Soutenance mémoire
EXTRACTION A L’ETHANOL ABSOLU A FROID
10 g de poudre sont délayés dans 100 ml d’éthanol absolu ( C2 H5OH ) selon un rapport 1/10 ( p/v ). Le mélange ainsi obtenu est soumis à une agitation magnétique pendant 3h, puis laissé macérer pendant une nuit au réfrigérateur à 4 °C. La suite de la manipulation est identique à celle de l’extraction aqueuse à froid. Le surnageant issu de la deuxième centrifugation constitue notre extrait brut.
CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
La chromatographie sur couche mince permet d’apprécier l’homogénéité d’un extrait ou des produits à analyser.[5,53,65]
• Définition : La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d’adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium. Après le dépôt de l’échantillon sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.
• Principe : Lorsque la plaque est placée dans la cuve, l’éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. Chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d’une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l’action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d’adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.
• Dépôt de l’échantillon : L’échantillon est déposé en un point de la plaque situé à 1,5 cm du bord inférieur et à 1,3 cm des bords latéraux, à l’aide d’un tube capillaire, en fins tirets horizontaux de 7mm de long, espacés de 6mm. Les dépôts sont séchés à l’aide d’un séchoir à main. Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible. Pour augmenter la quantité déposée, il est préférable d’effectuer plusieurs dépôts au même point, en séchant rapidement entre chaque application plutôt que de déposer en une seule fois un grand volume d’échantillon qui produirait une tache plus large.
• Développement de la plaque : La plaque est placée en position verticale dans une cuve à chromatographier DESAGA préalablement saturée par les vapeurs du solvant de migration. Ses parois internes sont tapissées de papier filtre imprégné de solvant. .Le solvant de migration qui a été utilisé est le Butanol /Acide acétique /Eau distillée: 60/20/20 (p/p). C’est une migration ascendante qui est arrêtée quand le front de migration du solvant arrive à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque. Cette dernière est retirée de la cuve, puis séchée au moyen d’un séchoir à main. Pendant le développement du chromatogramme, la cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée.
• Révélation : La révélation des chromatogrammes est assurée par deux méthodes: La première consiste en l’examen des spots en lumière ultra – violette sous une longueur d’onde égale à 254 et à 366 nm. Pour la deuxième méthode, il s’agit d’une pulvérisation sur la plaque du réactif à la vanilline sulfurique.
LES TANINS ET LES POLYPHENOLS
Les phénols sont des molécules élaborées par des végétaux et microorganismes. L’élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d’au moins un noyau benzénique auquel est lié au moins un groupe hydroxyle libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester, hétéroside. Les tanins sont des composés phénoliques hydrosolubles ayant une masse moléculaire compris entre 500 et 3000 qui présentent, à côté des réactions classiques des phénols, la propriété de précipiter les alcaloïdes, la gélatine et d’autres protéines.[9,10,14,58] Le résidu est dissous dans 2ml d’eau distillée. La solution ainsi obtenue est répartie en 4 parties égales dans 4 tubes à essai. Le premier tube est utilisé comme témoin, tandis que les 3 autres servent à détecter et à identifier les tanins et les composés polyphénoliques.
Etude des effets des extraits sur la croissance des bactéries
Les souches microbiennes sont conservées sous forme lyophilisée sous écouvillon à 4°C, il est donc nécessaire de réaliser leur relancement sur bouillon nutritif. Ensuite, elles sont repiquées sur gélose nutritive en boites, puis incubées à 37°C pendant 24h. La pureté de la culture est caractérisée par l’existence de colonies uniformes, présentant les mêmes caractéristiques. En effet, l’identification et l’étude des activités anti- bactériennes devraient toujours se faire sur une souche pure [38,39].
Ethode des disques sur milieu solide
Principe : La technique est la même que celle du spectre d’activité. Ainsi, la plus faible concentration d’extrait donnant un résultat positif ( entre 7 à 8 mm ) correspond à la CMI.
Mode opératoire : Une gamme de 6 concentrations par extrait à étudier est préparée selon une raison géométrique égale à 0,5. 6 disques préalablement autoclavés, puis imprégnés de 20 µl des extraits déjà préparés sont appliqués sur le milieu de MUELLER HINTON de 4 mm d’épaisseur, uniformément ensemencé avec 10 ml du germe à une concentration égale à 10 3 cellules par ml. Lors de ce test, la boite ne peut contenir que 6 disques. La CMI est déterminée après incubation à 37°C pendant 24 h.
DISCUSSION ET CONCLUSION
Les résultats des études des caractères morphologiques, culturaux, physiologiques et surtout biochimiques confirment l’identité des germes étudiés. Les extraits bruts Pa et PL sont des extraits dits à large spectre, car ils sont performants sur un certain nombre d’espèces : Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, , Shigella boydii et Alkalescens dispar. Par comparaison, Pa possède un spectre plus large que PL car en plus de son activité vis à vis des germes citées ci-dessus, il est actif sur Escherichia coli, Serratia marcescens, Neisseria gonorhoeae, ainsi que sur Bacillus cereus. Néanmoins, une très grande activité est fortement remarquée pour PL vis-à-vis de Shigella boydii, donnant un halo d’inhibition d’un diamètre de 20 mm. Cela pourrait expliquer son utilisation pour traiter la diarrhée Les deux extraits Pa et PL, ainsi que leurs fractions partiellement purifiées n’ont aucune activité sur Candida albicans. De ce fait, ils ne possèdent pas d’activité antifongique. Vis à vis d’ Escherichia coli, F1 est plus performante que l’extrait purifié d’écorce de tige de Uapaca thouarsii (EUPHORBIACEAE) [54] Effectivement, à titre d’exemple, leurs CMI pour E. coli sont respectivement de 1,9µg/µl et de 13,1µg/µl. Par rapport à la fraction acétate-éthylique des extraits de l’espèce codée THL du genre Ageratum (ASTERACEAE) [64], la fraction F2 est moins performante car leurs CMI pour Shigella boydii sont respectivement de 0,5 µg/µl et de 0,4 µg/µl La fraction F1 à une activité bactériostatique car à une concentration de 1,9 µg/µl, elle inhibe la croissance de Escherichia coli et de Pseudomonas aeruginosa, par contre elle ne possède pas d’activité bactéricide à cette concentration. La fraction F2 possède également une activité bactériostatique testée sur Staphylococcus aureus et Shigella boydii. Leurs CMI respectives sont de 2,1 µg/µl et de 0,5 µg/µl. Pourtant, la fraction n’est pas bactericide Concernant le test sur les larves de moustiques, les résultats montrent que les extraits de tiges de Mundulea sericea [33] et l’extrait brut de l’éspèce codée THL du genre Ageratum [64] sont beaucoup plus performants que les fractions partiellement purifiées car en effet les deux fractions F1 et F2 ne présentent pas d’activité, même utilisée à l’état pure.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE: GENERALITES
I-LES ASTERACEAE
I-1- CARACTERES GENERAUX
I- 2- LES ASTERACEAE DE MADAGASCAR
I-3- LE GENRE Psiadia
I-3-1-Position systématique
I-3-2- Utilisation
DEUXIEME PARTIE: ETUDE CHIMIQUE
I-INTRODUCTION
II- MATERIELS ET METHODES
II- 1- MATERIELS
II- 1-1- Le matériel végétal
A -DESCRIPTION BOTANIQUE
B -DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE
C – LIEU DE RECOLTE
D – ORGANES UTILISES ET LEURS PREPARATIONS
II-1-2- Les produits chimiques
II- 2- METHODES
II-2-1 Méthodes d’extraction
A -EXTRACTION A FROID
A-1- EXTRACTION AQUEUSE A FROID
A-2-EXTRACTION HYDROALCOOLIQUE A FROID
A-3- EXTRACTION A L’ETHANOL ABSOLU A FROID
B -EXTRACTION A CHAUD
B-1- EXTRACTION AQUEUSE A CHAUD
B-2- EXTRACTION HYDROALCOOLIQUE A CHAUD
II-2-2 Méthode de concentration
II-2-3 Méthodes analytiques
A -CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
B- DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES DE L’EXTRAIT (Criblage phytochimique)
B-1- LES ALCALOIDES
B-2- LES FLAVONOIDES ET LES LEUCOANTHOCYANES
B-3- LES TANINS ET LES POLYPHENOLS
B-4-LES QUINONES
B-5- LES ANTHRAQUINONES : test de BORNTRÄGER
B-6- LES SAPONINES : Indice de mousse
B-7- LES STEROIDES, TRITERPENES, ET STEROLS INSATURES
B-8-LES DESOXYOSES : test de KELLER -KILLIANI
B-9- LES IRIDOIDES
II-2-4 Méthodes de purification
II-2-4-1 Méthodes de purification pour Psiadia altissima
a) Filtration sur charbon actif
b) Ultrafiltration sur millipore
c) Traitement par de l’éther éthylique
II-2-4-2 Méthodes de purification pour Psiadia lucida
a) Filtration sur charbon actif
b) Traitement par l’éther de pétrole
c) Fractionnement par le n-butanol
III-RESULTATS
III-1- EXTRACTION
III-2- PURIFICATION
III-3- ETUDES ANALYTIQUES
III-3-1- Chromatographie sur couche mince
III-3-2- Criblage phytochimique
IV -DISCUSSION et CONCLUSION
TROISIEME PARTIE: ETUDE BIOLOGIQUE
I- INTRODUCTION
II- MATERIELS ET METHODES
II- 1- MATERIELS
II-1-1- Larves de Moustique
II-1-2- Les Microorganismes
II-1-3- Les matériels pour l’étude microbiologique
A-LES MILIEUX DE CULTURE
A-1- MILIEUX SELECTIFS
A-2- MILIEUX ELECTIFS
B -LES DISQUES POUR ANTIBIOGRAMME
C-LA STERILISATION
II-2- METHODES
II-2-1- Etude des effets des extraits sur la croissance des bactéries
A – ETUDE DES CARACTERES MORPHOLOGIQUES ET CULTURAUX
A-1- EXAMEN MACROSCOPIQUE
A-2- EXAMEN MICROSCOPIQUE
B- ETUDE DES CARACTERES PHYSIOLOGIQUES
B-1- DETERMINATION DU TYPE RESPIRATOIRE
Recherche de L’OXYDASE
Recherche de la CATALASE
C- ETUDE DES CARACTERES BIOCHIMIQUES
D- ETUDE DES GERMES SUR MILIEUX SELECTIFS
D-1- MILIEU EMB
D-2- MILIEU DE BAIRD PARKER
D-3- MILIEU SS-AGAR
D-4- MILIEU HEKTOEN
D-5- MILIEU KING A ET KING B
D-6- MILIEU SABOURAUD
D-7- MILIEU Chapmann
E- SPECTRE D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES EXTRAITS
E-1- LE TEST D’ANTIBIOGRAMME
E-2- DETERMINATION DE LA CMI ET DE LA CMB
II-2-2- Etude des effets des extraits sur les larves de moustiques
A- CAPTURE DES LARVES DE MOUSTIQUES
B-TEST SUR LES LARVES
III-RESULTATS
III-1- ETUDES MICROBIOLOGIQUES
III-1-1-Caractères morphologiques et culturaux
III-1-2-Caracteres physiologiques
III-1-3-Caractères biochimiques
III-1-4- Caractères culturaux sur milieux sélectifs
III-1-5-Effets des extraits sur la croissance des microorganismes
A- TESTS D’ANTIBIOGRAMME
B- DETERMINATION DE LA CMI ET DE LA CMB
B-1-DETERMINATION DE LA CMI
B-2-DETERMINATION DE LA CMB
III-2-EFFETS DES EXTRAITS SUR LES LARVES DE MOUSTIQUES
IV- DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ANNEXES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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