Soutenance mémoire
Détermination du pouvoir réducteur du produit BPO 1227- Pa F1 vis-à-vis du fer
Ce test a été développé par BENZIE F. F. et STRAIN J. J. (1996) et adapté par SUDHA G. et ses collaborateurs (2011) en utilisant du ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 pour mesurer le pouvoir antioxydant d’un extrait en réduisant le fer ferrique (Fe3+) en fer ferreux (Fe2+) à pH acide (3,6). La solution développe une intense coloration bleue lorsque le fer ferrique (Fer 3+) est réduit. Ce test est basé sur la réaction chimique de réduction du Fer3+ présent dans le complexe K3Fe(CN)6 en Fer 2+ selon le mécanisme réactionnel suivant :
Fe3++ antioxydant ⇾ Fe2++ antioxydant oxydé (Jaune) (Bleue intense)
Fe2++ Fe(CN)6
3-⇾ Fe(Fe(CN)6)-
Une gamme de concentrations de BPO 1227-Pa F1: 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml et 0,3675 mg/ml a été préparée dans de l’eau distillée. Un volume de 1 ml de BPO 1227-Pa F1 à différentes concentrations a été mélangé avec 2,5 ml de solution tampon phosphate (0,2M; pH 6,6) et 2,5 ml de ferricyanure de potassium (K3Fe(CN)6) à 1%. L’ensemble a été ensuite incubé à 50°C pendant 30 minutes. Puis, 2,5 ml d’acide trichloracétique (TCA) à 10% ont été additionnés à ce mélange. Le mélange a été ensuite centrifugé à 3000 tours pendant 10 minutes. Et 2,5 ml du surnageant de chaque solution du produit ont été mélangés avec 2,5 ml d’eau distillée et 0,5 ml de solution aqueuse de chlorure ferrique (FeCl3) à 0,1%. La densité optique de la coloration bleue intense formée a été mesurée à la longueur d’onde de 700 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (PIERRON – MESURACOLOR ®), contre un blanc en remplaçant le produit par de l’eau distillée (SUDHA G. et coll., 2011; JAYANTHI P. et LALITHA P., 2011). Dans cette expérience, l’acide ascorbique a été utilisé comme antioxydant de référence (OKOKO T. et ERE D., 2012). L’augmentation de la densité optique du mélange réactionnel indique l’augmentation du pouvoir réducteur du produit.
Déroulement du test
Trois lapins albinos des deux sexes pesant entre 550 à 600 g ont été utilisés. Vingtquatre heures avant le test, les flancs de chaque animal ont été rasés: le flanc gauche a servi pour le test et le flanc droit comme témoin. La peau des flancs rasés a été scarifiée à l’aide d’une aiguille stérilisée, puis 500 mg de la crème contenant BPO 1227-Pa F1 à la concentration de 10% ont été appliqués sur une surface de 6 cm2 de peau. Après l’application de la crème, les flancs des animaux ont été recouverts d’une bande adhésive, pour empêcher les animaux de lécher la pommade. Les réactions cutanées comme l’apparition d’œdème et d’érythème liées à l’application de la substance testée ont été notées 1 heure après l’application, puis toutes les 24 heures jusqu’à la 72ème heure (OECD/OCDE 404, 2002) après avoir enlevé la bande adhésive.
Effet de BPO 1227-Pa F1 sur la prévention de la formation des rides induites par le rayonnement UV
Après 5 semaines d’expositions chroniques aux rayonnements UV, des rides sont apparues sur la peau dorsale des souris témoins exposés à l’UVB seul et le lot de souris traité avec l’excipient, avec respectivement des scores de plis de 5,83 ± 0,98 (NS) pour le lot témoin (Figure n°4 et Figure n°5) et, de 5,16 ± 0,4 (NS) pour le lot traité avec l’excipient. Ces rides sont persistantes. Comparée avec le lot témoin, une nette diminution de la formation des plis est remarquée sur le dos des souris du lot traité avec BPO 1227-Pa F1 (10%) avec un score de plis de 3,2 ± 0,31 (p < 0,05) et, sur le dos des souris du lot de référence traité avec la vitamine E (1%) avec 2,64 ± 0,31 (p < 0,01) de graduations. Ces résultats montrent que BPO 1227-Pa F1 est capable de prévenir la formation des rides induites par une irradiation chronique aux rayons UVB (Figure n°4).
Activité antiradicalaire de BPO 1227-Pa F1 déterminée par le test au DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil)
Après 30 minutes d’incubation à l’ombre, la coloration violette de la solution méthanolique de DPPH vire au jaune orange, indiquant que le radical est réduit en présence de BPO 1227-Pa F1 ou du produit de référence dans le milieu réactionnel. Les résultats obtenus montrent que la DO mesurée à 520 nm varie en fonction de la concentration de BPO 1227-Pa F1 ou de la vitamine C. Dans ce sens, la DO du DPPH° diminue au fur et à mesure que ce radical est réduit (p < 0,05), cela démontre l’activité antiradicalaire de BPO 1227-Pa F1 (Figure n°8). A la concentration de 0,25 mg/ml, la densité optique mesurée est de 1,079 ± 0,017. Cette DO diminue petit à petit en fonction de la concentration du produit dans le milieu réactionnel avec 0,804 ± 0,009 pour la concentration 0,5 mg/ml, pour la concentration de 1mg/ml la DO est 0,804 ± 0,009. Pour l’échantillon contenant 2 mg/ml de BPO 1227-Pa F1, la densité optique mesurée est égale à 0,481 ± 0,007. L’activité antiradicalaire de BPO 1227-Pa F1 vis-à-vis du radical DPPH est par contre significativement différent (p < 0,01) pour la concentration 4 mg/ml avec une DO de 0,256 ± 0,005.
DISCUSSION
Les rides sont les manifestations visibles du vieillissement. Prévenir le vieillissement précoce (extrinsèque) de la peau nous a incités à contribuer à l’étude de l’activité antivieillissement de BPO 1227-Pa F1. Les résultats obtenus montrent que l’application topique de BPO 1227-Pa F1 (10%) prévient la formation des rides sur le dos rasé des souris expérimentalement exposées aux rayonnements UVB. En effet, le produit protègerait la membrane des cellules du stratum cornéum de l’épiderme de la peau contre l’attaque des espèces réactives de l’oxygène (ERO) du rayonnement UV, en rompant la chaine de peroxydation lipidique à l’instar de la vitamine E qui est l’antioxydant de référence utilisé lors de cette étude. Ce qui a pour conséquence de limiter la formation de rides et de ridules au cours d’expositions chroniques aux rayons UV (JURKIEWICZ et coll., 1995). La présence de composés phénoliques (tanins, flavonoïdes…) et de triterpénoïdes dans sa composition, serait à l’origine de son activité antiride. Les tanins dotés de propriétés astringentes se trouvant en grande quantité dans BPO 1227-Pa F1 agiraient sur les brûlures occasionnées par les rayons UV et permettraient aux kératinocytes de proliférer (HERNANDES L., 2010). Les triterpénoïdes sont connus pour leur rôle dans la prolifération et l’augmentation de la production de collagène. Par exemple, dans le cas de Centella asiatica avec ses triterpénoïdes actifs tels que le Madécassoside et l’Asiaticoside. En application topique, le Madécassoside assure le maintien de l’hydratation de la peau (HAFTEK M. et coll., 2008). Tout comme les fleurs du Tagetes erecta qui possèdent une activité antiride en inhibant les enzymes hyaluronidases et élastases responsables de la dégradation de l’acide hyaluronique (maintien de l’eau) et de l’élastine (élasticité); en inhibant les matrices métallo protéinases (MMPs) stimulants de la production d’enzyme de dégradation (collagénase, gélatinase…) sur les peaux exposées aux rayons UV (BAUMANN L., 2007; MUKHERJEE K. P. et coll., 2011). Les recherches sur Curcuma longa ont aussi montré que grâce à la curcumine, il augmente l’élasticité de la peau, prévient la formation des rides et diminue l’hyperpigmentation de la peau photo-exposée (SUMIYOSHI M. et KIMURA Y., 2009). L’attaque des espèces réactives de l’oxygène (ERO) générées par l’exposition chronique aux rayonnements UV est connue pour être la cause partielle du vieillissement cutané. Elles provoquent des dommages au niveau des protéines et des cellules membranaires de la peau par un processus de peroxydation des acides gras constitutifs de la membrane de ces cellules (SVOBODOVA A. et coll., 2006). Nous avons utilisé l’inhibition de l’hémolyse pour expliquer le phénomène de peroxydation lipidique se passant au niveau des cellules cutanées. Les érythrocytes sont des modèles expérimentaux utilisés pour l’étude du stress oxydatif au niveau des biomembranes à cause de la présence en forte concentration d’acides gras polyinsaturés dans leur membrane et aussi par le transport d’oxygène associé à l’activité redox des molécules de l’hémoglobine qui sont des promoteurs potentiels des ERO (PANNANGPTECH P. et coll., 2007 ; OKOKO T. et ERE D., 2012). Dans notre étude, le peroxyde d’hydrogène (H2O2) utilisé comme initiateur de l’oxydation, réagit avec les radicaux superoxydes (°O2) issus de la réduction d’une partie de l’oxygène respiratoire et catalysés par les superoxydes dismutases (SOD). Ce qui donnent naissance à des radicaux hydroxyles (°OH) très réactifs et instables qui éliminent un atome d’hydrogène de la membrane des globules rouges entrainant l’oxydation des lipides membranaires, provoquant ainsi des déformations à l’origine de l’hémolyse (EBRAHIMZADEH et coll., 2010). D’après les travaux d’EBRAHIMZADEH et ses collaborateurs (2010) et d’OKOKO T.et ERE D. (2012), une substance ou un composé capable d’inhiber l’hémolyse possède une activité antioxydant vis-à-vis des radicaux libres. Cette activité serait due à la présence des composés phénoliques (Φ-OH) comme les tanins et les flavonoïdes. Ces composés sont capables de piéger et/ou de réduire les ERO en leur donnant un électron ou un atome d’hydrogène et ainsi éliminer les produits du métabolisme de l’oxygène respiratoire principaux origines des ERO (YOUNKIN et coll., 1971; SVOBODOVA A. et coll., 2003; MAJEWSKA M. et coll., 2011; MUKHERJEE K.P. et coll., 2011). Nos résultats montrent que l’ajout de BPO 1227-Pa F1 aux échantillons de GR, inhibe l’hémolyse induite par le peroxyde d’hydrogène. De plus, le criblage de BPO 1227-Pa F1 révèle la présence majoritaire de dérivés phénoliques. Partant de ces résultats, on peut émettre une hypothèse que l’activité antioxydant de BPO 1227-Pa F1 serait due à un ou plusieurs de ses composés phénoliques. Ils pourraient de ce fait, réduire les dommages qui accompagnent la peroxydation lipidique au niveau de la membrane des GR (OKOKO T. et ERE D., 2012). Il a été rapporté que la formation des ERO est assurée par des cations métalliques tels que le fer, essentiel pour le transport de l’oxygène, le métabolisme énergétique et la prolifération cellulaire. Il participe dans la réaction de Fenton pour catalyser la réduction de l’hydrogène peroxyde issue des superoxides, en radical hydroxyle (°OH) selon la réaction suivante: H2O2 + Fe2+ →°OH+-OH + Fe3+ (KITAZAWA M. et coll., 2006). D’après la littérature, des études histologiques effectuées sur les peaux de souris et sur les zones de la peau humaine habituellement exposées aux rayons UV montrent l’existence d’un dépôt d’ions métalliques au niveau du derme (BUETNER R.G. et JURKIEWICZ A.B., 1996; KITAZAWA M. et coll., 2006). Ce qui confirmerait le rôle du fer dans le stress oxydatif. Empêcher le fer de catalyser la formation des ERO permettrait de prévenir ce stress et de ce fait ralentir le vieillissement. Nos résultats montrent qu’en présence de BPO 1227-Pa F1, le fer ferrique (Fe3+) du complexe Fe3+-ferricyanide est réduit en fer ferreux Fe2+. Cette activité réductrice de BPO 1227-Pa F1 serait due à la présence de composés réductants tels que les flavonoïdes et les tanins dans sa composition chimique (EBRAHIMZADEH et coll., 2011). Les résultats des tests avec le radical DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazil) permet de montrer que BPO 1227-Pa F1 possède une activité antioxydant (JOO-SHIN K., 2003; MOLYNEUX P., 2004). Les résultats de nos tests montrent un changement de la coloration de la solution méthanolique de DPPH en présence de BPO 1227-Pa F1. On pourrait avancer une explication que ce sont les composés phénoliques dans le produit qui seraient à l’origine du virage de la coloration du DPPH. De ce fait, ils seraient capables de piéger et d’inactiver les radicaux libres, selon la réaction : DPPH° + Φ-OH → DPPH-H + ΦO° (BRANDWILLIAM W. et coll., 1995; POPOVICI C. et coll., 2009). Enfin, l’application topique de la crème contenant 10% de BPO 1227-Pa F1 sur la peau et son instillation dans le sac conjonctival de l’œil des lapins sont bien toléré, ce qui classe le produit de faiblement irritant pour la peau et les yeux
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Table des matières
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
A. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
B. TESTS BIOLOGIQUES
1. Formulation de la crème de base
a) Choix de la formulation
b) Préparation de la crème
2. Animaux d’expérience
3. Application de la crème
4. Détermination de la prévention de la formation des rides
5. Evaluation de l’activité de BPO 1227-Pa F1 dans l’inhibition de l’hémolyse
6. Détermination du pouvoir réducteur du produit BPO 1227-Pa F1 vis-à-vis du fer
7. Evaluation de l’activité anti radicalaire de BPO 1227-Pa F1 par le test au DPPH
8. Etude de la tolérance
a) Evaluation de l’irritation cutanée (Test de Draize)
9. Evaluation de l’irritation oculaire (Test de Draize)
a) Déroulement du test
b) Calcul de l’indice d’irritation oculaire
C. ANALYSES STATISTIQUES
III. RESULTATS
A. FAMILLES CHIMIQUES PRESENTES DANS BPO 1227-Pa F1
B. ACTIVITES BIOLOGIQUES
1. Effet de BPO 1227-Pa F1 sur la prévention de la formation des rides induites par le rayonnement UV
2. Effet de BPO 1227-Pa F1 sur l’inhibition de l’hémolyse des érythrocytes
3. Activité de BPO 1227-Pa-F1 sur la réduction du fer
4. Activité antiradicalaire de BPO 1227-Pa F1 déterminée par le test au DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazil)
C. TOLERANCES CUTANEE ET OCULAIRE
1. Tolérance cutanée
2. Tolérance oculaire
IV. DISCUSSION
V. CONCLUSION
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