Soutenance mémoire
Préparation de l’extrait
La partie aérienne de la plante a été récoltée au mois de janvier 2017 dans le fokontany d’Antsahabe, commune de Bongatsara. Après la récolte, le matériel végétal a été découpé en petits morceaux, puis séché dans un endroit aéré, à l’ombre et à la température ambiante pendant 20 jours. Une fois séché, le matériel a été broyé à l’aide un broyeur à marteau électrique (BROOK CROMPTON, Séries 2000) au Laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie, Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo. Ensuite, 200 g de la poudre obtenue ont été macérés dans un mélange éthanol- eau (60 : 40) à la température ambiante pendant 72 h. Pendant cette période, le mélange été agité pendant 10 minutes, une fois par jour. Le macérât a ensuite été filtré sur du coton hydrophile. Le filtrat recueilli a été évaporé à l’aide d’un distillateur (Figure 1) à la température de 80 °C, puis dans un bain marie à la température de 100 °C (Figure 2)
PARTIE PHARMACOLOGIQUE
L’activité de l’extrait TODY-023 a été étudiée sur l’hypertension expérimentale chez le rat. Afin de déterminer son mécanisme d’action, son effet sur la diurèse et sur les vaisseaux a été étudié (VANVLEIT B. N. et MONTANI J. P., 2008).
1. Animaux d’expérimentation : Des rats mâles de souche WISTAR, âgés de 5 à 6 semaines, pesant entre 200 et 250 g ont été utilisés. Ces rats ont été élevés à l’animalerie du Laboratoire de Pharmacologie Générale et de Pharmacocinétique et de Cosmétologie de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, avec une alternance de lumière et d’obscurité de 12/12 heures et à la température ambiante de 20°C environ. Ils ont été nourris avec de la provende LFL 1423, et ils ont eu accès libre à de l’eau.
2. Provocation de l’hypertension expérimentale : Les rats ont été rendus hypertendus expérimentalement avec un régime enrichi en sodium. Du NaCl a été ajouté dans la provende à raison de 8 grammes de Na Cl pour 100 g de provendes. Les animaux ont été nourris avec ce mélange pendant 21 jours, et ont eu de l’eau à volonté (BADYAL D. K. et coll., 2003). Le régime enrichi en Na+ a été arrêté lorsque la pression artérielle restait constante.
3. Mesure de la pression artérielle : Les pressions systoliques et diastoliques normales des animaux ont été mesurées tous les jours, à jeun, pendant 5 jours, à la même heure dans un endroit fixe et calme à l’aide d’un sphygmomanomètre. Le principe de cet appareil est le même que celui du tensiomètre de Vaquez. Les animaux ont été placés dans une cage de contention, le manchon du tensiomètre a été placé autour de la base de la queue de l’animal et leur PA été mesurée (Figure 3).
4. Étude de l’effet de l’extrait TODY-023 sur l’hypertension artérielle expérimentale : Les rats rendus hypertendus avec de la provende enrichie en NaCl ont été répartis en 3 lots dont 1 lot témoin ayant reçu de l’eau distillée à raison de 10 ml/kg, et 2 lots traités avec l’extrait TODY- 023 aux doses respectives de 200 et 400 mg/kg. La pression artérielle a été mesurée, une fois par jour, à jeun, à la même heure. Ensuite l’extrait a été d’administré par voie orale, dans un volume de 10 ml/kg (OGHENESUVWE D. L. et coll., 2014).
5. Étude de l’effet de l’extrait TODY-023 sur la diurèse : L’objectif de ce test a été d’étudier si l’activité antihypertenseur de l’extrait serait due à une action diurétique (KAU S. T. et coll., 1984). Ce test est basé sur la mesure du volume de l’urine émise par les animaux traités avec l’extrait ainsi que les taux de Na+ et de K+ urinaires (COLOT M., 1972). Des rats mâles de race WISTAR, âgés de 4 à 5 mois, pesant entre 200 et 250 g ont été utilisés. Ces animaux ont été mis à jeun pendant 18 heures avant la manipulation, puis chaque animal a reçu 50 ml/kg d’eau distillée par voie orale (SANOGO R. et coll., 2009). Par la suite ils ont été répartis en 3 lots dont 1 lot témoin et 2 lots traités avec l’extrait. Trente minutes après cette surcharge hydrique, les animaux du lot témoin ont reçu 10 ml/kg d’eau distillée, tandis que les deux autres lots ont reçu l’extrait TODY-023 administré par voie orale, aux doses respectives de 200 et 400 mg/kg. Ensuite ils ont été placés individuellement dans une cage à métabolisme en dessous de laquelle a été placé un récipient pour récolter l’urine émise pendant 24 heures (PATEL U. et coll., 2009) (Figure 4). Le volume d’urines récoltées pendant les 24 heures a été mesuré à l’aide d’une éprouvette graduée. L’effet diurétique de l’extrait a été évalué suivant le pourcentage d’excrétion urinaire selon la formule (KAU S. T. et coll., 1984). 𝐸𝑈𝑉 =𝑉𝐸 VA × 100 Avec :
VE : Volume urinaire (ml).
VA : Volume de surcharge hydrique (ml).
La valeur de l’excrétion urinaire volumétrique suivante a été utilisée pour vérifier l’activité diurétique de l’extrait:
EUV < 80 % : Activité antidiurétique
80 % < EUV˂ 100 % : Pas d’activité diurétique
100 % < EUV˂ 130 % : Activité diurétique faible
130 % < EUV ˂ 150 % : Activité diurétique moyenne
150 % < EUV : Forte activité diurétique
6. Étude l’effet de l’extrait TODY-023 sur l’élimination du sodium : Le but de cette manipulation a été d’étudier l’activité de l’extrait sur l’élimination de sodium dans les urines. Les rats ont été mis à jeun pendant 18 heures avant d’être utilisés. Ils ont été répartis en 3 lots dont 1 lot témoin et 2 lots traités avec l’extrait aux doses de 200 et 400 mg/kg. Les urines récoltées pendant 24 heures ont été analysées au L. P. G. P. C. à l’aide d’un spectrophotomètre à flamme afin de doser la natriurie (KHAN A. E. et Coll., 2014) (Figure 5).
7. Étude de l’activité vasculaire de l’extrait : L’objectif de ce test a été d’étudier l’activité de TODY-023 sur les vaisseaux, et l’aorte isolée du cochon d’Inde a été pris comme modèle. La phénylephrine a été utilisé comme agent contracturant.
a. Préparation et montage de l’organe : Les expériences ont été effectuées sur l’aorte isolée de cochon d’Inde des deux sexes, âgées de 4 à 5 mois, pesant en moyenne 250 et 300 g. L’animal a été anesthésié puis exsanguiné. Après une thoracotomie, l’aorte thoracique a été prélevée, puis placée directement dans une boîte de Pétri contenant une solution de Tyrode (Tableau II) aérée avec de l’air et maintenue à la température de 37°C. Elle a ensuite été nettoyée en enlevant les mésentères qui l’entourent, puis découpée en anneaux de 3 à 4 mm de longueur (KANE M. O. et coll., 2009). Puis l’organe a été placé dans une cuve à organe isolé, contenant 20 ml de solution de Tyrode maintenue à la température de 37°C et aérée avec de l’air, à l’aide d’un aérateur électrique. L’anneau a été monté dans une cuve à organe isolé en fixant une des extrémités au fond de la cuve, tandis que l’autre extrémité a été reliée à un transducteur isométrique avec une tension de base de 500 mg. L’organe a été laissé se stabiliser pendant 45 minutes. Pendant cette période, le bain a été renouvelé toutes les 15 minutes. Après ce temps d’équilibration, la viabilité de l’organe a été vérifiée en injectant de la phényléphrine à la concentration finale de 10-6 M dans le bain. Ensuite, la préparation a été rincée, puis laissée de nouveau se stabiliser pendant 30 minutes. Pendant ce temps, le bain a été renouvelé toutes les 15 minutes.
b. Étude de l’effet de l’extrait TODY-O23 sur l’aorte isolé : Pour étudier l’activité de l’extrait sur la contraction de l’aorte provoquée par la phényléphrine, cette dernière a été injectée dans le bain d’une manière cumulative afin de réaliser des concentrations croissantes, allant de 10-8 à 10-4 M dans le bain. Au plateau de contraction, l’extrait a été injecté dans le bain d’une manière cumulative (DEMICHEL P. et coll., 2008 ; FERNANDEZ I. J. et coll., 2013), avec une concentration partant de 0,18 mg/ml dans le bain jusqu’au relâchement total de l’aorte isolée. Les produits ont été injectés dans la cuve de telle sorte que la somme des volumes injectés ne dépasse pas 5% du volume du bain (CAVALCANTE F. A. et coll., 2012 ; DZEUFIEL T. D. P. D. et coll., 2013).
c. Étude du mécanisme d’action de l’extrait TODY-023 : Pour étudier le mécanisme d’action de l’extrait vis-à-vis de la phényléphrine, l’aorte a été préincubée dans un bain contenant différentes concentrations de l’extrait TODY-O23 avant de la contracter avec de la phényléphrine (ZAGUE H. W. W., 2009). Après la période d’équilibration, l’aorte a été incubée dans un bain contenant l’extrait TODY-O23 à la concentration de 0,18 mg/ml dans le bain pendant 10 minutes. Ensuite, la phényléphrine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative, pour réaliser des concentrations croissantes allant de 10-10 M jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. Après cette manipulation la préparation a été rincée, puis laissée de nouveau se stabiliser pendant 30 minutes. Pendant cette période, la solution de survie a été renouvelée toutes les 10 minutes. Après cette période, l’aorte a été incubée dans le bain en présence de l’extrait à la concentration de 0,36 mg/ml, pendant 10 min. Après cette période, la phényléphrine a été injectée dans le bain de façon cumulative afin d’obtenir des concentrations croissantes de 10-10 M jusqu’à la contraction maximale (LECHAT P., 2006). Les contractions ont été enregistrées avec un capteur isométrique de marque Statham Gould© piloté avec le logiciel SIGNAL MONITOR© développé par I.O.G.A (Institut et Observatoire de Géophysique d’Antananarivo), Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo (Figure 6). L’amplitude de ces contractions a été mesurée, puis rapportée en fonction de la contraction maximale provoquée par la phényléphrine seule, qui a été considérée comme contraction maximale, correspondant à 100 %. Ces valeurs ont été par la suite rapportées sur un papier échelle logarithmique en fonction de la concentration de la phényléphrine dans le bain. La CE50 de la phényléphrine et celle de l’extrait TODY-023 ont été déterminées graphiquement.
Activité vasculaire de l’extrait TODY-023
En injectant la phényléphrine dans le bain de manière cumulative, l’aorte isolée se contracte à partir de 10-10 M. A la concentration de 10-5 M dans le bain, la contraction est maximale (100%). En injectant l’extrait dans le bain, cette contraction maximale de l’aorte diminue à partir de la concentration de 0,18 mg/ml dans le bain et se relâche complètement à la concentration de 0,54 mg/ml. La CE50 de l’extrait TODY -023 est égale à 0,36 mg/ml (P < 0,05) (Figure 12).
Mécanisme d’action de l’extrait TODY-023 vis à vis de la phényléphrine
En absence de l’extrait, la contraction maximale provoquée par la phényléphrine est égale à 100 %, et sa CE50 est égale à 10-8 M. En pré-incubant l’aorte isolé dans un bain contenant l’extrait à différentes concentrations, l’amplitude de la contraction maximale de l’aorte, provoquée par la phényléphrine diminue et la CE50 de celle-ci augmente. En présence de l’extrait aux concentrations de 0,18, 0,36 et 0,54 mg/ml, la contraction maximale diminue respectivement à 72,7 ± 2,01, 50,30 ± 0,53 et 31,74 ± 2,75 % (P < 0,05). Par contre sa CE50 augmente respectivement à 4,5.10-8 M, 8.10-8 M et 4.10-7 M (P < 0,05) (Figure 13).
DISCUSSION
Le but de notre travail était d’étudier l’effet de l’extrait TODY-023 sur l’hypertension artérielle provoquée chez le rat et de comprendre son mécanisme d’action. Afin d’atteindre cet objectif, l’extrait hydro alcoolique de feuilles a été testé chez les rats rendus hypertendus expérimentalement en les soumettant à un régime hypersodé. Un apport en excès de l’ion Na+ provoque une hypertension artérielle (MARRERO N. M. et MACGREGOR G. A., 2008). Les résultats des tests montrent que l’extrait diminue la pression artérielle systolique et diastolique des rats. Cette diminution pourrait être due soit à son effet sur la diurèse, soit à son effet sur les vaisseaux (CLOUTIER L. et coll., 2013). En administrant l’extrait TODY-023 par voie orale, la diurèse émise en 24 heures et la natriurèse des rats hypertendus augmentent. L’effet diurétique provoque une diminution de la volémie ce qui a pour conséquence de diminuer de la pression artérielle. Par ailleurs, l’augmentation de la diurèse entraine une augmentation de la natriurie provoquant ainsi une diminution de la concentration extracellulaire en Na+ (SACK F. M. et coll., 2001). Ceci entraine une baisse de la réactivité vasculaire, qui entraine une baisse de la résistance périphérique. Combinée à la baisse de la volémie cela explique en partie la baisse progressive de la pression artérielle observée chez les animaux traités avec l’extrait. Un cas similaire a été rapporté avec un extrait de Hydrophila spinosa (ACANTHACEAE) qui possède un effet diurétique, et les familles chimiques responsables de cette activité sont des alcaloïdes ou des triterpènes (KUNDAN G. et coll., 2014). Comme l’extrait TODY-023 contient aussi ces composés chimiques, on peut avancer une hypothèse que ces familles chimiques pourraient être à l’origine de son activité natridiurétique, diminuant la pression artérielle des rats hypertendus. Par ailleurs les résultats des tests in vitro montrent que l’extrait TODY-023 relâche l’aorte contracté avec de la phényléphrine. Son effet maximal diminue, tandis que la CE50 augmente en présence de l’extrait TODY-023. Ces résultats montrent que c’est un vasodilatateur, et il antagonise la phényléphrine de manière non compétitive. Cela signifie que la molécule active de TODY-023 n’occupe pas les mêmes récepteurs que la phényléphrine (ADARAMOYEA O. A. et coll., 2009). Nous pouvons avancer une hypothèse que l’extrait stimulerait la libération du monoxyde d’azote (NO) qui est un vasodilatateur au niveau de l’endothélium (OPARIL S. et coll., 2003). Les résultats des études sur ce sujet montrent que les polyphénols agiraient sur le monoxyde d’azote synthétase pour augmenter la concentration en NO dans l’endothélium. Par exemple les polyphénols présents dans le vin rouge ou Vitis vinifera (VITACEAE) (GRIS E. H. et coll., 2013). Cette molécule est aussi présente dans l’extrait TODY-023, aussi pourrait-elle être à l’origine de cette vasodilatation. Une autre explication peut aussi être donnée pour cette vasodilatation, que l’extrait TODY-023 inhiberait les canaux calciques (ANNE-MARIE L. et coll., 2013), c’est comme le cas de l’extrait de Zingiber officinale (ZINGEBERACEAE), cet effet est attribué aux alcaloïdes (GHAYUR M. N. et GILIANI A. L., 2005). Comme TODY-023 contient aussi cette famille chimique, nous avançons que ces alcaloïdes seraient les responsables de l’activité vasodilatatrice de cet extrait. Etant donné que TODY-023 est encore un extrait brut, il contient plusieurs molécules bioactives. En vue de préciser son mécanisme d’action, il serait nécessaire d’isoler la molécule responsable de ces différentes activités.
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Table des matières
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations et des sigles
I. INTRODUCTION
II. MATÈRIELS ET MÉTHODES
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Préparation de l’extrait
2. Criblage phytochimique
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Animaux d’expérimentation
2. Provocation de l’hypertension expérimentale
3. Mesure de la pression artérielle
4. Étude de l’effet de TODY-023 sur l’hypertension artérielle expérimentale
5. Étude de l’activité de l’extrait TODY-023 sur la diurèse
6. Étude de l’activité de l’extrait TODY-023 sur l’excrétion de Na+
7. Étude de l’activité de l’extrait TODY-023 sur les vaisseaux
a. Préparation et montage de l’organe
b. Étude de l’effet de l’extrait TODY-023 sur l’aorte isolée
c. Étude du mécanisme d’action de l’extrait TODY-023
C. EXPRESSION ET ANALYSES DES RÉSULTATS
III. RÉSULTATS
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Rendement de l’extraction
2. Criblage phytochimique
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Effet du régime hypersodé sur la pression artérielle
2. Effet de l’extrait TODY-023 sur l’hypertension artérielle
3. Effet de l’extrait TODY-023 sur la diurèse
4. Effet de l’extrait TODY-023 sur la natriurie
5. Activité vasculaire de l’extrait TODY-023
6. Étude du mécanisme d’action de l’extrait TODY-023 vis-à-vis de la phénylephrine
IV. DISCUSSION
V. CONCLUSION
VI. BIBLIOGRAPHIE
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