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MATERIELS ET METHODES
MATERIELS UTILISES
Les matériels végétaux utilisés sont les tiges de Dicoma incana, les tiges de Ficus trichopoda et les écorces de la racine de Tetrapterocarpon geayi.
Les échantillons utilisés ont été récoltés au mois de mai 2007 dans la forêt sèche de Masiakampy, à peu près 100 km au nord-est de Toliara. Ils ont été identifiés à partir de l’Herbier du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza.
METHODES D’EXTRACTION
EXTRACTION DES HUILES ESSENTIELLES OU DES PRODUITS VOLATILS PAR HYDRODISTILLATION
Principe
Cette extraction consiste à mettre en contact les explants découpés en petits morceaux avec de la vapeur d’eau. Celle-ci entraîne les huiles contenues dans les vacuoles puis se condense dans l’essencier où l’huile et l’eau se séparent 500 g d’explants sont mis dans un récipient contenant 1 000 ml d’eau. Le mélange est porté à l’ébullition. La vapeur (eau/huile) passant par le réfrigérant se condense dans l’essencier formant deux phases non miscibles : une phase organique (surnageant) et une phase aqueuse. La phase organique, constituant l’huile essentielle, est récupérée après centrifugation à 4 000 tours/min pendant 5 minutes à l’aide d’une centrifugeuse SIGMA 302K, puis pesée. Le rendement d’extraction est calculé selon la formule : R PfPi 100
Avec :
– R = Rendement (%)
– Pf = Poids de l’huile essentielle obtenue (g)
– Pi = Poids de l’explant du départ (g)
Les caractères organoleptiques (aspect, couleur, goût, odeur et l’aspect au toucher) de l’huile essentielle obtenue sont déterminés.
EXTRACTION DES PRODUITS NON VOLATILS PAR DES SOLVANTS ORGANIQUES A POLARITE DESCENDANTE
Principe
La méthode utilisée est l’extraction en cascade à polarité descendante. Elle consiste à faire subir aux explants de plante différents traitements physiques (séchage, broyage, tamisage) et des traitements chimiques (utilisation successive des solvants organiques à différentes polarités). Les métabolites secondaires sont solubles dans les solvants organiques.
Mode opératoire
Suivant le schéma récapitulatif de la figure 8, les explants issus de tiges ou d’écorces de racines sont séchés à l’étuve à 40°C pendant 2 à 3 jours. Les explants secs sont ensuite découpés en petits morceaux puis broyés. Les broyats de tige ou d’écorce sont tamisés à travers un filtre de 355 µm de taille de maille pour obtenir une poudre fine.
Pour chaque plante, 10 g de poudre sont pesés puis mis dans un flacon contenant 100 ml d’hexane. Le mélange est ensuite passé à l’ultrason pendant 30 minutes et centrifugé à 3 000 tours/min. pendant 5 minutes au moyen d’une centrifugeuse HETTICH ROTANTA/R. Deux phases sont observées, une phase liquide (surnageant) et une phase solide (culot). Le surnageant est récupéré et séché à l’étuve à 40°C. L’extrait sec obtenu qui constitue l’extrait hexanique est pesé. Le culot est ensuite récupéré dans 100 ml d’acétate d’éthyle (AcOEt) puis passé à l’ultrason pendant 30 minutes et centrifugé à 3 000 tours/min. pendant 5 minutes à l’aide d’une centrifugeuse HETTICH ROTANTA/R. Le surnageant est récupéré et séché à l’étuve à 40°C. L’extrait sec obtenu constituant l’extrait à acétate d’éthyle est pesé.
Le culot de la dernière opération subit la même méthode d’extraction que pour l’obtention des extraits à acétate d’éthyle. Mais cette fois-ci le méthanol, l’éthanol et l’eau sont utilisés successivement. Les extraits secs obtenus constituant respectivement l’extrait méthanolique, éthanolique et aqueux sont pesés.
Les rendements d’extraction des différents extraits obtenus sont calculés pour chaque plante selon la formule : R PfPi 100
Avec :
– R = Rendement (%)
– Pf = Poids du résidu obtenu (g)
– Pi = Poids du matériel végétal à extraire du départ (g)
RESULTATS
HUILE ESSENTIELLE EXTRAITE PAR HYDRODISTILLATION
Parmi les trois matériels végétaux étudiés, seule la tige de Dicoma incana produit de l’huile essentielle au bout de 3 heures de distillation.
Caractères organoleptiques de l’huile essentielle de Dicoma incana
L’huile essentielle de la tige de Dicoma incana est un fluide limpide de couleur jaune pâle avec une odeur piquante et une saveur amère et piquante (Tableau 1).
Rendement de l’huile essentielle de Dicoma incana
Après deux extractions successives, le rendement d’extraction de l’huile essentielle de Dicoma incana obtenu est environ 0,16%.
PRODUITS NON VOLATILS EXTRAITS PAR DES SOLVANTS ORGANIQUES A POLARITE DESCENDANTE
Cinq extraits secs : extraits hexaniques, à acétate d’éthyle, méthanoliques, éthanoliques et aqueux de Dicoma incana, de Ficus trichopoda et de Tetrapterocarpon geayi sont obtenus après séchage à l’étuve 40°C.
Poids des extraits secs des trois plantes
A partir de 10 g de poudre, les poids des extraits secs obtenus pour Dicoma incana varient entre 0,04 g et 1,12 g, pour Ficus trichopoda entre 0,04 g et 0,22 g et pour Tetrapterocarpon geayi entre 0,15 g et 1,14 g (Tableau 2).
Rendements des extraits des trois plantes
Pour les extraits secs de Dicoma incana, les rendements d’extraction se situent de 0,4% et 11,2%; pour Ficus trichopoda de 0,4% et 2,2% et pour Tetrapterocarpon geayi, ils varient entre 1,5% et 11,4% (Tableau 3).
DISCUSSION
Deux types d’extractions ont été réalisées pour tirer les différents produits ou des métabolites secondaires dans chaque plante étudiée : par hydrodistillation et par des solvants organiques.
EXTRACTION DE L’HUILE ESSENTIELLE PAR HYDRODISTILLATION
Il a été signalé qu’après hydrodistillation des explants, seule la tige de Dicoma incana fournit de l’huile essentielle.
Dans la majorité des cas, ce sont les plantes aromatiques qui produisent des huiles essentielles car elles ont des cellules sécrétrices d’essence qui génèrent une odeur pénétrante [ROULIER, 1990]. De plus, parmi les 800 000 espèces de plantes existant sur la planète, un nombre relativement important synthétise des composants aromatiques dont la plupart sont des Astéracées [PENOEL, 1995].
Les explants de tige de Dicoma incana contiennent alors des cellules sécrétrices d’essence car cette plante est aromatique [HUMBERT, 1963]. De plus elle appartient à la Famille des Astéracées. Ce qui n’est pas le cas de Ficus trichopoda ni de Tetrapterocarpon geayi.
Lors de l’extraction par hydrodistillation, les cellules, sous l’effet de la chaleur et de la pression, éclatent en libérant tout leurs contenus. Les substances odorantes volatiles contenues dans les vacuoles sont entraînées par la vapeur d’eau. La condensation de ces substances donne l’huile essentielle avec ses différentes caractéristiques.
Le rendement d’extraction de l’huile essentielle de Dicoma incana est environ 0,168%. Ce rendement dépend de plusieurs facteurs tels que la technique d’extraction, le conditionnement du matériel végétal avant l’extraction, la période de récolte, le site de récolte, le stade de croissance de la plante [PENOEL, 2001 ; SATRANI, 2007].
EXTRACTION DES PRODUITS NON VOLATILS PAR DES SOLVANTS ORGANIQUES A POLARITE DESCENDANTE
A partir des explants de Dicoma, de Ficus et de Tetrapterocarpon, des extraits secs hexaniques, à acétate d’éthyle, méthanoliques, éthanoliques et aqueux de poids et de rendements variés sont obtenus.
Le mode d’extraction en cascade par des solvants organiques à polarité descendante permet d’obtenir la quasi-totalité des produits solubles [RAJAONARIVELO, 2006]. Il est fondé sur l’affinité des solutés à l’égard d’un solvant donné.
Aussi, les dérivés du pétrole comme l’hexane servent de solvant pour extraire les matières grasses et les terpènoïdes dans les cellules des plantes [HARBORNE, 1983 ; RABEMAHEFA, 1994]. L’acétate d’éthyle permet d’extraire la substance en solution aqueuse par transfert de celle-ci dans une phase organique non miscible et apolaire [MAHUZIER, 1986 ; KAMOUN, 1987]. Le méthanol et l’éthanol sont des solvants organiques peu polaires, miscibles dans l’eau qui permettent de solubiliser les composants polaires dans les plantes.
Les poids et les rendements des extraits obtenus diffèrent d’une plante à une autre. C’est le cas des extraits hexaniques et aqueux (Tableaux 2, 3). Ceci pourrait être due à la nature et à la quantité des composants se trouvant dans les explants de plante [HARBORNE, 1983].
De plus la solubilité des produits polaires avec les solvants polaires est élevée. Les cellules des explants des trois plantes étudiées synthétisent plus de métabolites secondaires polaires qu’apolaires.
CONCLUSION
Les extractions des produits révèlent la présence d’huile essentielle dans D. incana après hydrodistillation des explants et des produits non volatils à polarités différentes dans les trois plantes après extraction par des solvants organiques. Ces produits seront testés au cours de la recherche de l’activité antimicrobienne.
TESTS D’ACTIVITES ANTIMICROBIENNES
INTRODUCTION
Certains produits ou substances sont actifs sur des microorganismes pathogènes. Pour déceler l’activité antimicrobienne des métabolites secondaires, trois méthodes sont adoptées :
• Méthode de diffusion sur gélose
• Méthode de microdilution
• Méthode de chromatographie sur couche mince (CCM)-bioautographie directe
MATERIELS ET METHODES
MATERIELS
Les souches indicatrices déjà purifiées et identifiées ont été utilisées pour les tests. Il s’agit :
– des bactéries à Gram positif : Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus
– des bactéries à Gram négatif : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa
une levure : Candida albicans
Les produits obtenus à partir des extractions effectuées auparavant ont été testés pour déterminer leurs efficacités. Ce sont :
– l’huile essentielle de Dicoma incana
– les extraits hexanique, à acétate d’éthyle, méthanolique, éthanolique, aqueux des trois plantes
Les milieux de culture :
Les milieux de culture liquide ou les bouillons sont utilisés pour revivifier les microorganismes et pour achever les tests d’activités antimicrobiennes dans les puits des microplaques.
Les milieux solides ou milieux gélosés sont appliqués pour le rajeunissement des souches et pour réaliser les tests d’activités antimicrobiennes par la méthode de disque et par la méthode de CCM-bioautographie directe.
Tous les milieux de culture utilisés sont stérilisés à l’autoclave avant de servir dans les différents tests.
Le tableau 4 montre les différents milieux de culture. Leur composition est donnée en annexes (Annexes 4 ; 5)
METHODES
Toutes les manipulations se déroulent dans un environnement stérile, c’est-à-dire, sous une hotte à flux laminaire et à environ 15 à 20 cm de la flamme d’un bec Bunsen.
Pour chaque souche indicatrice, à partir d’une culture jeune de 24 heures, deux ou trois colonies isolées sont ensemencées respectivement dans 25 ml de milieu de culture liquide MHB ou MB, puis incubées pendant 24 heures sous agitation à 37°C pour les bactéries et à 25°C pour Candida.
A partir de cette culture microbienne, une suspension de 0,5 Mc Farland, correspondant environ à 108 ufc/ml de bactéries et environ à 107 ufc/ml de levures, est préparée. Des dilutions successives sont ensuite effectuées jusqu’à obtenir 106 ufc/ml. Cette préparation de suspension microbienne ou de l’inoculum sera utilisée dans chaque test d’activité antimicrobienne.
METHODE DE DIFFUSION SUR GELOSE
Principe
La méthode de diffusion sur gélose ou méthode de disques consiste à imbiber les disques par les produits à tester puis de les mettre en contact avec les microorganismes cultivés sur gélose. La diffusion de ces produits sur ce milieu peut inhiber ou non la croissance microbienne. La présence de zone claire autour du disque dite zone ou halo d’inhibition mesure la sensibilité du germe testé.
Mode opératoire
A partir des différents extraits secs non volatils, des solutions de concentration 40 mg/ml sont préparées. Puis la concentration des extraits ayant les zones d’inhibition les plus larges est réduite successivement à 30 mg/ml, 15 mg/ml et à 5 mg/ml pour déterminer leur efficacité sur chaque souche.
Pour l’huile essentielle, l’extrait brut est utilisé.
Tests d’activités antimicrobiennes
Pour chaque souche indicatrice, 1 ml de l’inoculum préparé précédemment est étalé en nappe sur le milieu de culture solide MHA et MA puis laissé sécher quelques minutes sous hotte à flux laminaire.
Des disques imbibés de 20 µl de solvant de récupération : hexane, acétate d’éthyle, méthanol, éthanol ou eau distillée et de 20 µl d’extrait des différentes plantes préalablement préparés sont déposés sur la culture en nappe. La concentration des extraits de chaque plante est fixée à 0,8 mg/disque. La concentration des extraits les plus actifs est ensuite réduite à 0,6 mg/disque, 0,3 mg/disque et à 0,1 mg/disque. Cette opération est réalisée en double pour chaque extrait. Les boites de culture sont incubées à 37°C pour les bactéries et à 25°C pour Candida albicans. Après 24 heures d’incubation, le diamètre de la zone d’inhibition est mesuré. Si les solvants témoins présentent des halos d’inhibition, les extraits secs apolaires ou moyennement polaires sont récupérés par le solvant de récupération DMSO.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
I. ETUDES BIBLIOGRAPHIQUES
I.1. Dicoma incana
I.2. Ficus trichopoda
I.3. Tetrapterocarpon geayi
II. EXTRACTIONS
II.1. Introduction
II.2. Matériels et méthodes
II.2.1. Matériels utilisés
II.2.2. Méthodes d’extraction
a. Extraction des huiles essentielles par hydrodistillation
b. Extraction des produits non volatils par des solvants organiques
II.3. Résultats
II.3.1. Huile essentielle extraite par hydrodistillation
a. Caractères organoleptiques de l’huile essentielle de Dicoma incana
b. Rendement de l’huile essentielle de Dicoma incana
II.3.2. Produits non volatils extraits par des solvants organiques à polarité descendante
a. Poids des extraits secs des trois plantes
b. Rendements des extraits des trois plantes
II.4. Discussion.
II.4.1. Extraction des huiles essentielles par hydrodistillation
II.4.2. Extraction des produits non volatils par des solvants organiques à polarité descendante
II.5. Conclusion
III. TESTS D’ACTIVITES ANTIMICROBIENNES
III.1. Introduction
III.2. Matériels et méthodes
III.2.1. Matériels
III.2.2. Méthodes
III.2.2.1. Méthode de diffusion sur gélose
III.2.2.2. Méthode de microdilution
III.2.2.3. Méthode de CCM-bioautographie directe
III.3. Résultats
III.3.1. Activités antimicrobiennes par la méthode de diffusion sur gélose
a. Activités antimicrobiennes des extraits de Dicoma incana
b. Activités antimicrobiennes des extraits de Ficus trichopoda
c. Activités antimicrobiennes des extraits de Tetrapterocarpon geayi
d. Etude de différentes concentrations des extraits hexaniques sur Candida albicans
III.3.2. Activités antimicrobiennes par la méthode de microdilution
a. CMI et CMB de l’huile essentielle de Dicoma incana sur Staphylococcus aureus
b. CMI et CMB des extraits hexaniques des trois plantes sur Candida albicans
III.3.3. Activités antimicrobiennes par la méthode de CCMbioautographie directe sur Candida albicans
III.4. Discussion.
III.4.1. Méthode de diffusion sur gélose
III.4.2. Méthode de microdilution
III.4.3. Méthode de CCM-biautographie directe sur Candida albicans
III.5. Conclusion
IV. RECHERCHE DE LA NATURE CHIMIQUE DES EXTRAITS ACTIFS
IV.1. Introduction
IV.2. Méthodes
IV.2.1. Chromatographie en phase gazeuse
IV.2.2. Chromatographie sur couche mince suivie de la coloration avec
les réactifs spécifiques
IV.3. Résultats
IV.3.1. Nature chimique de l’huile essentielle de Dicoma incana
IV.3.2. Famille chimique des extraits hexaniques des trois plantes
IV.3.3. Nature chimique des fractions actives dans les extraits hexaniques des trois plantes
IV.4. Discussion
IV.4.1. Recherche de la composition chimique des extraits actifs
IV.4.2. Relation entre l’utilisation traditionnelle de ces trois plantes et l’activité antimicrobienne de leurs métabolites secondaires
IV.5. Conclusion.
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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