plus grandes seront donc éluées plus rapidement que les protéines solubles contenues dans l’échantillon initial. Cette technique permet donc la séparation entre les éléments solubles et les MV. Lorsque des échantillons plasmatiques sont étudiés, une autre forme de contamination des MV peut persister après passage sur colonne de chromatographie, il s’agit des lipoprotéines plasmatiques. Une étude récente propose d’intégrer directement à la colonne de chromatographie une phase supplémentaire capturant les éléments possédant des charges positives, tels que les lipoprotéines71. Les MV possédant généralement à leur surface des charges négatives par la présence dans leur membrane de phospholipides anioniques, elles ne sont pas retenues dans cette phase de la colonne (Figure 10).

Cytométrie en flux

Développement historique Initialement, la CMF est née du besoin d’automatisation du comptage des cellules sanguines circulantes. Les origines de la CMF débutent en 1934 avec Moldavan qui a conçu le premier appareil avec lequel il énumérait les cellules en les faisant défiler dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo-électrique. L’utilisation d’un anticorps couplé à une molécule fluorescente (fluorochrome) date de 1941, pour détecter des pneumocoques. Puis en 1945, W Coulter a mis au point un appareil permettant de compter des cellules et de mesurer leur taille par variation de résistivité du courant liquidien. C’est en 1953 que Crosland-Taylor utilise pour la première fois un système d’injection de l’échantillon dans un flux laminaire (système décrit par Reynolds en 1833). L’utilisation d’un laser comme source lumineuse n’est apparue qu’en 1969 par Dan villa, car il permet une meilleure focalisation du faisceau, une grande puissance d’excitation et une stabilité du chromatisme. Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entraînées par un flux avec des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales. La diffusion de la lumière compléta rapidement la liste des propriétés capables de discriminer plusieurs types cellulaires. Dans les années 80 seulement 3 paramètres de fluorescences étaient analysables par cellule, aujourd’hui il est possible d’en acquérir 21 pour les cytomètres les plus performants. De nos jours les cytomètres continuent d’évoluer pour permettre l’acquisition de nouvelles données. Par exemple, certains cytomètres proposent de prendre une photographie de chaque élément passant devant le détecteur, il est également possible de trier une ou plusieurs sous-populations de cellules sélectionnées selon un phénotype particulier et celles-ci pourront être utilisées pour les tests in vitro ou encore être mises en culture.

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Table des matières

Introduction
Contexte bibliographique
Partie 1 Les vésicules extracellulaires
1.1 Définition
1.1.1 « Larges » vésicules extracellulaires
1.1.1.1 Les corps apoptotiques
1.1.1.2 Les microvésicules
1.1.2 « Petites » vésicules extracellulaires ou exosomes
1.2 Potentiel intérêt d’utilisation des Microvésicules
1.2.1 Vecteur thérapeutique
1.2.2 Cible thérapeutique
1.2.3 Biomarqueur, notion de biopsie liquide
1.3 Intérêt des vésicules extracellulaires issues de polynucléaires neutrophiles
1.3.1 Propriétés non cellulaires des NDMV
1.3.2 Capacité NDMV à induire une réponse chez une cellule cible
1.3.3 NDMV et pathologie humaine
Partie 2 Méthodes de purifications et de concentration des vésicules extracellulaires
2.1 Centrifugation différentielle
2.2 Centrifugation avec gradient de densité
2.3 Méthode purification par la taille
2.3.1 Chromatographie d’exclusion de taille
2.3.2 Filtration tangentielle
2.4 Chromatographie par échange d’ion
2.5 Méthode de purification par précipitation
2.5.1 Précipitation avec polymères
2.5.2 Précipitation par solvant organique protéique
2.6 Séparation immunologique
2.7 Système microfluidique : principe du déplacement latéral déterministe
Partie 3 Les Méthodes de Détection des Vésicules extracellulaires
3.1 Cytométrie en flux
3.1.1 Développement historique
3.1.2 Principes généraux de la cytométrie en flux
3.1.2.1 Chambre d’analyse
3.1.2.2 La source lumineuse
3.1.2.3 Paramètres optiques obtenus
3.1.2.4 Système optique
3.1.2.5 Conversion des photons en électrons : Photodétecteurs
3.1.2.6 Conversion des électrons en signal analytique
3.1.3 Analyse des MV par cytométrie en flux
3.1.3.1 Stratégies d’analyse
3.1.3.2 Limites de l’analyse des MV par CMF
3.1.3.3 Intérêt du CytoFLEX dans l’étude des MV
3.1.3.4 Outils de détection des MV en cytométrie de flux
3.1.3.5 Standardisation
3.1.4 Autres techniques reposant sur la cytométrie de flux
3.1.4.1 Tri de Microvésicules
3.1.4.2 Imageur en flux
3.2 Autres méthodes de détection
3.2.1 Méthode d’étude individuelle des vésicules extracellulaires
3.2.1.1 Techniques de microscopie
3.2.1.2 Analyse du suivi individuel de particules (Nanoparticle Tracking Analysis)
3.2.1.3 Impédance : Resistive pulse sensing and tunable
3.2.2 Méthodes permettant d’étudier un ensemble de vésicules extracellulaires
Travaux personnels

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