ACTIVITES ANTIBACTERIENNES DES EXTRAITS BRUTS DE NONI OU Morinda citrifolia L

Classification des bactéries

                 Il existe diverses micro-organismes parmi ceci se trouve les bactéries qui sont les microorganismes unicellulaires et ubiquistes présents dans tous les milieux. Comment se fait sa classification dans le monde vivant ? En effet la phylogénie du monde vivant (classification à partir de la comparaison de séquences d’ARN ribosomique 16s ou 18s) admet 3 domaines : le Bacteria, l’Archaea et l’Eukarya qui est constitué par des cellules eucaryotes qui sont des cellules pourvues de véritable noyau, quand au domaine Bacteria et Archaea, ils contiennent des cellules procaryotes ou des cellules dépourvues de véritable noyau.

Notion de milieux de cultures

                     Dans notre étude qui est un test in-vitro, des cultures bactériennes ont été procédées, pour réussir ces cultures, il est question de tenir compte des conditions favorables de ces bactéries et de les réaliser autant que possible y compris le paramètre concernant la nourriture à la disposition dans le milieu.
Définition Un milieu de culture est une solution d’éléments nutritifs utilisée en laboratoire pour la croissance des micro-organismes en d’autre mot c’est une préparation au sein de laquelle des micro-organismes peuvent se multiplier.
Classification
 les milieux différentiels : dont lesquels un indicateur, généralement un colorant est ajouté pour mettre en évidence des réactions chimiques particulièrement spécifiques de la croissance d’un micro-organisme par exemple le cas du milieu Uriselect permettant de différencier les types de bactéries par la coloration, ce milieu est chromogène
 les milieux sélectifs : contiennent des composés chimiques ou antibiotiques qui inhibent de façon sélective des micro-organismes sans en affecter d’autre, le cas du milieu ANC qui contient les antibiotiques Acide nalidixique et Colistine pour inhiber les bactéries bacilles à gram négatif
 les milieux non-sélectifs : On regroupe sous cette dénomination tous les milieux ne contenant aucune molécule inhibitrice. Ils sont en général de préparation assez simple, ces milieux contiennent une base nutritive constituée de molécules azotées (acides aminés, facteurs de croissance diverses…) tel est le cas du milieu Mueller-Hinton qui est généralement employé lors des tests d’antibiogramme.
 les milieux non sélectifs mais enrichies : Ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des liquides ou suspensions riches en molécules organiques diverses : du sang, du sérum, du liquide d’ascite, de l’extrait globulaire, des suppléments polyvitaminiques… Les qualités nutritives peuvent être améliorées par dénaturation thermique des constituants, en particulier pour le sang. Ils permettent la pousse de nombreux germes exigeants ou très exigeants. Les plus utilisées sont les géloses au sang frais ou au sang cuit appelé la gélose chocolat. Néanmoins il existe des assemblages de ces types par exemple, un milieu à la fois sélectif et différentiel et de bien d’autre aussi.
Milieu solide et liquide Les milieux peuvent être sous forme liquide ou solide. On obtient les milieux solides en ajoutant un agent gélifiant. Le gélifiant le plus utilisé est l’agar-agar ou la gélose. Les micro-organismes se développent parfaitement tant en milieux liquides que solides mais l’intérêt de l’utilisation de ce dernier réside sur le fait que cela immobilise les bactéries pour former un amas de cellule appelé « colonie » dont l’aspect est variable pour les bactéries qui permet son identification à l’œil nu

L’observation après la coloration de Gram

                     La Coloration de Gram est une double coloration dont on utilise les deux colorants : le violet de Gentiane qui leur donne la couleur mauve, et la fuchsine de Ziehl la couleur rose. Le principe d’utilisation en est le fait que c’est une coloration différentielle, cette technique d’identification est basée sur l’affinité tinctoriale des bactéries vis-à-vis de la première coloration : celle avec le violet de Gentiane ainsi la bactérie qui ne peut fixer le violet de Gentiane sera décolorée par l’ajout d’un alcool et recoloré par la fuchsine de Ziehl, la deuxième coloration qui vient après. En effet il y en a qui ne peut fixer le violet de Gentiane, il est dît bactérie à Gram négatif, par contre ce qui le peut est dît bactérie à Gram positif. La différence de ces caractères est due à leur structure de leur paroi : les bactéries à Gram positif possèdent une membrane formée de peptidoglycane qui peut fixer facilement le violet de Gentiane et présente aussi la propriété d’alcool résistant ainsi ne peuvent être décoloré par l’alcool, contrairement au bactérie à Gram négatif qui ne peuvent d’un lieu fixer la coloration dû à la présence d’une membrane phospholipidique externe et d’un autre lieu cette structure est perméable à l’alcool, ces bactéries sont recolorées en rose par la fuchsine de Ziehl (VELOMALALA, 2008).

Le test d’agglutination avec de latex sensibilisée (latex test)

                     Le Staphylococcus aureus présentent une forte affinité pour le fibrinogène par la présence des enzymes appelées coagulase libre et liée, le coagulase liée est une récepteur de surface aux fibrinogènes. Le test Pastorex-Staph plus(le coffret du réactif) met en évidence la présence du coagulase liée seulement chez cette bactérie. En effet en présence du fibrinogène, la bactérie possédant de l’affinité pour le fibrinogène formera des agrégats visibles à l’œil nu.
Principe : Le réactif latex test contenu dans un flacon est un liquide qui est sensibilisé par une solution du fibrinogène, anticorps IgG et quelques autres constituants ; le réactif permet alors de rechercher le facteur d’affinité pour le fibrinogène, à part cela il est intéressant de mentionner aussi qu’à part le facteur d’affinité ci-dessous le test peut rechercher de façon simultanée la protéine A dû à la présence des IgG dans ce latex qui vont former aussi des agrégats. Notons que parmi le genre Staphylococcus, la protéine A n’est présente que chez les Staphylococcus aureus. Le test permet alors d’identifié les souches Staphylococcus aureus par la formation d’agglutination avec la réaction entre l’enzyme coagulase liée et le fibrinogène puis par la réaction anticorpsantigène de son protéine A avec l’IgG contenu dans le latex.

La détérmination du CMI et du CMB

                   Après le test de sensibilité, il nous est maintenant utile, comme tout agent antimicrobien, de connaître les caractéristiques de l’activité antibactériennes de la substance vis-à-vis des bactéries sensibles. Les questions alors se posent, l’inhibition des bactéries est-elle due à l’inhibition des croissances tout simplement ou conduisant à la mort des bactéries ? Les substances ont-elles alors des effets inhibiteurs de la croissance ou bactériostatique ou bien des effets létaux aux bactéries ou la bactéricide? Outre quelle est la concentration la plus faible induisant à ces effets ? Donc il est question de rechercher la concentration minimale inhibitrice ou CMI et la concentration minimale bactéricide ou CMB et évaluer l’effet antibactérien selon la norme d’interprétation suivant : soit la substance antibactérienne est bactéricide si la CMI et la CMB sont proches, et si le rapport CMB/CMI ≥32, la substance est bactériostatique (FRANÇOIS-DENIS et PLOY, 2007). On effectue la recherche de CMI et de CMB seulement pour les types d’extraits ayant été classées très sensibles soit égale ou supérieur à 15mm aux germes.

Test de sensibilité par la méthode de diffusion en milieu gélosé

                   Les extraits utilisés sont préalablement testés au point de vue stérilité, par un ensemencement sur le milieu enrichi PVX, ce test a démontré l’absence de colonie sur les milieux ensemencés après une incubation, ainsi les extraits ne contiennent aucun germe susceptible de croître sur un milieu, ils sont dîtes stériles. Cela justifie alors l’emploi de ces extraits dans le prochain test : le test de sensibilité vis à vis des souches. Après la préparation de l’inoculum, des ensemencements sur des géloses ont été effectué pour servir de contrôle de réussite de l’ensemencement ainsi que la mise en garde de la culture pour d’autre application en cas de culture non réussie. Les boîtes de contrôle effectivement ont tous montré une croissance bactérienne ainsi on peut déterminer que la culture a été faîte dans les conditions adéquates des souches et on peut dire que ces paramètres ne seront pas la cause de l’inhibition de la croissance des souches vu que les boîtes n’y ont pas été introduit de l’extrait. Le test de sensibilité de l’activité antibactérienne de l’extrait a été fait à partir de la méthode de diffusion en milieu gélosé. Ainsi les résultats sont évalués par rapport aux diamètres d’inhibitions de la croissance bactérienne :
-le contrôle négatif soit le disque imprégné du solvant utilisé, il n’y a pas d’inhibition autour du disque pour les 6 souches au niveau de chaque boîte, ainsi le solvant utilisé pour dissoudre les extraits n’exerce pas d’influence au niveau de la croissance bactérienne des 6 bactéries
-le contrôle positif soit le disque d’antibiotique de Gentamicine. Au niveau de chaque boîte, on constate que les 6 souches sont tous inhibées par l’antibiotique. On a relevé les inhibitions au niveau de chaque boîte et on établit la moyenne représenté par le tableau suivant pour chaque bactérie.

Table des matières

REMERCIEMENTS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
LISTE DES ANNEXES
LISTE DES ABREVIATIONS
GLOSSAIRE.
INTRODUCTION GENERALE
I. Synthèse bibliographique
I.1 Concept : Généralités sur les bactéries
I.1.1 Historique de la microbiologie
I.1.2 Classification des bactéries
I.1.3 Structure des bactéries
I.1.4 La culture in-vitro des bactéries
I.2 Concept : les antibiotiques
I.2.1 Définition
I.2.2 Quelques caractéristiques des antibiotiques
I.3 Concept : « potentiels médicaux des plantes supérieures »
I.4 Vertus thérapeutiques de la plante Morinda citrifolia
II. Matériels et méthodes
II.1 Matériels
II.1.1 Matériel végétal
II.1.2 Matériels et solvants d’extraction de la plante
II.1.3 Matériels pour les tests biologiques
II.2 Méthodes
II.2.1 Collecte et choix du matériel végétal
II.2.2 Extraction chimique
II.2.3 Test biologique
III. Résultats et discussions
III.1 Extraction chimique
III.1.1 Broyage
III.1.2 Macération
III.1.3 Séparation par polarité de l’extrait de feuille
III.1.4 L’évaporation à sec
III.1.5 Rendement d’extraction
III.2 Identification bactérienne
III.2.1 Résultat de la culture sur les milieux gélosés
III.2.2 Résultat de l’observation microscopique à l’état frais
III.2.3 Résultat de l’observation microscopique après la coloration de Gram
III.2.4 Identification individualisée
III.2.5 Test API 20E
III.2.6 Test APISTAPH
III.2.7 Test API20STREP
III.3 Mise en évidence de l’activité antibactérienne de l’extrait
III.3.1 Test de sensibilité par la méthode de diffusion en milieu gélosé
III.3.2 La détérmination du CMI
III.3.3 La détérmination du CMB
IV. INTERETS PEDAGOGIQUES
DISCUSSIONS
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
REFERENCES WEBOGRAPHIQUES
ANNEXES

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