Altérations de la sécrétion après traitement à la néomycine

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Organismes pluricellulaires et morphogenèse

Déjà mise à mal par la théorie cellulaire, la théorie préformiste va connaître un coup d’arrêt avec les travaux de H. Driesch [7], en 1894, qui montrent que jusqu’au stade 8-cellules, chaque blastomère isolé de l’embryon d’oursin est ca-pable de donner un oursin complet. Chaque cellule contient donc toutes les infor-mations nécessaires à la formation d’un organisme complet (épigenèse). Cepen-dant Driesch estime qu’à l’heure où il avance ces idées, la connaissance que l’on a des lois physico-chimiques ne permet pas de comprendre l’auto-structuration du vivant. Une des premières tentatives visant à expliquer ces processus nous est fournie par A. Turing en 1952 [8]. Dans The chemical basis of Morphoge-nesis, il va poser un des problèmes centraux de la biologie de l’époque, le lien entre morphologie et information génétique. Turing part du principe que les gènes peuvent être vu comme des catalyseurs qui influencent l’anatomie d’un organisme en modulant la vitesse/rendement des réactions qu’ils catalysent. Il introduit ensuite la notion de morphogène comme : « chemical substances, cal-led morphogens, reacting together and diffusing through a tissue ». Il propose qu’initialement ces morphogènes soient uniformément distribués puis que via des interactions entre eux ils se répartissent en patrons organisés spatialement. Ensuite, ces morphogènes distribués de manière non-homogène dans le tissu vont activer des réactions chimiques (par l’intermédiaire de l’activation de gènes) qui donneront à ce tissu sa forme finale/attendue/développée. Tout en notant le côté novateur de ce modèle, C.H. Waddington émettra quelques réserves sur la théorie de Turing 7, notamment que ce modèle ne permet pas d’expliquer comment est régulée la taille finale des organismes ni comment apparaissent au sein de l’embryon un nombre fini d’organes et de tissus (sans états intermé-diaires). Peu à peu, ces mécanismes d’auto-structuration lors du développement ne vont plus être appréhendés d’un point de vu purement spatial (espace physique) mais comme des relations entre des réseaux génétiques dans des états donnés. En 1969, L. Wolpert introduit le concept d’information positionnelle [9] et son célèbre « French Flag model » qui permet d’expliquer l’apparition de structures distinctes (comme les bandes bleues, blanches et rouges du drapeau français) au sein d’un espace donné, et ce peu importe la taille effective de cet espace physique. En 1972, A. Gierer et H. Meinhardt proposeront un modèle assez proche de celui de Turing mais tenant compte des aspects moléculaires et cellulaires à la base des phénomènes observés [10]. Cependant, ces modèles se heurtent à une limitation majeure, celle de ne pas connaître la nature molécu-laire de leurs acteurs. C’est grâce à l’observation d’anomalies développementales qu’une partie des gènes à la base de la morphogenèse vont pouvoir être identifiés.

Transformations homéotiques : observations et naissance du concept.

William Bateson 8 décrit pour la première fois, en 1894, des cas d’animaux dont une partie du corps a été remplacée par une autre (abeilles avec des pattes à la place des antennes, des écrevisses avec des oviductes supplémentaires, ou encore des cas de polydactylie, ou un nombre de côtes anormal chez l’Homme). Il nomme ce phénomène « homeosis » et caractérise ce genre de transforma-tion par l’adjectif « homéotique » [11]. En 1915, Calvin B. Bridges décrit le premier cas d’un mutant homéotique chez la drosophile (qui s’avérera être le modèle de choix pour la découverte des gènes homéotiques). Ce mutant, qu’il nomme bithorax (bx), présente un troisième segment thoracique converti en second segment thoracique, et donne donc une mouche dont les haltéres sont remplacées par une paire d’ailes. Bridges, qui « cartographie » la mutation bx, est le premier à établir un lien entre transformation homéotique et une mutation donnée [12]. Cependant, les mécanismes à l’œuvre derrière ces modifications du plan d’organisation restent non élucidés.

Du phénotype aux gènes, description des pre-miers gènes homéotiques

En 1971, J. H. Postlehwait et H. A. Schneiderman [13] décrivent la morphogenèse de l’antenne chez le mutant antennapedia de la drosophile, où les antennes sont remplacées par des pattes. Ils proposent que les transformations homéotiques proviennent d’un dérèglement de gènes de contrôle entrainant les cellules d’un programme développemental à un autre (ici de l’antenne vers la patte). C’est avec les travaux de E. B. Lewis, qu’il résume en 1978 [14], que le premier lien direct entre un complexe génique et le développement d’une partie d’un organisme est établi. Il montre que le complexe polygénique bithorax (BX-C), localisé sur le chromosome 3, est responsable de la segmentation thoracique et abdominale de l’embryon de drosophile, via la modulation de l’état de répres-sion des 8 gènes qui le compose (bx+, pbx+, Ubx+, bxd+, iab-2+, iab-3+, iab-5+, 8. A qui on doit également l’introduction publique, en 1905, du terme « génétique », du grec genn¯o, γεννώ (« donner naissance »), utilisé en tant que nom pour désigner l’étude de l’hérédité et de la variation inter-individuiab-8+). Enfin il suggère qu’il existe une colinéarité entre l’expression antéro-postérieure et la situation proximo-distale de chaque gène au sein de BX-C. Un autre complexe de gènes homéotiques, le complexe Antennapedia (ANT-C), est décrit peu de temps après BX-C [15]. Des mutations au sein de ce complexe al-tèrent le développement de la partie antérieure (prothorax, proboscis, antennes, yeux) de l’embryon de drosophile. Dans les deux cas, il est proposé que c’est l’expression / répression combinatoire de l’ensembles des gènes de ces deux com-plexes qui permet aux différentes parties de l’embryon d’acquérir une identité positionnelle le long de l’axe antéro-postérieur de la larve. Du fait de la similarité d’organisation et de la relative proximité chromosomique de BX-C et ANT-C, les auteurs reprennent une hypothèse déjà formulée par E. B. Lewis, suggérant une origine évolutive commune à ces deux complexes avec l’existence d’un pro-bable complexe homéotique ancestral. La description chez le scarabée Tribolium castaneum d’un seul et unique complexe homéotique (HOM-C) regroupant les fonctions de ANT-C et BX-C [16] va confirmer cette idée. Par la suite, un tel complexe va être identifié dans la totalité des phyla bilatériens métazoaires. Chez les vertébrés, ce complexe HOM-C est retrouvé, à de rares exceptions près, en quatre exemplaires (désignés HOXA à HOXD) localisés sur des chromosomes différents. A eux quatre ils comportent 39 paralogues des gènes d’ANT-C et de BX-C. Néanmoins cette conservation de la structure des complexes multigé-niques homéotiques n’est, semble-t-il, qu’apparente, au vu des grandes disparités (tailles des régions intergéniques, orientations transcriptionnelles des membres du complexe, insertion ou non de gènes non-homéotiques, morcellement plus ou moins prononcé) existant dans l’organisation des complexes homéotiques dans les différentes lignées métazoaires [17]. Enfin, bien que l’identification des gènes homéotiques soient intimement liée à la découverte des ces complexes multigé-niques, il est fondamental de noter que bon nombre des gènes homéotiques se situent en dehors de ces complexes, au niveau de régions diverses et variées du génomes (voir pour exemple [18]).

L’homeobox, séquence commune aux gènes ho-méotiques

Le clonage des premiers gènes homéotiques [20, 21, 22, 23] représente une étape majeure dans la compréhension de leur structure et de leur fonctionne-ment. C’est en 1984 que les premiers travaux faisant état d’une séquence propre aux gènes homéotiques sont publiés. W. McGinnis et al. [24] sont les premiers
à montrer une similarité de séquence entre différents gènes de BX-C et ANT-C en hybridant des sondes d’ADNc correspondant à diverses portions des gènes Antennapedia (Antp) et fushi tarazu (ftz) et de de l’ADN génomique. Ils dé-couvrent ainsi qu’il existe une forte homologie de séquence entre les régions 3’ de Antp et ftz, le « H repeat », et que ce H repeat se retrouve à d’autres endroits du génome de la drosophile, et notamment au niveau de BX-C, mais aussi de nouveaux loci présentant des caractéristiques compatibles avec une fonction ho-méotique (restriction spatiale stricte des transcrits au cours de l’embryogenèse, localisation cytogénétique au niveau de gènes homéotiques déjà décrits). Les auteurs en déduisent qu’il existe une séquence commune aux loci homéotiques, qu’ils nomment homeobox. Très vite, des loci contenant des homeobox sont trou- vés chez le xénope [25], chez la souris [26, 27] ou chez l’Homme [28]. L’homeobox est donc une séquence conservée chez les métazoaires suggérant ainsi des mé-canismes communs lors du développement. Dès la découverte de l’homeobox, la communauté scientifique à chercher à connaitre la fonction de cette séquence. En alignant les produits protéiques potentiels des régions d’homologie entre les gènes Antp, Ubx et ftz M. P. Scott et al. [29] montre que la conservation de l’homeobox se retrouve potentiellement au niveau protéique, et qu’une homolo-gie de séquence existe même avec des facteurs de régulation de conjugaison MAT α1 et α2 de la levure [30]. De part la forte présence de résidus basiques au sein de la séquence de ce domaine protéique putatif, qui est nommé homéodomaine [31], l’hypothèse que ce soit un motif de liaison à l’ADN est très vite formulée.

Structure et fonction de l’homéodomaine : l’homéoprotéine comme facteur de transcrip-tion.

Avant même de connaître la structure de l’homéodomaine, le rôle de régu-lateur transcriptionnel du produit des gènes homéotiques a été étudié. L’auto-amplification du gène ftz via fixation de son produit sur une de ses propres régions activatrices va être montrée [32], et ensuite des travaux effectués in vitro vont illustrer les rôles à la fois d’activateurs et de répresseurs de la transcrip-tion des produits de nombreux gènes homéotiques [33, 34, 35, 36, 37]. Ensuite, c’est la structure même de l’homéodomaine qui va être élucidée, d’abord seul dans le cas d’ANTENNAPEDIA (ANTP) [38], puis interagissant avec un duplex d’ADN dans le cas d’ENGRAILED (EN)[19]. Il s’agit d’un domaine protéique d’une soixantaine d’acides aminés organisés en trois hélices α. Le contact entre l’homéodomaine et ADN se fait via l’insertion de la troisième hélice α, ou hélice de reconnaissance, dans le grand sillon de l’ADN, et également via le domaine N-terminal qui va interagir avec le petit sillon de la double hélice d’ADN. De manière intéressante, l’homéodomaine isolé garde sa capacité à se lier à l’ADN [39]. Déjà évoquée [29], l’homologie de structure entre l’homéodomaine et des facteurs de conjugaison de la levure est confirmée expérimentalement [40]. Par la suite, une classification des protéines à homéodomaine, ou homéoprotéines, a été proposée sur la base de la présence de séquences conservées, autres que l’homéodomaine [41, 18].

Sites de liaisons à l’ADN

Les séquences précises d’ADN reconnues par les homéoprotéines on ensuite été identifiées [42, 43, 44]. Il est ainsi apparu que ces sites de liaison étaient très proches, une séquence consensus contenant la « boîte » ATTA pouvant même être établie (citation). Ceci peut s’expliquer par la conservation très impor-tante des résidus de la troisième hélice α entre les différentes homéoprotéines [41, 18]. L’existence d’une telle séquence consensus pose cependant question quant à la spécificité de la liaison entre ADN et homéoprotéines, celles-ci ayant toutes la capacité, à peu de choses près, de se fixer sur les mêmes séquences génomiques. Plusieurs éléments ont été apportés afin de tenter de comprendre d’où provenait la spécificité de fonction de chaque homéoprotéine. Un premier élément de réponse est la présence au sein de la troisième hélice de l’homéo-domaine d’un résidu qui lorsqu’il est muté modifie la spécificité de liaison de l’homéoprotéine PAIRED (PRD) vers les séquences reconnues habituellement par FUSHI TARAZU (FTZ) ou BICOÏD (BCD) [45], suggérant que les résidus non-conservés de l’hélice de reconnaissance puissent être à la base d’une certaine sélectivité. Un autre élément fondamental à prendre en compte est la capacité des homéoprotéines à se multimériser (homo-, hétéro-dimères, trimères). Cette multimérisation induit de nombreux changements dans les propriétés des ho-méoprotéines comme la modification de la spécificité de liaison à des séquences d’ADN, une interversion entre les fonctions activateur et répresseur au niveau d’un site donné, ou encore une modification de la localisation sub-cellulaire (voir [46] pour revue). Enfin, il est également proposé que la partie N-terminale de l’homéodomaine, également en contact avec l’ADN, puisse aussi être à l’origine d’une certaine sélectivité de fixation à des séquences données.

Fonction physiologique

Au cours du développement embryonnaire, les différentes homéoprotéines sont exprimées selon des patrons d’expression très bien définis, que ce soit spa-tialement ou temporellement. L’expression combinatoire de ces protéines assure la mise en place du plan d’organisation de l’organisme, en conférant aux cellules une identité positionnelle précise. Etant donnée leur capacité à réguler la trans-cription, une association donnée d’homéoprotéines va ainsi entraîner la mise en place de l’expression d’un répertoire de gènes donnés qui, à terme, conduira à la différentiation de la cellule, et permettra la formation d’un tissu fonctionnel. Leur implication au niveau de la morphogenèse a lieu à différents niveaux. Ainsi l’expression régionalisée des membres des complexes ANT-C, BX-C ou HOXs va permettre la mise en place des axes antéro-postérieur et dorso-ventral de l’em-bryon. Les homéoprotéines ne sont pas seulement des protéines polarisantes lors du développement, mais elles sont également à la base de la formation de struc-tures morphologiques distinctes suivant leurs domaines d’expression en regard de ces mêmes axes. De par la grande diversité d’homéoprotéines recensées 9, le nombre potentiellement très important de leurs gènes cibles 10, ainsi que la ré-gulation complexe de leur activité de facteur de transcription (voir §3.3.1), il est difficile de dresser un état des lieux exhaustif de l’implication des homéopro-téines dans le développement. Cette complexité peut être illustrée dans le cas du développement de la rétine, où environ 25 homéoprotéines différentes sont requises pour la formation d’une rétine parfaitement fonctionnelle [48].
Historiquement, l’étude de la fonction des homéoprotéines a donc été centrée sur la compréhension de leur action en tant que facteurs de transcription nu-cléaires. L’observation plus précise du comportement de ces homéoprotéines à l’échelle cellulaire et non plus seulement à l’échelle de l’organisme, a cependant permis d’envisager un mode d’action nouveau pour celles-ci.

Internalisation d’ANTENNAPEDIA, premier indice d’un transfert intercellulaire des ho-méoprotéines

Une première indication quant à un rôle dépassant le cadre du facteur de transcription pour les homéoprotéines va être apportée par A. Joliot et al. [49]. Le but de cette étude était de comprendre l’implication des homéogènes dans la morphogenèse cellulaire, et notamment dans le cas des neurones pour lesquels morphologie et fonction sont étroitement liés. Dans ce but, les auteurs ont tiré avantage de la capacité de l’homéodomaine isolé à conserver sa spécificité de liaison à l’ADN [39], pour s’en servir comme d’un inhibiteur compétitif 11 pour la fixation sur les sites génomiques des protéines homéotiques endogènes aux neurones. Ainsi, l’introduction artificielle de l’homéodomaine purifié d’ANTP (ANTP-HD) dans des neurones embryonaires en culture entraîne une modifi-cation nette de leur morphologie. De manière beaucoup plus inattendue, cette étude montre également que lorsqu’il est ajouté dans le milieu de culture, ANTP-HD est capable de pénétrer à l’intérieur des neurones et de s’accumuler au sein du noyau. Dans ce second cas, une modification morphologique des neurones est aussi observée. Ces résultats impliquent donc : i) ANTP-HD est capable de pé-nétrer dans des neurones en franchissant des membranes biologiques intactes, ii) ANTP-HD conserve une activité biologique après son internalisation (qui passe effectivement par sa liaison à l’ADN [50]). Ces observations sont à la base d’un champs d’étude nouveau, l’observation des propriétés cellulaires des homéopro-téines, et notamment l’étude de leur éventuelle fonction non-cellulaire-autonome directe, comme nous allons le voir par la suite.

L’homéodomaine comme élément central de cette internalisation

L’internalisation de ANTP-HD a lieu à 37◦C comme à 4◦C, suggérant qu’elle se base au moins en partie sur des mécanismes énergie-indépendants (à l’inverse de l’endocytose classique qui nécessite une hydrolyse d’ATP). Après son inter-nalisation, ANTP-HD est retrouvé intact dans les cellules et n’est pas dirigé vers les compartiments de dégradation. Une région précise de l’homéodomaine, correspondant à la troisième hélice α, est nécessaire et suffisante pour son in-ternalisation [51]. Au sein de cette séquence de 16 acides aminés, un doublet d’acides aminés aromatiques WF a une importance primordiale car lorsque ces deux résidus sont délétés, l’internalisation de l’homéodomaine est drastiquement réduite [50]. La capture de cette troisième hélice α, nommée Penetratin, par les cellules ne dépend pas d’un récepteur chiral de surface. En effet, des peptides composés de D-énantiomères ou dont la séquence a été inversée sont eux aussi internalisés aussi efficacement que le peptide « sauvage » à 4◦C et 37◦C [52], et la Penetratin est capable de se transloquer au travers de vésicules lipidiques ar-tificielles dans certains modèles expérimentaux [53]. La structuration en hélice α de la Penetratin n’est pas un élément clé de ce processus, l’insertion de prolines en son sein n’empêchant pas son internalisation [52]. Sachant que la troisième hélice est la partie la plus conservée de l’homéodomaine parmi toutes les ho-méoprotéines, on peut s’attendre à ce que la capacité d’internalisation ne soit pas une capacité propre à ANTP mais commune à d’autres protéines de cette famille. Que ce soit dans le cas d’homéodomaines seuls ou de protéines entières, on retrouve effectivement cette propriété chez d’autres homéoprotéines comme HOX5A [54], ENGRAILED-2 (EN-2) [55], HOXC8, HOXB4, EMX1, EMX2, OTX2 ou PAX6 [56]. Comme c’est le cas pour la Penetratin, le tryptophane en position 48 de l’homéodomaine est également très important pour l’interna-lisation de l’homéodomaine seul [50] ou de l’homéoprotéine entière [55]. Ceci suggère donc que certains des mécanismes à la base de l’internalisation sont similaires entre Penetratin, homéodomaine et homéoprotéines entières. Sur la base de travaux biophysiques, il est proposé que la Penetratin puisse traverser les membranes biologiques via la formation de structures lipidiques intermé-diaires de type micelles inversées [57]. Plus récemment, un nouveau mécanisme impliquant une courbure de la membrane plasmique conduisant à des invagi-nations mimant un processus d’endocytose classique même en absence d’ATP a été proposé [58]. Persistent cependant de nombreuses zones d’ombre dans la compréhension de cette internalisation, et notamment en ce qui concerne les homéoprotéines entières.
La découverte de la capacité commune aux homéoprotéines d’être interna-lisées par des cellules vivantes a conduit à ne plus considérer cette famille pro-téique qu’uniquement comme une famille de facteurs de transcription au rôle cellulaire-autonome strict mais aussi comme des protéines à activité paracrine. Seul écueil à cette hypothèse, aucune homéoprotéine ne possède de peptide signal de sécrétion, le prérequis classique pour cette activité, la sécrétion de l’homéoprotéine devant alors être due à des mécanismes non décrits jusqu’alors.
La capacité pour les homéoprotéines d’être transférées entre cellules va être démontrée par des travaux sur la protéine ENGRAILED (EN).

Brefs rappels des fonctions d’ENGRAILED

Cette homéoprotéine, caractérisée chez la drosophile, joue de nombreux rôles durant le développement, en définissant par exemple les domaines postérieurs de chaque parasegment de l’embryon [59, 60], ou bien encore de l’aile [61]. Chez les vertébrés, on trouve deux gènes Engrailed, En1 et En2. Les protéines EN-1 et EN-2 correspondantes possèdent des patrons d’expression assez similaires, se distinguant surtout par leur expression temporelle, durant le développement embryonnaire. On les retrouve ainsi exprimées dans le neuroépithélium antérieur à partir du stade 1 (EN-1) ou au stade 4-5 somites (EN-2), puis au niveau de la région mésencéphale/métencéphale en formation. EN-1 est également retrouvé transitoirement dans de nombreux autres domaines de l’embryon tels que la peau, la partie ventrale des bourgeons des membres ou encore certains neurones de la moelle épinière [62, 63]. Collectivement, EN-1 et EN-2 régulent la formation de la frontière entre diencéphale et mésencéphale [64], ainsi que la mise en place de l’axe rostro-caudal du tectum visuel [65]. Enfin, ces deux protéines sont également exprimées au niveau des neurones dopaminergiques de la substance noire et de l’aire tegmentale ventrale. Leur expression n’est pas requise pour la différentiation des progéniteurs neuronaux en neurones dopaminergiques mais est essentielle pour la survie de ces derniers au cours du développement ainsi qu’à l’âge adulte [66].
D’un point de vue moléculaire EN a été initialement décrit comme un étant un répresseur transcriptionnel [67]. In vivo, l’activité de répresseur transcrip-tionnel actif d’EN est liée à la protéine GROUCHO ou ses orthologues chez les vertébrés, les protéines de la famille TLE (Transducin-like Enhancer of Split). L’interaction entre EN et son co-répresseur GROUCHO/TLEs, via le domaine EH1 d’EN, est une étape importante dans l’établissement d’une répression trans-criptionnelle [68]. D’autres partenaires protéiques de EN, tels que les co-facteurs EXD/PBX, modulent son activité transcriptionnelle. L’interaction entre EN et PBX-1 ou son homologue chez la drosophile EXD, est en effet responsable d’un basculement du rôle de répresseur vers celui d’activateur de la transcription [69]. Ce changement dans l’activité d’EN peut s’expliquer par le fait que l’interac-tion avec EXD/PBX-1 entraîne une modification des sites spécifiques d’ADN reconnus par EN [70, 71, 72, 73]. La formation d’hétérodimères entre EN et EXD/PBX-1 repose sur la présence d’un domaine conservée au sein de la pro-téine EN, l’hexapeptide, qui se situe juste en amont de l’homéodomaine [74]. Bien que beaucoup de cibles génomiques potentielles d’EN aient été identifiées [47], l’activité transcriptionnelle effective d’EN au niveau de ces sites n’a pu être vérifiée que dans un nombre restreint de cas. On pourra ainsi citer les gènes de la β-tubuline 3 [75], du fgf8 [69], de map-1b [76], de bpag-1 [77] ou de polyhomeotic [78] dont l’expression dépend d’une régulation directe par EN. Dans les exemples précédents, EN a un rôle d’activateur dans les cas des gènes polyhomeotic, fgf8 et map-1b (ex vivo).

Mise en évidence et mécanismes connus de la sécré-tion d’ENGRAILED-2

L’observation d’une localisation non-nucléaire, et plus précisément l’associa-tion des protéines EN-1 et EN-2 avec des compartiments membranaires in vivo, dans des tissus nerveux embryonnaires de rat et ex vivo, dans des cellules COS-7 exprimant un EN-2 de poulet, a été le premier indice concernant une sécrétion de ces protéines [80]. Plus précisément, une partie du EN-2 endogène est associé à des vésicules de faible densité non-solubilisées par le TritonX-100, enrichies en glycosphingolipides et en cholestérol. Les protéines EN-2 et Caveolin-1 co-exprimées dans les cellules COS colocalisent dans des vésicules présentant les caractéristiques des cavéoles (absence de manteau de clathrine, taille réduite). Dans ce même article, les auteurs montrent également qu’une partie de la frac-tion de EN-2 associée à ce compartiment membranaire est protégée de l’action de la protéinase K, suggérant que la protéine a en partie accès au compar-timent luminal de ces vésicules. L’ensemble de ces résultats démontre qu’une partie de l’EN-2 intracellulaire a accès un compartiment subcellulaire vésicu-laire a priori compatible avec des mécanismes de sécrétion. La mise en évidence du transfert intercellulaire de EN-2, et donc implicitement de sa sécrétion, a été réalisée en utilisant un système de co-culture entre des cellules COS-7 ex-primant la protéine EN-2 et des neurones ne l’exprimant pas. Après fixation et immunomarquage, la protéine est détectée à la fois dans les cellules COS-7 et les neurones, montrant qu’un transfert intercellulaire a bien eu lieu [55]. La délétion d’une séquence de 11 acides aminés situés au sein de l’homéodomaine, juste en amont du doublet WF évoqué plus tôt (voir §3.2), abolit la sécrétion de EN-2. La sensibilité à la protéinase K de la forme tronquée de EN-2 (appelée EN2Δ1) localisée dans le compartiment membranaire suggère que son défaut de sécrétion pourrait être lié à une localisation subcellulaire modifiée (pas d’accès au lumen de certaines vésicules par exemple). Il est intéressant de noter que la forme mutante de EN-2 dans laquelle le doublet WF est remplacé par un doublet SR (notée EN2SR) semble toujours sécrétée mais est internalisée beaucoup moins efficacement que la forme sauvage, montrant que sécrétion et internalisation né-cessitent des séquences différentes, toutefois localisées dans les deux cas au sein de l’homéodomaine. La forte déstabilisation de la structure de l’homéodomaine engendrée par la délétion Δ1 n’est pas la seule cause du défaut de sécrétion du mutant associé. La séquence Sec, qui correspond aux acides aminés délétés, est en effet capable de promouvoir la transcytose de la Penetratin au travers d’une monocouche cellulaire [81]. La sécrétion d’ENGRAILED est donc un processus actif.

Une capacité de transfert intrinsèque aux ho-méoprotéines

Nous avons déjà vu précédemment qu’une partie des mécanismes de trans-fert avaient été illustrés en utilisant de nombreuses homéoprotéines différentes (ANTP, EN-2, HOX5A, HOXC8, HOXB4, KN-1). Une autre série d’études 12 a permis d’illustrer, in vivo, le transfert intercellulaire d’autres homéoprotéines telles que OTX2 [87, 88, 89], PAX6 [90, 91], VAX1[92] ou encore HOXD1 [93]. Bien que s’attardant plus sur les conséquences physiologiques de ce transfert plutôt que sur les mécanismes à l’œuvre derrière ce mode d’action paracrine, ces résultats renforcent l’hypothèse que le transfert intercellulaire est une pro-priété commune aux homéoprotéines. Il faut noter que les mécanismes de sécré-tion et/ou d’internalisation alternatives, que l’on qualifiera désormais de non-conventionnelles, dépassent largement le seul cadre des homéoprotéines. Les tra-vaux qui seront présentés par la suite dans ce manuscrit, et qui visent justement à mieux comprendre ces mécanismes, se basent en partie sur d’autres cas de sé-crétions et d’internalisations non-conventionnelles qui vont être présentés dans le chapitre suivant.

La voie reticulum endoplasmique / appareil de Golgi / vésicules de sécrétion : mode de sécrétion cano-nique

La grande majorité des protéines solubles destinées à la sécrétion suivent une voie commune dont les mécanismes sont quasi-invariants d’une protéine à une autre. L’adressage vers cette voie de sécrétion se fait de manière co-traductionnelle. La reconnaissance par le complexe protéique SRP (Signal Re-cognition Particle) d’un peptide signal situé en N-terminal de la protéine en cours de traduction entraîne l’association du complexe ribosome/chaîne poly-peptidique naissante/SRP avec la membrane du reticulum endoplasmique. En parallèle de sa traduction, la protéine est alors transférée vers le compartiment luminal du reticulum endoplasmique par l’intermédiaire d’un canal de translo-cation, le translocon (pour revue [94]). Le peptide signal de sécrétion est ensuite clivé, puis la protéine connaît une première étape de maturation (repliement, création de ponts disulfure, ajout du motif de base de la N-glycosylation) au contact d’enzymes et de protéines chaperonnes (pour revue [95]). La sortie du reticulum endoplasmique s’effectue par l’intermédiaire du bourgeonnement de vésicules, caractérisées par leurs protéines d’enveloppe, le complexe COPII. Ces vésicules COPII vont ensuite fusionner avec les saccules de l’appareil cis-golgien (pour revue [96]). Une fois au sein de l’appareil de Golgi, les protéines vont subir un second cycle de maturation (O-glycosylations par exemple), puis sont ensuite triées selon leur destination au niveau du réseau trans-golgien (TGN) (pour re-vue [97]). Des vésicules de sécrétion issues de l’appareil de Golgi sont orientées vers la membrane plasmique où la dernière étape du processus de sécrétion va avoir lieu, à savoir la formation d’un porosome issu d’une fusion partielle entre ces vésicules et la membrane, permettant la libération de leur contenu dans l’espace extracellulaire (pour revue [98]). Le bon déroulement de cette voie de sécrétion repose ainsi sur des échanges successifs de membranes (par des intermédiaires vésiculaires) entre compartiments donneurs et accepteurs. Ces événements de fusions dirigées entre organelles intracellulaires requièrent une famille de protéine centrale, les protéines SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor). Par des jeux d’interactions com-plémentaires entre SNAREs exprimées au niveau des compartiments donneurs (v-SNAREs, pour vesicular-SNARE) et accepteurs (t-SNAREs, pour target-SNARE), ces protéines vont promouvoir une fusion contrôlée entre les compar-timents membranaires de la voie de sécrétion standard (pour revue [99]) (Figs. 5 et 6).

En opposition à la voie canonique, les modes de sé-crétion non-conventionnels

Au fil des ans, un nombre croissant de protéines sécrétées ne suivant pas la voie évoquée dans le paragraphe précédent a été répertorié. L’ensemble de ces événements, que l’on regroupe sous l’appellation vague de sécrétion non-conventionnelle, concerne des protéines diverses et variées aux propriétés bio-chimiques et fonctionnelles hétérogènes. Dans leur vaste majorité, ces sécré-tions non-conventionnelles ont comme point commun d’avoir comme substrat des protéines sans peptide signal de sécrétion, ainsi que d’avoir lieu de fa-çon post-traductionnelle (plus ou moins vrai pour golgi bypass). De manière systématique, ces sécrétions non-conventionnelles sont insensibles à la Bréfel-dine A (BFA), une substance pharmacologique qui bloque la sécrétion clas-sique, en annihilant le transport entre le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. Cependant leur regroupement sous le terme générique de sécrétion non-conventionnelle ne doit pas laisser penser que l’ensemble de ces processus obéit aux mêmes mécanismes cellulaires, chaque protéine utilisant un méca-nisme qui lui semble propre. Une classification des grands types de sécrétions non-conventionnelles a néanmoins été proposée [102], et c’est en se basant sur celle-ci et en l’adaptant que nous allons passer en revue différents exemples.
Le premier type de sécrétion non-conventionnelle regroupe essentiellement des protéines transmembranaires qui sont dirigées vers la membrane plasmique par des voies alternatives mais dérivant de la voie de sécrétion standard. Après synthèse, ces protéines sont retrouvées au niveau du reticulum endoplasmique à partir duquel elles vont être adressées à la membrane plasmique, sans passer par l’appareil de Golgi (« Golgi bypass »). Une des caractéristiques communes à ces protéines est leur sensibilité à l’endoglycosidase H (EndoH), qui est capable de cliver le motif de base riche en mannose de la N-glycosylation spécifique au reticulum endoplasmique car perdu par la suite au niveau de l’appareil de Golgi après maturation de la chaîne glycosylée. Les formes matures devenant résistantes à l’action de l’enzyme, la sensibilité à l’EndoH peut être considérée comme un marqueur potentiel d’un « Golgi bypass » [103]. Un des exemples les mieux documenté d’un tel processus concerne le canal ionique cystic fi-brosis transmembrane conductance regulator (CFTR), dont la forme mutante CFTRΔF508, incapable de quitter le reticulum endoplasmique, est impliquée dans près de 70% des cas de mucoviscidose. L’export de CFTR du reticulum endoplasmique se fait par l’intermédiaire des vésicules COPII, comme pour la sécrétion standard, mais la protéine n’est pas retrouvée au sein de l’appareil de Golgi. De plus sa sécrétion est insensible à l’expression de mutants domi-nants négatifs des protéines ARF1, RAB1a/RAB2 ou Syntaxin5 décrits comme bloquant les échanges entre le reticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. La fraction membranaire de CFTR présente cependant des glycosylations com-plexes caractéristiques de l’appareil de Golgi, et l’expression d’un mutant domi-nant négatif de la Syntaxin 13, qui régule les échanges vésiculaires au niveau du compartiment endosomal tardif et du réseau trans-golgien, abolit la sécrétion de CFTR [104]. CFTR serait donc transféré directement du reticulum endo-plasmique vers un compartiment mixte endosome tardif / réseau trans-golgien (où auraient lieu les glycosylations) puis ensuite vers la membrane plasmique.
L’accumulation de CFTR dans un compartiment intermédiaire péri-centrosomal [105] suggère l’existence d’une ou plusieurs étapes entre la sortie du reticulum endoplasmique et la présentation à la membrane de CFTR.
On peut également citer les exemples de la protéine-tyrosine phosphatase transmembranaire CD45 et des connexines 26 (Cx26) et 30 (Cx30). Ainsi, dans les lymphocytes T, une partie de la fraction membranaire de CD45 est sensible à l’action de EndoH. Cette même fraction est présentée beaucoup plus rapidement à la membrane après synthèse (∼ 5 minutes) que la fraction non-sensible à EndoH (∼ 15 minutes) dont le répertoire de glycosylations est différent [106]. L’adressage à la membrane de CD45 pourrait résulter en partie du processus conventionnel et en partie d’un Golgi bypass, les mécanismes précis de ce dernier n’étant pour l’heure pas connus. En ce qui concerne Cx26 et Cx30, là aussi les mécanismes précis de leur adressage à la membrane ne sont pas connus, mais ils semblent impliquer le cytosquelette d’actine, ainsi que les microtubules dans le cas de Cx26 [107, 108].

Table des matières

I Introduction 
1 La théorie cellulaire, à la base de la biologie cellulaire moderne. 
1.1 Genèse de la théorie cellulaire : De Hooke à Schwann et Schleiden.
1.2 Théorie cellulaire moderne : omnis cellula e cellula
1.3 La cellule comme unité fondamentale du vivant
2 De la cellule à l’organisme, morphogenèse et homéoprotéines.
2.1 Organismes pluricellulaires et morphogenèse
2.2 Transformations homéotiques : observations et naissance du concept.
2.3 Du phénotype aux gènes, description des premiers gènes homéotiques.
2.4 L’homeobox, séquence commune aux gènes homéotiques
2.5 Structure et fonction de l’homéodomaine : l’homéoprotéine comme facteur de transcription
2.5.1 Structure protéique de l’homéodomaine
2.5.2 Sites de liaisons à l’ADN
2.5.3 Fonction physiologique
3 Homéoprotéines, facteurs de transcription aux propriétés remarquables
3.1 Internalisation d’ANTENNAPEDIA, premier indice d’un transfert intercellulaire des homéoprotéines
3.2 L’homéodomaine comme élément central de cette internalisation.
3.3 Sécrétion des homéoprotéines : le cas ENGRAILED-2
3.3.1 Brefs rappels des fonctions d’ENGRAILED
3.3.2 Mise en évidence et mécanismes connus de la sécrétion d’ENGRAILED-2
3.4 Une capacité de transfert intrinsèque aux homéoprotéines
4 Bases cellulaires du transfert intercellulaire et conséquences fonctionnelles
4.1 La sécrétion à la base de la communication cellulaire
4.1.1 La voie reticulum endoplasmique / appareil de Golgi / vésicules de sécrétion : mode de sécrétion canonique
4.1.2 En opposition à la voie canonique, les modes de sécrétion non-conventionnels
4.1.3 Une classification arbitraire et non figée
4.2 Après la sécrétion : différents mode d’intégration du signal transmis
4.2.1 Les différentes voies endocytiques
4.2.2 Détournement des voies endocytiques
4.3 Implications physiologiques du transfert intercellulaire des homéoprotéines.
4.3.1 Action paracrine de l’homéoprotéine OTX2
4.3.2 Action paracrine de l’homéoprotéine ENGRAILED
4.3.3 Autres modèles d’action paracrine
4.3.4 Action paracrine des homéoprotéines et pathologies
II Matériels et méthodes 
III Résultats 
5 Etude comparée de la sécrétion du FGF2 et d’EN-2. 
5.1 Propriétés communes
5.2 Méthode de quantification de la sécrétion
5.3 Altérations de la sécrétion après traitement à la néomycine
6 Les phosphoinositides
6.1 Brefs rappels des fonctions et rôles connus des phosphoinositides
6.2 Mise en évidence d’une interaction directe entre EN-2 et phosphoinositides
6.2.1 Interaction avec des bicouches lipidiques artificielles
6.2.2 Interaction directe in vitro
6.3 Localisation subcellulaire et phosphoinositides
6.4 Rôle des PI(4,5)P2 dans la sécrétion d’EN-2 et du FGF2 : approche sub-cellulaire
6.4.1 Présentation des outils utilisés
6.4.2 Validation biologique des constructions mises au point
6.4.3 Analyse de la sécrétion de EN-2 et du FGF2
6.5 Rôle des PI(4,5)P2 dans l’internalisation d’EN-2
6.5.1 Technique utilisée pour l’observation de l’internalisation
6.5.2 Un lien entre PI(4,5)P2 membranaires et internalisation d’EN-2
7 Les protéoglycanes
7.1 Présentation des protéoglycanes
7.2 Importance des protéoglycanes de surface dans l’internalisation d’EN-2
7.2.1 Lien entre expression de protéoglycanes fonctionnels et internalisation d’EN-2
7.2.2 L’expression de syndecans favorise l’accumulation d’EN-2 à la surface des cellules
7.3 Impact de l’expression de syndecans sur la sécrétion d’EN-2
8 Implication d’une nouvelle séquence dans le transfert intercellulaire d’EN-2
8.1 Un nouveau rôle pour l’hexapeptide ?
8.2 Article no 1 ; Contrôle de la segmentation du cerveau en développement par le transfert paracrine d’Engrailed : une nouvelle fonction du domaine d’interaction avec Pbx
IV Discussion 
9.1 Rôle des PI(4,5)P2 dans le transfert intercellulaire de EN-2
9.2 Rôle des protéoglycanes dans le transfert intercellulaire de EN-2.
9.3 Interactions hydrophobes et électrostatiques, un équilibre subtil ?
Bibliographie 

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