Soutenance mémoire
La maladie d’Alzheimer
La démence affecte la mémoire, le raisonnement, le comportement des personnes ainsi que leur aptitude à réaliser des tâches quotidiennes. Aujourd’hui, plus de 35 millions de personnes sont atteintes de démence dans le monde et, selon la plupart des études épidémiologiques, ce chiffre devrait tripler d’ici 2050 (World Alzheimer Report 2015, ADI). Cependant, un article récent regroupant plusieurs études épidémiologiques a reconsidéré la prévalence de développer une démence au sein des populations européennes. Les auteurs observent une stabilisation, voire une légère diminution de la prévalence des cas de démences en Europe au cours des vingt dernières années par rapport aux prédictions de l’époque (Wu et al., 2015). Ils mettent en avant les changements sociétaux (éducation, conditions de vie, moyens de prévention mis en place) qui impactent positivement la santé de la population. Cette stabilisation de la prévalence dans certains pays européens ne semble pas concerner les pays d’Afrique et d’Asie où, au contraire, une augmentation de la prévalence est prévue pour les années à venir. La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme de démence la plus fréquente, représentant environ 70% des cas. Elle a été décrite pour la première par Alois Alzheimer, psychiatre et neuropathologiste allemand, en 1906 après la mort d’une patiente atteinte de démence. Alois Alzheimer procède à une analyse histologique de son cerveau ce qui lui permet d’identifier des lésions spécifiques (Graeber and Mehraein, 1999). En 1911, à la découverte d’un deuxième cas, le psychiatre Emil Kraepelin propose de désigner ce type de démence « maladie d’Alzheimer » (MA).
Les signes histopathologiques de la MA
La majorité des cas de MA sont d’origine sporadique mais il existe des formes familiales se déclarant de façon précoce (avant 60 ans). Il a été identifié trois gènes dont les mutations sont impliquées dans le développement de la forme familiale de la MA. L’identification de ces gènes et de la forme familiale de la MA a permis la génération des premiers modèles animaux, accélérant l’étude de cette maladie. A l’origine, la MA a été caractérisée par des études histologiques post-mortem qui ont révélé trois types de lésions : l’atrophie cérébrale, les plaques séniles et les dégénérescences neurofibrillaires.
L’atrophie cérébrale
Les études de tissus post-mortem de patients atteints de la MA ont révélé une atrophie cérébrale de certaines zones du cerveau. Les régions les plus touchées par cette atrophie sont le cortex entorhinal, l’hippocampe ou encore l’amygdale (de la Monte, 1989). L’imagerie par résonance magnétique (IRM) a permis l’étude longitudinale de l’atrophie cérébrale de personnes risquant de développer la MA . L’atrophie démarre dans les lobes temporaux, se poursuit dans les lobes pariétaux puis dans le lobe frontal (Whitwell, 2010). Cette atrophie cérébrale est causée par une perte importante de neurones et de synapses dans ces régions (Whitehouse et al., 1982, Bondareff et al., 1989).
Les dégénérescences neurofibrillaires
Les dégénérescences neurofibrillaires (DNF) sont des lésions composées d’agrégats de la protéine tau anormalement phosphorylée qui s’accumulent dans le corps cellulaire des neurones . La protéine tau appartient à la famille des protéines associées aux microtubules (MAP). Elle interagit avec les microtubules via ses domaines de liaison. Elle est fortement exprimée dans les neurones, particulièrement dans les axones (Binder et al., 1985).
En plus des neurones, le cerveau est composé des cellules gliales regroupant les astrocytes, les cellules microgliales et les oligodendrocytes. Ces cellules gliales, au départ moins étudiées, sont maintenant reconnues comme étant des acteurs majeurs de la plupart des fonctions cérébrales. Leur rôle dans le cadre de la MA est de plus en plus étudié. Dans certaines tauopathies, la protéine tau est retrouvée dans les astrocytes et les oligodendrocytes (Nishimura et al., 1992, Feany and Dickson, 1995, Komori et al., 1998). Cependant aucune étude n’a montré son expression dans les astrocytes de patients atteints de la MA.
En condition physiologique, tau est une protéine soluble permettant la stabilisation des microtubules en promouvant l’assemblage de la tubuline (Cleveland et al., 1977) et la régulation du transport axonal. Elle possède 84 sites potentiels de phosphorylation qui permettent de moduler son activité. En condition pathologique, la protéine tau est anormalement phosphorylée, perd sa propriété de solubilité et forme des structures filamenteuses . La protéine tau hyperphosphorylée n’interagit plus correctement avec les microtubules (Biernat et al., 1993, Bramblett et al., 1993) et s’accumule dans les compartiments somato-dendritiques pour former des agrégats puis des DNF (Kowall and Kosik, 1987).
Les plaques séniles
Les plaques séniles sont des dépôts extracellulaires dus à l’accumulation d’une protéine appelée amyloïde-β (Aβ) selon une conformation en feuillet β. La protéine Aβ dérive de la protéolyse de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP). L’APP peut être clivée par deux voies impliquant différentes enzymes protéolytiques: la voie amyloïdogénique qui conduit à la formation d’Aβ et la voie nonamyloïdogénique qui ne permet pas la production du peptide amyloïde (Haass and de Strooper, 1999). Cette vision binaire du clivage de l’APP s’est récemment enrichie, notamment avec la découverte de la η-sécrétase. Alors que le peptide Aβ a été pointé du doigt depuis longtemps comme étant le peptide participant à la pathologie de la MA, cette η-sécrétase introduit la production d’un nouveau peptide à partir de l’APP : le peptide amyloïde-η. Ce peptide, présent dans les cerveaux des patients atteints de la MA, perturbe la transmission synaptique (Willem et al., 2015). Ces données récentes démontrent la complexité des mécanismes de « processing » de l’APP dans le cerveau. Nous ne savons pas encore si ces mécanismes diffèrent selon le type cellulaire (neurone, cellules gliales) et la région cérébrale observée.
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Table des matières
I. INTRODUCTION
A. La maladie d’Alzheimer
1) Les signes histopathologiques de la MA
a) L’atrophie cérébrale
b) Les dégénérescences neurofibrillaires
c) Les plaques séniles
2) Les associations pangénomiques et les mutations génétiques associées à la MA
a) Le clivage de l’APP : PSEN1, PSEN2 et ADAM10
b) APOE et métabolisme du cholestérol
c) Réponse immunitaire
d) Endocytose
3) La MA, une synaptopathie
4) La MA, une maladie « métabolique »
B. Les interactions entre neurones et astrocytes en conditions physiologiques et pathologiques
1) Organisation, morphologie et fonction des astrocytes
a) En condition physiologique
b) En condition pathologique
2) Les interactions neurones-astrocytes
a) Régulation des flux ioniques
b) Défenses anti-oxydantes
c) Régulation du flux sanguin et de la BBB
d) Intégrité de la BBB et flux sanguin dans la MA
e) Support métabolique des neurones
f) Maintien de l’homéostasie glutamatergique
g) La synapse tripartite et la régulation de la transmission synaptique
h) Sérine: production et libération
II. MATERIEL ET METHODES
A. Le modèle de souris 3xTg-AD
1) Les modèles murins de la MA
2) Les souris 3xTg-AD utilisées lors de ce projet
3) Génotypage
B. Etude du métabolisme cérébral par autoradiographie
1) Principe
2) Protocole
C. Histologie
1) Fixation et coupe des tissus
2) Marquages immuno-histochimiques
3) Marquages immuno-fluorescents
D. Quantification des marquages immuno-fluorescents et analyse de Sholl
1) Quantification de la valeur moyenne des marquages
2) Analyse de Sholl et quantification de l’expression de la PHGDH
E. Biochimie
1) Extraction des protéines
2) Western blot
F. Biologie moléculaire
1) Extraction ARN
2) Synthèse ADNc
3) Real time quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)
4) Génération des plasmides
a) La stratégie Gateway
b) Les plasmides d’entrée
c) Les plasmides de destination
d) Les plasmides AAV
5) Production des AAVs
G. Injections stéréotaxiques
H. Enregistrements électrophysiologiques
1) Préparation des tranches
2) Enregistrements électrophysiologiques
3) Analyse des données
I. Enregistrements FRET
1) Préparation des tranches
2) Enregistrements du signal FRET
3) Analyse de données
J. Electrophorèse capillaire couplée à la fluorescence induite par laser (EC-LIF)
1) Extraction des échantillons de cerveaux
2) Dérivation et dosage de la L-/D-sérine des échantillons
I. Analyses statistiques
III. RESULTATS
A. Caractérisation des souris 3xTg-AD : un modèle de la maladie d’Alzheimer
1) Caractérisation génétique des souris
2) Caractérisation immuno-histologique des souris 3xTg-AD
a) Choix des anticorps
b) Les différences entre les mâles et les femelles 3xTg-AD
c) Caractérisation histopathologique des souris femelles 3xTg-AD dans différentes régions cérébrales
3) Caractérisation de l’inflammation des souris 3xTg-AD
a) Etude par immuno-fluorescence de l’activation astrocytaire et microgliale
b) Analyse de Sholl pour l’étude de l’activation astrocytaire
c) Etude par analyse de Sholl de l’activation astrocytaire des 3xTg-AD
4) Caractérisation fonctionnelle des souris femelles 3xTg-AD
B. Exploration des déficits synaptiques
1) Les altérations de la LTP observées chez les 3xTg-AD sont restaurées par l’ajout de D-sérine
2) Les quantités de L-/D-sérine sont modifiées dans l’hippocampe des souris de 6 mois
3) L’expression de la SRR n’est pas modifiée dans l’hippocampe des souris 3xTg-AD
4) L’expression globale de la PHGDH n’est pas altérée dans l’hippocampe des souris 3xTg-AD
a) La 3-PHGDH est une enzyme astrocytaire
b) L’expression du transcrit de la PHGDH n’est pas modifiée chez les souris 3xTg-AD
c) L’expression de la protéine PHGDH n’est pas altérée chez les souris 3xTg-AD
5) L’influence de la morphologie des astrocytes sur l’expression de l’enzyme PHGDH
a) La morphologie des astrocytes n’influence pas l’expression de la PHGDH entre les 3xTg-AD et les WT
b) L’enzyme PHGDH de l’hippocampe est exprimée de manière différentielle entre les 3xTg-AD et les WT
6) Etude de l’expression d’un transporteur de la L-/D-sérine dans l’hippocampe des souris 3xTg-AD
C. Altérations métaboliques précoces des souris 3xTg-AD par étude in vivo du métabolisme cérébral
1) Etude des paramètres physiologiques des 3xTg-AD: poids et glycémie
2) Etude du métabolisme cérébral des souris 3xTg-AD par autoradiographie
D. Etude du métabolisme cérébral à l’échelle cellulaire par utilisation de sondes FRET
1) Développement de vecteurs viraux s’exprimant dans des types cellulaires spécifiques
a) Ciblage cellulaire spécifique des AAVs
b) Les vecteurs viraux ne provoquent pas de réaction inflammatoire du cerveau
2) Expression des sondes FRET dans différents types cellulaires
3) Enregistrements FRET : résultats préliminaires
IV. DISCUSSION
V. CONCLUSION
