Soutenance mémoire
Activité électrique cardiaque
L’activité contractile cardiaque est intrinsèquement liée à l’activité électrique des myocytes cardiaques. Ils agissent comme des condensateurs électriques en accumulant des ions de part et d’autre de la membrane et vont pouvoir les restituer sous forme de courants par l’ouverture de pores au sein de la membrane appelés canaux ioniques. Ces derniers fonctionnent de manière coordonnée afin de générer une succession d’influx électriques donnant naissance à un potentiel d’action (PA), qui va s’étendre le long de chaque myocyte puis le long des différentes régions du cœur (Nerbonne et Kass, 2005).
Dans le cœur humain, l’influx électrique initiateur de la contraction prend sa source dans le nœud sinusal localisé dans l’oreillette droite (Figure 1). Une fois un PA sinusal généré, celui-ci s’étend sur toute la surface des oreillettes (onde P sur l’électrocardiogramme, ECG), provoquant leur contraction, jusqu’à atteindre la jonction séparant oreillettes et ventricules, au niveau d’un relai électrique appelé nœud auriculo-ventriculaire. De cette base, l’influx continue de circuler par les faisceaux de His et le réseau de Purkinje pour atteindre les deux ventricules (complexe d’ondes QRS sur l’ECG) et permettre leur contraction. Enfin, suite à l’excitation engendrée par le PA, les ventricules se repolarisent permettant de ce fait leur relaxation (onde T sur l’ECG).
La forme et la durée des PA diffèrent en fonction des régions du cœur, en raison de l’hétérogénéité de l’expression et des propriétés biophysiques, comme l’activation et l’inactivation, des différents types de canaux ioniques (Figure 2). Une entrée dans la cellule d’ions sodium (Na+) ou d’ions calcium (Ca2+) va générer un courant entrant qui se caractérise par une dépolarisation membranaire. Au contraire, la sortie d’ions potassium (K+) va engendrer une repolarisation membranaire. Le potentiel d’action ventriculaire est composé de 5 phases bien distinctes. La phase de dépolarisation rapide (Phase 0) est générée par l’ouverture des canaux sodiques dépendants du potentiel (NaV), générant un courant sodique transitoire (INa) qui dépolarise la membrane à un potentiel de l’ordre de +40 mV. Cette dépolarisation est suivie par une phase de dépolarisation rapide transitoire (Phase 1) caractérisée par la fermeture de la majorité des canaux sodiques, et l’ouverture partielle des canaux potassiques (Ito). Survient ensuite la phase de plateau (Phase 2) dont l’équilibre entre les courants sodiques persistants (INaL), calcique de type L (ICa,L) entrants et K+ (IKr et IKs) sortants permettent un équilibre électrique qui maintient le PA sur la durée. La phase plateau se termine par la fermeture de l’ensemble des canaux Na+ et Ca2+ et l’ouverture des canaux potassiques qui assurent une repolarisation membranaire (Phase 3). Pour finir, les myocytes restent hyperpolarisés à un potentiel de repos proche des -80 mV (Phase 4) du fait d’une perméabilité supérieure de la membrane aux ions K+ (IK1). Dans une moindre mesure, le courant de sortie de la pompe Na/K ATPase participe au maintien du potentiel de membrane lors de la phase 4.
Le moindre changement d’expression et/ou d’activité d’un canal ionique peut modifier la forme et la durée du potentiel d’action cardiaque et avoir pour conséquence le développement de pathologies telles que des arythmies cardiaques ou des syndromes de mort subite (Remme et Bezinna, 2010). Le courant INa est fréquemment impliqué dans des syndromes de Brugada (BrS) (Priori et al., 2002) il est donc intéressant de comprendre le fonctionnement et les mécanismes de régulation de ces courants.
Les courants ioniques
La valeur du potentiel membranaire dépend à chaque instant du rapport de force qui existe entre la somme des courants dépolarisants et repolarisants. Les courants ioniques cellulaires sont générés par le passage d’ions de part et d’autre de la membrane plasmique d’une cellule, par l’ouverture et la fermeture des canaux ioniques, et sont rendus possibles chaque fois que le potentiel de membrane est éloigné du potentiel d’équilibre d’un ion donné. Ce décalage s’appelle le gradient électrochimique.
Les canaux NaV
Le passage des ions de part et d’autre de la membrane se fait par des protéines appelées canaux ioniques. Ces dernières sont des pores hydrophiles qui traversent la membrane lipidique permettant le passage des ions. Dans le cœur, les variations de potentiel de membrane sont à l’origine de l’ouverture des canaux ioniques. C’est pourquoi ils sont désignés comme des canaux ioniques dépendants du potentiel en opposition aux canaux ioniques dépendants, de la tension mécanique, du pH ou d’un ligand. Les canaux NaV sont à l’origine de la capacité des cellules excitables à percevoir et à réagir rapidement à une modification de leur environnement électrochimique. La transmission synaptique neuromusculaire, les contractions musculaires squelettiques et cardiaques sont parmi les nombreux mécanismes dépendants du bon fonctionnement de ces canaux. Il existe 10 gènes codants pour les canaux NaV (Yu et Catterall, 2003) portés par quatre chromosomes différents (Chr2, 3, 15, 11) (Figure 3). Parmi ces canaux, neuf d’entre eux sont exprimés dans le cœur humain (Zimmer et al., 2014). Cependant, dans les cardiomyocytes des mammifères, le canal NaV1.5 est l’isoforme majoritaire et est responsable de 80 à 90% de la densité de courant INa (Haufe et al., 2005). Les canaux NaV1.1, NaV1.2 et NaV1.3 sont davantage exprimés dans le système nerveux central alors que NaV1.7, NaV1.8 et NaV1.9 le sont dans le système nerveux périphérique. Quant à NaV1.6, il est exprimé à la fois dans le système nerveux central et dans le système nerveux périphérique. Concernant NaV1.4, il s’agit de l’isoforme majoritaire présente dans les muscles striés squelettiques. L’expression de ces canaux n’est pas exclusive à un tissu, par exemple NaV1.4 est la troisième isoforme de NaV retrouvé au niveau cardiaque chez l’homme (Zimmer et al., 2014). Actuellement, près de soixante-dix mutations héréditaires différentes de SCN4A codant pour NaV1.4 ont été mises en évidence chez l’homme, et bien que le rôle de NaV1.4 dans le cœur ne soit pas encore clairement établi, certains individus, atteints de dystrophie musculaire, présentent des défauts cardiaques tels qu’une repolarisation ventriculaire prolongée (Péréon et al., 2003). NaX aussi appelé NaV2.1 est à classer à part, car il s’agit d’un canal sodique qui n’est pas dépendant du potentiel et dont la structure est la plus atypique par rapport à l’ensemble des canaux NaV (Zimmer et al., 2014). Une des caractéristiques fonctionnelles qui diverge entre les différentes isoformes de NaV est leur sensibilité à la tétrodotoxine (TTX) (Figure 3). Deux groupes se distinguent, les canaux TTX sensibles (NaV1.1, NaV1.2, NaV1.3, NaV1.4, NaV1.6, NaV1.7 et NaX) et les canaux TTX résistants (NaV1.5, NaV1.8 et NaV1.9) (Wang et al., 2017). La différence structurelle du pore des canaux TTX sensibles (possédant un résidu aromatique facilitant la liaison à la TTX) et des canaux TTX résistants (possédant un résidu non aromatique ne pouvant pas lier la TTX) fait que cette toxine est un outil privilégié dans la distinction des isoformes de NaV. Cette toxine a permis d’étudier les éléments structurels critiques dans le pore des NaV et de différencier les courants INa des courants IK et ICa (Zimmer et al., 2014).
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Table des matières
Introduction
I. Activité électrique cardiaque
II. Les courants ioniques
III. Les canaux NaV
IV. Les canaux NaV1.5 cardiaques
1. Structure
2. Localisation tissulaire
3. Activité canalaire
4. Courant sodique persistant
V. Régulation du canal NaV1.5 cardiaques par les protéines partenaires
1. Complexes protéiques NaV1.5 cardiaques
2. Régulation du canal NaV1.5 par les FHFs
VI. Régulation du canal NaV1.5 par la phosphorylation
1. Généralités
2. Régulation du canal NaV1.5 par la PKA
3. Régulation du canal NaV1.5 par la PKC
4. Régulation du canal NaV1.5 par la CaMKII
5. Régulation du canal NaV1.5 par la kinase dépendante de l’adénosine monophosphate (AMPK)
6. Régulation du canal NaV1.5 par les Fyn kinases
7. Régulation du canal NaV1.5 par la voie des kinases PI3K/PDK1/Akt/SGK
8. Sites de phosphorylation encore non reliés à des kinases
Objectifs de la thèse
Matériels et méthodes
I. Plasmides et virus
II. Culture et transfection des cellules HEK-293
III. Isolement et culture primaire des cardiomyocytes ventriculaires de souris nouveaux nées
IV. Isolement et culture primaire des cardiomyocytes ventriculaires de souris adultes
V. Co-immunoprécipitation
VI. Extraction ARN et RT-qPCR
VII. Western Blot
VIII. Patch-clamp
IX. Analyses statistiques
Résultats
I. Identification des sites de phosphorylation natifs de FHF2 dans le ventricule gauche murin
II. Étude des effets de la phosphorylation du FHF2 sur l’activité des canaux NaV dans des cardiomyocytes ventriculaires de souris néonatales
1. Mise au point d’un modèle de knock-down et de réexpression de FHF2 dans des cardiomyocytes de souris néonatales
2. Étude des propriétés biophysiques des canaux NaV dans un modèle de knockdown et de réexpression de FHF2 dans des cardiomyocytes ventriculaires de souris néonatales
III. Étude des effets des sites de phosphorylation de FHF2 sur l’activité des canaux NaV dans des cardiomyocytes ventriculaires de souris adultes
1. Mise au point d’un modèle de knock-down et de réexpression de FHF2 dans des cardiomyocytes de souris adultes
2. Étude des propriétés biophysiques des canaux NaV dans un modèle de knockdown et de réexpression de FHF2 dans des cardiomyocytes ventriculaires de souris adultes
IV. Expression des variants des protéines FHF2 dans les modèles de cardiomyocytes ventriculaires de souris néonatales et adultes
V. Études des effets de la phosphorylation de FHF2 sur les canaux NaV1.5 dans un modèle d’expression hétérologue HEK-293
VII. Étude des effets de la phosphorylation de NaV1.5 sur la régulation médiée par FHF2
VIII. Étude des effets de la phosphorylation de FHF2 sur les canaux NaV1.5 mutants pour le motif de liaison de la CaM
IX. Étude des effets de la phosphorylation du FHF1-B sur les canaux NaV1.5
Discussion
Conclusion
